复方太子参颗粒延缓失神经支配骨骼肌萎缩的实验研究

复方太子参颗粒延缓失神经支配骨骼肌萎缩的实验研究 目 录 中文摘要..................................................................1 英文摘要..................................................................3 正 文..................................................................6 前 言..................................................................6 材料与方法................................................................8 1.实验动物及饲养......................................................8 2.复方太子参颗粒加工工艺..........................................8 3.主要实验试剂........................................................9 4.主要实验仪器........................................................9 5.失神经支配骨骼肌动物模型的建立......................................9 6.实验动物分组.......................................................10 7.检测指标及检测方法.................................................10 8.统计分析方法.......................................................14 .....................................14 结果与分析.......................... 1.一般情况的变化.....................................................14 2.小腿腓肠肌湿重的变化...............................................14 3.肌肉总蛋白含量的变化...............................................15 4.肌纤维直径和横截面积的变化.........................................15 5.胶原纤维含量的变化.................................................17 6.失神经支配骨骼肌中肌动蛋白、肌球蛋白的达的变化....................17 7.骨骼肌细胞凋亡情况，及凋亡相关基因Fas、Bcl-2的表达..................18 8.失神经支配骨骼肌超微结构的变化.....................................20 讨 论.................................................................21 1.失神经支配骨骼肌萎缩模型的建立.....................................21 2.细胞凋亡的特征及其检测方法.........................................22 3.骨骼肌失神经支配后的变化及其检测...................................23 4.复方太子参颗粒组成中药的祖国医学认识及其现代研究...................27 5.复方太子参颗粒延缓失神经支配骨骼肌萎缩的机理.......................28 小 结.................................................................35 参考文献.................................................................37 复方太子参颗粒延缓失神经支配骨骼肌萎缩的实验研究 专 业: 中医骨伤科学 研究生: 汪宝军 导 师: 王和鸣 教授 吕厚山 教授 摘 要 目的 复方太子参颗粒系在著名中医骨伤科专家林如高先生“理气补血汤”的基础上加减化裁并经科学的生产工艺研制而成。本课题通过观察复方太子参颗粒对失神经支配骨骼肌萎缩的影响，初步探讨了复方太子参颗粒延缓失神经支配骨骼肌萎缩的，为复方太子参颗粒防治失神经支配骨骼肌萎缩，从而促进周围神经损伤后肌肉功能的恢复，提供客观的理论实验依据。 方法 用切断SD大鼠右侧胫神经的方法建立失神经支配骨骼肌萎缩的动物模型。将造模后的SD大鼠54只随机分为实验组和对照组，每组大鼠27只。两组依观察时间的不同，再随机分为2、4、6周三个时间组。实验组27只，每日每只大鼠以含复方太子参颗粒1g的生理盐水溶液3ml灌胃;对照组27只，每日每只大鼠以生理盐水3ml灌胃。于术后2、4、6周取大鼠腓肠肌进行各项指标的检测。用万分之一分析天平称量肌湿重;用双缩脲法测定肌肉蛋白质含量;用HE染色测定肌纤维直径和截面积;用天狼星红染色测定胶原纤维面积及胶原纤维与肌纤维的面积比;用末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的dUTP法(TUNEL法)染色检测萎缩骨骼肌的细胞凋亡;用免疫组织化学染色检测萎缩骨骼肌组织中肌动蛋白、肌球蛋白的表达及细胞凋亡相关基因Fas，Bcl-2的表达变化;用透射电镜观察失神经骨骼肌的超微结构变化。 、6周时检测发现:(1)大鼠腓肠肌明显萎缩，腓肠肌湿结果 失神经支配后2、4 重进行性下降，但实验组肌湿重下降较少，对照组肌湿重下降较多，实验组肌湿重显著大于对照组。(2)失神经支配后，骨骼肌总蛋白含量逐渐减少，对照组肌肉总蛋白含量较小，实验组较大，两组蛋白含量的比较有显著性差异。(3)大鼠萎缩骨骼肌的肌纤维直径、肌纤维截面积均下降，但实验组在术后2、4、6周时，肌纤维直径、肌纤维截面积均显著大于对照组。(4)萎缩骨骼肌中胶原纤维增多，以对照组萎缩骨骼肌中胶原纤维增加明显，而实验组胶原纤维增加较少。胶原纤维面积、胶原纤维面积与肌纤维面积的比值，实验组均显著少于对照组。(5)骨骼肌失神经支配后肌动蛋白、肌球蛋白的表 基金项目:福建省科技厅重点项目基金(99-Z139)、福建省科技三项费用基金(K20066) 1 达均减少。对照组肌动蛋白、肌球蛋白的表达下降明显，实验组下降较少。两组比较，实验组肌动蛋白、肌球蛋白的表达明显高于对照组。(6)正常骨骼肌TUNEL染色未见凋亡细胞。失神经支配骨骼肌中细胞凋亡现象明显，失神经时间越长，凋亡细胞越多。对照组萎缩骨骼肌中见大量凋亡细胞，而实验组凋亡细胞较少见，实验组凋亡细胞显著少于对照组。失神经支配后，萎缩骨骼肌细胞凋亡相关基因Fas的表达增高，Bcl-2的表达减少。实验组大鼠应用复方太子参颗粒后，萎缩骨骼肌细胞Fas基因蛋白的表达显著减少，显著少于对照组;凋亡相关基因Bcl-2的表达显著增强，显著高于对照组。(7)超微结构观察:失神经支配后萎缩骨骼肌的超微结构中未见到典型的凋亡小体，但可见到染色质聚集等细胞凋亡的早期形态学改变。失神经支配后，肌纤维萎缩，线粒体、肌质网、肌丝、肌节等细胞器退变，胶原纤维增生。实验组在术后2、4、6周时的超微结构形态改变均优于对照组。 结论 1.失神经支配后骨骼肌的萎缩与骨骼肌细胞凋亡有关，凋亡相关基因Fas的表达增加及Bcl-2的表达减少在骨骼肌细胞凋亡的发生机制中起着重要作用。 2.复方太子参颗粒可以延缓失神经支配骨骼肌的萎缩，它可能是通过以下几个途径实现的:(1)抑制失神经支配后骨骼肌萎缩时肌细胞的凋亡;(2)抑制失神经支配后骨骼肌萎缩时肌肉组织中胶原纤维的形成;(3)抑制失神经支配后骨骼肌萎缩时肌肉蛋白质的分解;(4)改善失神经支配萎缩骨骼肌的微循环。 3.周围神经损伤后，周围神经手术修复越早，术后功能恢复越好。 主题词:1.肌萎缩/中药疗法 2.太子参/药理学 3.复方(中药)/药理学 4.肌，骨骼/药物作用 药物作用 5.细胞凋亡/ 6.失神经支配 7.疾病模型，动物 8.大鼠 @ 复方太子参颗粒 2 Experimental Study of the Effects of Composite Pseudostellaria Granule on Denervated Muscular Atrophy Major: Orthopaedics and Traumatology of TCM Doctor: Wang Baojun Tutor: Prof. Wang Heming Prof. Lü Houshan ABSTRACT Purpose: To investigate the retarding mechanism of Composite Pseudostellaria Granule (CPG) on denervated skeletal muscular atrophy, and provide data for the practical use of CPG, by studying the effects of CPG on denervated muscular atrophy. Methods:The model of denervated skeletal musle was established by cutting off the right tibial nerve of Sprague Dawley rats.54 model Sprague Dawley rats were randomly divided into experimental group and control group, and administered respectively with CPG and normal saline every day after surgery. Samples were taken from the gastrocnemius and all the indexes were tested in 2、4、6 weeks of operative intervals respectively. The muscle wet weight was weighed by electron balance.The total protein content of atrophic muscle was measured by biuret reaction. The diameter and cross section area of muscle cell were measured with HE staining. The collagen fiber area, and collagen/muscle cell ratio of area were studied with Sirius Red staining. The apoptotic cells in denervated skeletal muscle were examined with TUNEL. The expressions of actin and myosin, apoptosis associated genes Fas and Bcl-2 were studied with immunohistochemical technique. The change of ultrastructure was oberserved with transmission electron microscope. Results: (1) After denervation, the gastrocnemius muscle of every rat was obviously atrophic. The musle wet weight rapidly reduced in the control group, while it reduced more slowly in the experimental group. The experimental group was significantly greater than the control group in the muscle wet weight.(2) The total protein content of atrophic skeletal muscle reduced progressively as denervation prolonged. The total protein content in the experimental group was significantly greater than that in the control group. (3) The diameter and cross section area of the muscle fibers decreased gradually in both groups after denervation, while the experimental group was remarkably larger than the control group in the two parameters.(4) The collagen fiber content increased in the denervated muscle after 3 operation. The proliferation of collagen in the control group was more obvious than that in the experimental group. The collagen fiber area , and collagen/muscle cell ratio of area were higher significantly in the control group than that in the experimental group. (5) The expressions of actin and myosin reduced in the denervated muscle along with the denervated time, while their expressions in the experimental group were greater than those in the control group. (6) Apoptotic nucleus was not seen in normal skeletal muscle, while it was obviously seen in the denervated skeletal muscle.With elongation of denervation time, the number of apoptotic nucleus increased. The number of apoptotic nucleus in the experimental group was remarkably less than that in the control group. The apoptosis associated gene Fas was expressed highly and Bcl-2 was expressed lowly in atrophic musle after denervation. The expression of Fas protein was significantly downregulated and the expression of Bcl-2 protein was significantly upregulated in the experimental group, compared to the control group. (7) No classic apoptotic body was seen in the denervated skeletal muscle, but morphologic changes of early stage in apoptotic cell could be seen under electron microscope, such as the aggregation of chromosome, the expansion of nucleic cistern and the contraction of nucleus. Compared to the control group, less degenerated nucleus, minor mitochondria edema and sarcoplasmic reticulum enlargement, more capillary , less interstitial fibroblast and collagen fibers, better oriented myomere and myofilament were seen in the experimental group with transmission electron microscope. Conclusions: 1. Apoptosis is closely related to denervated muscular atrophy. The increase of Fas gene expression and decrease of Bcl-2 gene expression play an important role in apoptosis of skeletal muscle cell. 2. CPG can effectively retard denervated skeletal muscular atrophy. The retarding mechanism may be as follows: (1) CPG can inhibit muscular cell apoptosis in denervated skeletal muscle. (2) CPG can inhibit collagen fiber formation in denervated skeletal muscle. (3) CPG can inhibit protein decomposition in denervated skeletal muscle. (4) CPG can improve the microcirculation in denervated skeletal muscle. 3. Nerve repair should be performed as early as possible after peripheral nerve injury in order to promote functional recovery. 4 MeSH Term: 1. muscular atrophy/tcd ther 2. pseudostellaria/pharmacol 3. composite(tcd)/pharmacol 4. muscle,skeletal/drug eff 5. apoptosis/drug eff 6. denervation 7. disease models,animal 8. rats @ Composite Pseudostellaria Granule 5 复方太子参颗粒延缓失神经支配骨骼肌萎缩的实验研究 专 业: 中医骨伤科学 研究生: 汪宝军 导 师: 王和鸣 教授 吕厚山 教授 前 言 周围神经损伤的修复一直是医学研究的热点和难点。20世纪60年代后随着精细的显微外科技术的应用，大大提高了周围神经损伤修复的水平。然而其临床疗效仍难以令 [1][2]人满意，肢体功能仍不能完全恢复，尤其是高位神经损伤。究其原因是周围神经损伤的实质是细胞损伤，是神经元的完整性受到了破坏，神经元胞体联系末梢的轴浆运输中断，从而导致了近端的神经元胞体和远端的效应器发生了不同程度的变性或死亡。因此周围神经损伤的修复涉及了相应神经元胞体的保护、轴突再生和效应器的功能保护等环节。其中任何一个环节延缓或发生了不可逆性损害均将影响肢体功能的康复，从而最终影响疗效。目前对周围神经损伤的研究主要着眼于上述三个环节，即保护神经元，提高神经再生速度和防治失神经支配骨骼肌萎缩。本课题从防治失神经支配骨骼肌萎缩方面进行了研究。 骨骼肌是周围神经系统的靶器官，它的发生、功能和结构的维持都受到运动神经的 [3]支配和调节，一旦失去神经支配，将丧失收缩功能，肌肉体积减少，肌纤维会逐渐萎 [4]缩，并逐渐被结缔组织所替代，肌细胞同时也发生一系列的改变。失神经支配骨骼肌的萎缩既是失营养性萎缩，又是废用性萎缩，只有重新获得再支配才是防止肌萎缩的最佳。由于神经再生的速度极为缓慢，周围神经损伤虽经修复，但轴突往往需要相当长的时间才能到达周围靶器官，某些失神经支配骨骼肌在神经再生轴突到达运动终板前 [2,5,6]已发生了不可逆的萎缩和变性，这必然造成神经修复手术的疗效欠佳。失神经支配后骨骼肌的不可逆肌萎缩是周围神经损伤后一个尚未解决的治疗难题。因此延缓失神经支配肌肉萎缩的速度和程度，是解决重获神经再支配后肌肉能否恢复有效功能的关键。 [7-12]有关失神经支配骨骼肌萎缩的报道较多，如肌细胞形态学改变、蛋白质代谢、肌酶活性、肌纤维的数量和类型、电生理等方面的报道。一块肌肉功能完整性的维持需要多种因素的影响，而任何一个因素都会影响失神经支配肌肉功能的恢复，而严重萎缩 [13][14]的肌肉对再支配的神经无反应是临床疗效欠佳的一个常见原因。Lester通过对腕部正中神经和尺神经修复后的肌电图随访发现，感觉恢复和神经再支配新生电位的出现率 6 远远高于临床手内在肌功能的恢复率。这提示周围神经修复后的效果明显受到骨骼肌这一靶器官情况的影响。 为了防治骨骼肌的失神经萎缩，防止在再生的神经轴突重新长到肌组织之前肌肉发 ，包括电刺激、被动运动、药物、周围神经提生不可逆的变性，许多学者做过很多尝试 [15-25]取液、感觉神经元植入等，尽管在实验研究中取得了不同程度的成功，但临床应用的疗效都是有限的。因此，探索骨骼肌失神经萎缩的机制吸引了国内外许多学者的兴趣，以期能找到逆转这种萎缩的关键步骤来延缓其萎缩。 细胞凋亡(Apoptosis)又称程序性细胞死亡，该词源于希腊文，原指秋天树叶凋落，在医学上系指基因调控的细胞主动性死亡过程。细胞凋亡和机体的胚胎发育、组织发生及组织分化等生理过程密切相关，特别是在胸腺及周围T淋巴细胞的分化选择、细胞毒T淋巴细胞介导靶细胞溶解等过程中发挥重要作用。细胞凋亡作为当今生命科学研究的热点，已渗透到生物学、基础医学、临床治疗和药物筛选等许多领域。探讨细胞凋亡相关基因及调控机制，可为进一步研究某些疑难病症，如AIDS，肿瘤、自身免疫病等发病机制提供理论依据及新的有效的治疗靶点。 随着凋亡一词被引入生物界后，它在各领域日渐受到重视。进入20世纪90年代后，国外学者检测到失神经支配的骨骼肌中存在细胞凋亡现象。研究发现失神经支配后其所支配的所有的骨骼肌均发生萎缩，但并非所有的肌细胞核都发生凋亡，只有极少数的肌纤维发生死亡。这是由于肌细胞是一个多核细胞，而以往的研究提示细胞凋亡往往只累 [26]及很少比例的细胞核,这些细胞核可能保持其细胞完整性，并可存活相当长一段时间和具备一定的功能。当越来越多的细胞核发生凋亡，且其比例逐渐上升并达到一定程度时，肌细胞就不能再维持其基本功能。随着细胞凋亡的持续，肌细胞核数量逐渐下降，这也是造成长期失神经支配骨骼肌功能恢复欠佳的一个主要原因。由于分子生物学的发展，国内外的学者对凋亡的研究越来越深入，并检测到凋亡相关基因在不同阶段的表达 [27]情况。Tews等提出如何在基因水平阻断肌细胞凋亡是治疗失神经支配骨骼肌萎缩的一个崭新的概念，应引起人们足够的重视。 基因治疗是一种有前途的治疗方法，但在神经再生和防治肌肉萎缩中的应用尚未取得实质性进展，主要原因一是由于对神经营养因子和周围神经再生机制尚缺乏完整的认识，一是基因治疗技术本身尚不成熟。 由上可见，已经有不少人从多个角度对失神经支配骨骼肌萎缩的机制开展了研究，得出了一些有益的结果，但尚不系统，有些结果还相互矛盾，无法深入揭示肌肉萎缩的机制。至于肌肉萎缩的有效防治方法，目前研究的还是很少，临床应用的疗效有限。中医药对失神经支配骨骼肌萎缩的防治的报道罕见。 祖国医学认为:周围神经和骨骼肌均属于筋肉的范畴。脾在体合肌肉、主四肢，脾 7 胃为气血生化之源，全身的肌肉均赖脾胃运化之水谷精微营养，才能使肌肉发达丰满，臻于健壮。肺的宣发功能失调，水谷精微失于输布，也会累及肌肉，致肌肉削瘦，软弱无力。肝藏血，主筋，肝藏血功能正常，筋肉方能得到濡养，发挥其生理功能。肝肾同源，筋附于骨，肾虚也常为筋伤疾患的内因。同样，筋伤也可内伤肝肾，致肝肾亏虚。筋的正常生理活动还赖气煦血濡，气血不足或气滞血瘀则筋肉失养。复方太子参颗粒具有益气健脾、行气活血、补益肝肾、接骨续筋之功，由太子参、川芎、当归、黄芪、白芍、续断、骨碎补、制首乌、炙甘草等药物组成。复方太子参颗粒系在著名中医骨伤科专家林如高先生“理气补血汤”的基础上加减化裁并经科学的生产工艺研制而成。以往 [28-30]的研究发现理气补血汤及其化裁加减而成的复方太子参颗粒有促进周围神经损伤后再生和促进周围神经功能恢复的作用，故现考察复方太子参颗粒对失神经支配骨骼肌萎缩的影响。 经查阅国内外相关文献，本课题具有以下创新点:(1)从细胞凋亡、凋亡相关基因的表达方面，考察中药复方对失神经支配骨骼肌萎缩的影响;(2)从骨骼肌组织胶原纤维含量、肌肉总蛋白含量方面考察中药复方对失神经支配骨骼肌萎缩的影响;(3)从肌动蛋白、肌球蛋白的表达方面考察中药复方对失神经支配肌萎缩的影响;(4)中医药对骨骼肌超微结构的影响。 预期通过本课题的研究，从细胞凋亡及凋亡相关基因蛋白的表达、肌肉特异蛋白、胶原纤维含量、超微结构等方面,考察出骨骼肌失神经支配后的变化,以及复方太子参颗粒对失神经支配骨骼肌萎缩的影响，探讨出骨骼肌失神经支配后肌萎缩与细胞凋亡的关系,初步阐明复方太子参颗粒延缓失神经支配骨骼肌萎缩的机制，从而为复方太子参颗粒治疗失神经支配骨骼肌萎缩提供理论和实验依据，为临床众多的周围神经损伤患者在神经吻合、神经移植、手术探查松解等之后神经恢复的较长过程中，在牵拉、嵌压造成的闭合性神经损伤观察阶段提供一种积极的、简单、经济、有效的治疗方案，从而促进周围神经损伤后受累肌肉的功能恢复，提高周围神经损伤的治疗效果，尤其在手内在肌的功能维持方面有着重大意义，将产生良好的经济效益和社会效益，应用前景广阔。 材料与方法 1.实验动物及饲养 清洁级SD大鼠54只，健康雌性，三月龄，体重200—250g，浙江省实验动物中心提供。在福建省中医药研究院实验动物中心饲养，采用笼养方式，每笼6只。 2.复方太子参颗粒加工工艺流程 所需中药材从福建省中药材公司一次性购入。于福建省中医药研究院中试车间一次性制成颗粒剂，颗粒剂每克含生药1.45g。 8 颗粒剂制作工艺流程:将中药清洗干净，加水超过药面约10cm，浸泡20min。然后煎煮二次，第一次煎煮60min，过滤，药渣加水，第二次煎煮30min, 过滤。两次滤液合并，浓缩，加淀粉，制粒，烧干，分装。 3.主要实验试剂 一般生化试剂由福建省医药采购供应站提供; 鼠抗骨骼肌肌球蛋白单克隆抗体(Monoclonal Mouse anti-Myosin (Skeletal Muscle))由北京中山生物技术有限公司提供; 鼠抗骨骼肌肌动蛋白单克隆抗体(Monoclonal Mouse anti-Actin (Skeletal Muscle))由NEOMARKERS公司提供; Fas兔多克隆抗体(Polyclonal Rabbit Anti-m,r Fas)由武汉博士德生物技术有限公司提供; Bcl-2兔多克隆抗体(Polyclonal Rabbit Anti-m,r Bcl-2)由武汉博士德生物技术有限公司提供; 细胞凋亡检测试剂盒(In Situ Cell Death Detection,POD)由北京中山生物技术有限公司提供; 链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶免疫组化染色超敏试剂盒(Ultrasensitive S-P Kit)由福州迈新生物技术开发公司提供; 即用型SABC免疫组化染色试剂盒由武汉博士德生物技术有限公司提供; DAB显色试剂盒由武汉博士德生物技术有限公司提供; 天狼星红由福建医科大学病理系提供，美国产; 蛋白定量(双缩脲法)试剂盒由南京建成生化有限公司提供; 蛋白酶K由福州迈新生物技术开发公司提供; 粘片剂多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine)由福州迈新生物技术开发公司提供。 4.主要实验仪器 SLEE-CUT-4060型 德国产; 切片机 电子天平 FA-2004型 上海产; 酸度计 pHS-25型 上海产; 全自动真彩色图像分析系统 Leica Q 550IW PMLB型 德国产; 透射电子显微镜 Hu-12A型 日本产; 显微照相机 Olympus PM-10-35AP-1型 日本产; 紫外可见分光光度计 Du640 型 美国产。 [31]5.失神经支配骨骼肌动物模型的建立 动物购入适应性饲养1周后，用2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(40mg/kg体重)。右 9 侧臀区，股后区剪毛，消毒。无菌条件下，作右侧股后偏外侧皮肤切口，纵行钝性分离并牵开股二头肌内外侧头后，显露坐骨神经下段胫神经和腓肠神经的起始处。解剖出胫神经上段后切断胫神经干，将胫神经近断端翻转180?后用8-0线固定于股二头肌，远断端翻转180?后用同样方法固定于腓肠肌。两断端之间的距离为1.5cm左右，防止神经断端间的自然生长。术后缝合伤口,每只大鼠术后注射青霉素8万单位。 6.实验动物分组 SD大鼠54只，全部行右下肢手术，造成失神经支配骨骼肌动物模型。随机分为实验组和对照组，每组大鼠27只。两组依观察时间的不同，再随机分为2、4、6周三个时间组。分别于术后2、4、6周作各项检测指标的检测。 6.1实验组:27只，每日每只大鼠以含复方太子参颗粒1g的生理盐水溶液3ml灌胃。 6.2对照组:27只，每日每只大鼠以生理盐水3ml灌胃。 7.检测指标及检测方法 7.1 一般情况: 观察两组大鼠在实验过程中的一般情况的变化，如伤口愈合、步态及患肢足部溃疡情况等。 7.2小腿腓肠肌湿重:大鼠用2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，将两侧小腿腓肠肌自 [32]股骨内外侧髁起点至跟骨结节止点处切断，完整取下两侧小腿腓肠肌，在万分之一分析天平上迅速称重，患侧与健侧比较，求其湿重的恢复率。 7.3肌肉总蛋白含量的变化:大鼠肌肉称重后用双缩脲法行肌肉总蛋白含量的测定。 7.3.1试剂组成与配制 试剂1:粉剂，用时加蒸馏水至100ml;试剂2:粉剂，用时加蒸馏水至200ml。 试剂1与试剂2完全溶解后充分混合即成双缩脲试剂。 蛋白标准液:50mg/ml。 7.3.2组织匀浆的制备 )中漂洗，除去血液，滤取少量患侧腓肠肌肌腹组织块，在预冷的生理盐水(4? 纸拭干，在万分之一分析天平上迅速称取约30mg肌组织，置小烧杯内。用移液器量取0.5ml预冷的生理盐水(4?)置于小烧杯中，用眼科手术剪尽快剪碎组织块，将剪碎的组织倒入玻璃匀浆器中。再用0.5ml预冷的生理盐水来冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入玻璃匀浆器中，进行肌组织匀浆。将匀浆以3000r/min离心10min，取上清液。将上清液中加入预冷的生理盐水，稀释成2ml，混匀，作为样品溶液进行蛋白测定。 7.3.3样品的测定 在空白管、标准管、测定管中分别加入蒸馏水、蛋白标准液，样品液各50µl。各管中再分别加入2.5ml双缩脲试剂，混匀，37?水浴10min，流水冷却。在分光光度计上 10 于波长540nm处比色，空白管调零，测定各管吸光度(OD值)。 7.3.4计算 组织匀浆的蛋白浓度(mg/ml)=(测定管OD值/标准管OD值)×蛋白标准液浓度 经过换算求得腓肠肌组织块的蛋白含量，最终求得每克腓肠肌组织的蛋白含量。 7.4肌纤维直径和截面积:取患侧腓肠肌中段肌腹最大处肌块，遂投入10%福尔马林溶液内固定24h，30%—100%各级酒精脱水，二甲苯透明两次，浸蜡，石蜡包埋。做纵、横切片，片厚5μm，HE染色。在高倍视野(20×10)下，用图像分析系统测量横切片中肌纤维的直径和截面积。 HE染色步骤:将烘干后的石蜡切片浸入二甲苯中脱蜡二次;100%、95%、80%、70%各级酒精入水;流动自来水冲洗;蒸馏水洗;苏木素染色5min;流动自来水冲洗;0.5%盐酸酒精溶液分化数秒钟;0.5%淡氨水蓝化切片30s;流动自来水冲洗5—10min;蒸馏水洗;0.5%伊红水溶液染色1—5min;蒸馏水洗;80%、90%、95%、100%逐级酒精脱水;二甲苯透明，中性树胶封固。 结果:细胞核呈蓝色，细胞浆及其它组织呈粉红色。 7.5胶原纤维含量:同上法做患侧腓肠肌横切片，天狼星红染色。 天狼星红混合液的配制:天狼星红0.1g溶于饱和苦味酸100ml中。 染色步骤:切片脱蜡至水;滴加天狼星红混合液，作用1小时;95%酒精分化(镜下控制);无水酒精脱水;中性树胶封片，观察。 结果:胶原纤维红色，肌肉等淡黄色或无色。 利用双色的对比，在高倍视野(20×10)下，采用图像分析系统对每张切片测定5个视野下胶原纤维的总面积及肌纤维的总面积，分别取其平均值，再求得胶原纤维与肌 纤维总面积平均值的比值。 7.6失神经支配骨骼肌中肌动蛋白、肌球蛋白的表达:同上法做患侧腓肠肌横切片，用免疫组织化学S-P法检测肌动蛋白的表达，SABC法检测肌球蛋白的表达。肌动蛋白和 ×10)下，每张切片上随机选择5肌球蛋白阳性均为胞浆内黄色颗粒。在高倍视野(40 个区域，用图像分析系统对每一区域进行光密度分析，取肌动蛋白和肌球蛋白阳性染色的平均光密度(AOD)值。 7.6.1 肌动蛋白的表达S-P法染色步骤: ?载玻片防脱片剂处理及贴片:载玻片预涂粘片剂Poly-L-Lysine，石蜡切片捞片后，贴片于预涂粘片剂的玻片上，置烤箱内58-60?至少4h以使切片紧密粘附; ?石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS(pH 7.4)冲洗3次，每次5分钟 (5min×3，下同); ?每张切片加用蒸馏水新鲜配置的3% HO50µl，以阻断内源性过氧化物酶的活性，22 37?下孵育10min; 11 ?PBS冲洗5min×3; ?抗原修复:高压修复10min，室温冷却20min; ?每张切片加50µl的非免疫性动物血清(试剂B)，37?下孵育10min，吸干; ?每张切片加50µl的鼠抗骨骼肌肌动蛋白(Actin)(1:100)，37?下孵育1h; ?PBS冲洗5min×3; ?每张切片加50µl生物素标记的第二抗体(试剂C)，37?下孵育20min; ?PBS冲洗5min×3; ?每张切片加50µl链亲和素-过氧化物酶溶液(试剂D)，37?下孵育20min; ?PBS冲洗5min×3; ?每张切片加100µl新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察5—10min; ?自来水冲洗，苏木素复染，中性树胶封固。 阴性对照片:每次染色时均设置阴性对照，PBS代替一抗，其余步骤相同。 7.6.2 肌球蛋白的表达SABC法染色步骤: ?载玻片防脱片剂处理及贴片; ?切片常规脱蜡至水; ?切片加用蒸馏水新鲜配置的3% HO50µl，室温5—10min，以阻断内源性过氧化22 物酶的活性，PBS冲洗5min×3; ?高压修复抗原10min，室温冷却20min; ?滴加正常山羊血清封闭液，室温20min，甩去多余液体，不洗; ?滴加鼠抗骨骼肌肌球蛋白(Myosin)抗体(1:50)，4?过夜; ?PBS冲洗2min×3; ?滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，37? 20min; ?PBS冲洗2min×3; ?滴加试剂SABC，37? 20min; PBS冲洗5min×4; ? ?DAB显色:取1ml蒸馏水，加DAB显色试剂盒中A、B、C试剂各1滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下控制反应时间，在5-30min之间，显色后，蒸馏水洗涤; ?苏木素轻度复染约1min，脱水，透明，中性树胶封片。显微镜下观察。 阴性对照片:每次染色时均设置阴性对照，PBS代替一抗，其余步骤相同。 7.7 骨骼肌细胞凋亡情况，及凋亡相关基因Fas、Bcl-2蛋白的表达:同上法做患侧腓肠肌横切片，末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的dUTP法(TdT-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)染色，标记凋亡细胞。用免疫组织化学S-P法检测Fas，SABC法检测Bcl-2 基因蛋白水平的表达。在高倍视野(40×10)下，用图像分析系统进行光密 12 度分析，每张切片上随机选择5个区域，调节系统去除本底后，测量特异染色的平均光密度(AOD)值。 7.7.1 TUNEL法染色步骤: ?载玻片防脱片剂处理; ?切片常规脱蜡至水; ?PBS冲洗5min×3; ?用蛋白酶K(20µg/ml溶于10mM Tris/HCl中，Ph7.4)室温孵育20min; ?PBS冲洗5min×3; ?将TUNEL酶与TUNEL Label混合成反应混合液。滴加50µl TUNEL反应混合液，37?孵育60min; ?PBS冲洗5min×3; ?滴加50µl TUNEL过氧化物酶标抗体(POD)，37?孵育30min; ?PBS冲洗5min×3; ?滴加DAB底物溶液，室温孵育5-20min，显微镜下控制显色; ?双蒸水洗; ?脱水，透明，中性树胶封片，显微镜下观察。 阴性对照片:在TUNEL反应混合液中只加入标记液。 结果判断:凋亡细胞的核呈棕色或棕褐色着染，细胞核形态呈碎点状，不规整，大小不一致。 7.7.2凋亡相关基因Fas的表达S-P法染色步骤:抗原修复采用煮沸20min, 一抗滴加50µl的兔抗骨骼肌Fas(1:100)，4?过夜，其余操作步骤同上述肌动蛋白S-P法染色步骤。阳性部位是细胞膜和细胞浆。阴性对照片:同上述肌动蛋白S-P法染色步骤。 7.7.3凋亡相关基因Bcl-2的表达SABC法染色步骤:不进行抗原修复，一抗滴加50µl的兔抗骨骼肌Bcl-2(1:100)，4?过夜，其余操作步骤同上述肌球蛋白SABC法染 同上述肌球蛋白SABC法染色步骤。 色步骤。阳性部位是细胞浆。阴性对照片: 7.8 透射电镜下观察失神经支配骨骼肌的超微结构的变化:取双侧腓肠肌肌腹部 3分，切成1mm的小粒，经醋酸铀，枸橼酸铅双染色，电镜观察、照像。 操作过程如下: ?取材; ?前固定:3%戊二醛-1.5%多聚甲醛-0.1M PBS(PH7.2) 4?，2h以上; ?漂洗:0.1M PBS 10min×3; ?后固定:1%锇酸-1.5%亚铁氰化钾(1:1)4?，2h; ?漂洗:0.1M PBS 10min×3; 13 ?脱水:50%酒精10min，70%酒精饱和醋酸铀溶液 4?，过夜，90%酒精10min，90%酒精，90%丙酮(1:1)10min，90%丙酮10min，无水丙酮10min×3; ?浸透:无水丙酮，618包埋剂(1:1)1.5h, 618包埋剂35? 3h; ?聚合:35? 12h，45? 12h，60? 3天; ?切片:80nm; ?染色:醋酸铀5min，柠檬酸铅5min; ?电镜观察:Hu-12A型透射电镜观察并拍照。 8.统计分析方法 全部计量资料采用均数?标准差表示，组间比较用t检验，用SPSS11.0统计软件统计分析。 结果与分析 1.一般情况的变化 造模后各组大鼠伤口对合整齐，无明显感染及渗出，1周后伤口基本愈合。术后动物伤足呈背伸、外展、外翻形态，足趾并拢呈爪样。手术约10天后，实验组有1只，对照组有2只大鼠踝关节附近逐渐出现皮肤溃疡，但实验组皮肤溃疡情况较对照组轻。3周后，3只大鼠皮肤溃疡恢复正常。 2.小腿腓肠肌湿重的变化 失神经后，两组大鼠患侧腓肠肌均有不同程度的萎缩，体积变小。取材时见对照组的腓肠肌明显萎缩变小，外观较黯淡;实验组的腓肠肌较饱满，有弹性，外观有光泽。 — 表1.小腿腓肠肌湿重的恢复率的比较(%)(X?S) 组别 n 2周 4周 6周 实验组 9 61.06?6.35@ 42.03?4.10##@@ 37.90?5.15@@ 对照组 9 54.20?6.04 32.84?4.79## 28.41?5.19 注:#、## 代表第4周与第2周比较，P,0.05、,0.01; *、** 代表第6周与第4周比较，P,0.05、,0.01; @、@@ 代表实验组与对照组比较，P,0.05、,0.01。(下同) 80 湿60重 恢40 复20实验组率 对照组02周4周6周 图1.小腿腓肠肌湿重的恢复率的比较(%) 14 从表1，图1可以看出，大鼠失神经支配后，患侧腓肠肌湿重均明显下降。对照组失神经支配2周，肌湿重下降了45.80%;失神经支配4周，肌湿重下降了67.16%;失神经支配6周，下降了71.59%。实验组失神经支配2周、4周和6周，肌湿重分别下降了38.94%、57.97%、62.10%。两组4周组与2周组组内比较，有显著性差异，P,0.01;两组6周组与4周组组内比较，均无显著性差异;而两组2、4、6周组组间比较差异显著。可以看出，失神经支配后大鼠腓肠肌在术后4周内萎缩最明显，肌湿重下降最快，4周后湿重下降减缓;服用复方太子参颗粒后肌萎缩速度显著减缓。 3.肌肉总蛋白含量的变化 — 表2.肌肉总蛋白含量的变化的比较(mg蛋白/g肌肉湿重)(X?S) 组别 n 2周 4周 6周 实验组 9 192.65?48.81@ 91.16?16.79##@ 79.73?10.47@ 对照组 9 144.69?41.86 72.25?13.93## 65.22?15.88 200 150蛋 白100含 量实验组50 对照组02周4周6周 图2.肌肉总蛋白含量的变化的比较(mg蛋白/g肌肉湿重) 大鼠骨骼肌失神经支配后，肌肉萎缩，蛋白质分解，肌肉总蛋白含量相应减少。实验组与对照组4周组与2周组组内比较，肌肉总蛋白含量明显减少，有统计学差异，P,0.01;两组6周组与4周组组内比较，肌肉总蛋白含量呈下降趋势，但在统计学上均无显著性差异;两组2、4、6周组组间比较，实验组均显著大于对照组，P,0.05。说明大鼠失神经支配骨骼肌在4周内蛋白质分解速度较高，蛋白质丧失最快;4周后骨骼肌蛋白质分解变缓，蛋白质含量下降速度减慢;服用复方太子参颗粒后明显抑制了肌肉蛋白质的丧失，即复方太子参颗粒可以显著抑制肌肉蛋白质的分解。 4.肌纤维直径和横截面积的变化 肌肉组织HE染色光镜下所见如下: 正常肌组织:肌纤维排列整齐，肌束间间隙小，肌束间、肌纤维间有少量结缔组织和血管。纵切片上可见肌纤维横纹清晰，其两侧染色较深为肌膜，肌膜下有多个扁椭圆形的细胞核，沿肌纤维长轴方向排列，均在肌纤维边缘;肌纤维间可见成纤维细胞，肌细胞核染色较成纤维细胞核染色淡;肌浆均匀分布。横切片上肌纤维呈圆形或多边形， 15 肌核圆形，肌核位于肌纤维边缘，肌原纤维呈点状并聚集分布。 失神经后2周组:对照组可见肌纤维萎缩，部分肌纤维退变，横纹模糊或消失，胞浆淡染或不均匀;核增多，分布紊乱，形成核堆，替代退变肌细胞;少部分肌纤维仍可见横纹，肌纤维间结缔组织增多，少部分区域有脂肪浸润于肌纤维之间;毛细血管管腔变小。实验组也可见肌纤维萎缩，肌纤维退变较轻，肌纤维之间未见脂肪浸润;毛细血管管腔较大，数目较多。 失神经后4周组:对照组可见大部分肌纤维萎缩，退变的肌纤维轮廓消失;核排列紊乱，部分核排列仍有方向性，可见核固缩和肿胀以及位于肌纤维中央的核，肌细胞胞浆少;毛细血管数目较少，管腔变小。实验组肌纤维也进一步萎缩，但轻于对照组，肌纤维轮廓仍较清晰，固缩和肿胀的核及位于肌纤维中央的核较对照组少;毛细血管管腔较大，数目较多。 失神经后6周组:对照组可见肌纤维轮廓模糊，横纹消失，胞浆淡染，肿胀淡染的核增多，成串沿肌纤维方向排列，部分区域脂肪结缔组织浸润;毛细血管数目减少，且有管腔变形。实验组部分肌纤维轮廓模糊，部分肌纤维横纹消失，脂肪结缔组织浸润少见;毛细血管明显较对照组丰富，管腔较大。 — 表3.肌纤维直径的比较(μm)(X?S) 组别 n 2周 4周 6周 实验组 9 13.49?2.27@@ 11.90?1.69@@ 10.97?1.65@@ 对照组 9 10.62?1.77 8.76?1.37# 7.95?1.54 —2表4.肌纤维截面积的比较(μm)(X?S) 组别 n 2周 4周 6周 实验组 9 142298.56?15280.01@ 118977.67?16041.89##@@ 108364.89?13873.07@@ 对照组 9 126425.78?11840.06 93329.67?18575.54## 76115.44?8463.13* 16160000肌肌12纤120000纤维8维80000实验组截直4实验组对照组40000面径对照组0积0 2周4周6周2周4周6周 2图3.肌纤维直径的比较(μm)图4.肌纤维截面积的比较(μm) 从表3、表4、图3、图4对照组可以看出，骨骼肌失神经支配后，肌肉明显萎缩，肌纤维直径和截面积明显减小，尤其在失神经后4周内下降最快。对照组肌纤维直径、 16 肌纤维截面积4周组与2周组比较有显著性差异;对照组6周组与4周组比较肌纤维截面积也有显著减少。而实验组术后2、4、6周肌纤维直径虽有下降，但统计学上差异不显著;肌纤维截面积实验组在4周内也有明显的下降。术后2、4、6周实验组肌纤维直径和截面积均显著大于对照组。 从表3、表4可以看出，复方太子参颗粒对失神经支配骨骼肌肌纤维的直径和截面积的下降有明显的延缓作用，故复方太子参颗粒有延缓失神经支配骨骼肌萎缩的作用。 5.胶原纤维含量的变化 —2表5.胶原纤维面积的比较(μm)(X?S) 组别 n 2周 4周 6周 实验组 9 24996.00?4186.76@@ 29147.22?3415.64#@@ 33411.67?3153.43*@@ 对照组 9 30212.78?3035.05 34805.89?3708.77# 41718.11?3414.37** — 表6.胶原纤维面积与肌纤维面积的比值的比较(%)(X?S) 组别 n 2周 4周 6周 实验组 9 16.29?3.31@@ 24.54?4.51##@ 32.39?4.87**@ 对照组 9 21.76?4.00 31.66?6.14## 38.97?7.52* 胶50000原4040000纤面3030000维实验组积2000020截对照组比10000面10实验组积0对照组02周4周6周2周4周6周 2图5.胶原纤维面积的比较(μm)图6.胶原与肌纤维面积比比较(%) 表5、6，图5、6及照片1-7显示，随失神经时间的延长，骨骼肌组织萎缩程度的加重，肌纤维面积减小的同时，骨骼肌组织中红染的胶原纤维面积却增大;失神经时间越长，胶原纤维增多越明显。胶原纤维呈网状分布在肌纤维间，肌束间可见成束或成片的增生的胶原纤维。实验组与对照组4周与2周组，6周与4周组组内比较胶原纤维面积明显增大，差异显著。实验组胶原纤维面积在术后2、4、6周均显著小于对照组，P,0.01。失神经后胶原纤维面积与肌纤维面积的比值两组均显著增大，但实验组的比值明显小于对照组，在统计学上有显著性差异。 从表5、6，图5、6可以看出，复方太子参颗粒可以明显抑制失神经支配萎缩骨骼肌组织中胶原纤维的形成。 6.失神经支配骨骼肌中肌动蛋白、肌球蛋白的表达的变化 17 — 表7.肌动蛋白表达的AOD值的比较(X?S) 组别 n 2周 4周 6周 实验组 9 0.2761?0.0480@ 0.2270?0.0271#@@ 0.1987?0.0259*@@ 对照组 9 0.2202?0.0341 0.1808?0.0300# 0.1493?0.0231* — 表8.肌球蛋白表达的AOD值的比较(X?S) 组别 n 2周 4周 6周 实验组 9 0.2859?0.0433@@ 0.2313?0.0348##@@ 0.2023?0.0283@@ 对照组 9 0.2263?0.0364 0.1812?0.0311## 0.1533?0.0216* 0.3 0.25 光0.2实验组Actin密0.15度对照组Actin0.1值实验组Myosin0.05对照组Myosin02周4周6周 图7.肌动蛋白、肌球蛋白的表达的比较 正常腓肠肌肌动蛋白、肌球蛋白阳性为胞浆内黄色颗粒，均匀分布，显横纹。所有肌纤维染色一致。 术后2、4、6周时，肌动蛋白、肌球蛋白阳性染色变浅，肌纤维横纹模糊甚至消失。从表7、8，图7，照片8—21可以看出，骨骼肌失神经支配后，肌动蛋白、肌球蛋白的表达逐渐减少。术后2、4、6周时，肌动蛋白、肌球蛋白的表达，实验组虽有所下降，但仍显著高于对照组，各时间组组间比较有显著性差异。说明复方太子参颗粒可以显著减缓肌动蛋白、肌球蛋白的丢失，从而减缓失神经肌肉的萎缩。 7.骨骼肌细胞凋亡情况，及凋亡相关基因Fas、Bcl-2的表达 实验结果发现:正常的骨骼肌细胞鲜见凋亡细胞核;失神经骨骼肌中发生凋亡的细胞核增多，失神经时间越长，凋亡的细胞核越多。TUNEL染色阳性的细胞核着色呈棕色，且具备有以下的一个或一个以上的特点:(1)细胞核大小异常:细胞核比正常者小1/2或大2倍以上;(2)细胞核外形异常:细胞核边缘呈扇贝或波浪状和(或)呈锐角;(3)细胞核部位异常:细胞核位于肌纤维中央或离开周边的细胞膜。 — 表9.TUNEL染色阳性凋亡细胞的AOD值的比较(X?S) 组别 n 2周 4周 6周 实验组 9 0.2422?0.0356@ 0.2700?0.0407@@ 0.3023?0.0413@@ 对照组 9 0.2971?0.0647 0.3539?0.0356# 0.3985?0.0211** 18 — 表10.Fas 基因蛋白的表达的AOD值的比较(X?S) 组别 n 2周 4周 6周 实验组 9 0.1533?0.0436@ 0.1798?0.0420@ 0.2149?0.0168*@@ 对照组 9 0.1918?0.0232 0.2325?0.0391# 0.2712?0.0355* — 表11.Bcl-2 基因蛋白的表达的AOD值的比较(X?S) 组别 n 2周 4周 6周 实验组 9 0.1695?0.0330@ 0.2415?0.0452##@@ 0.2169?0.0504@@ 对照组 9 0.1300?0.0266 0.1512?0.0286 0.1383?0.0152 0.4 实验组TUNEL0.3光对照组TUNEL密实验组Fas0.2度对照组Fas值实验组Bcl-20.1 对照组Bcl-2 02周4周6周 图8.细胞凋亡及凋亡相关基因的表达的比较 表9，图8及照片22—27显示，失神经后骨骼肌细胞凋亡明显增加，两组肌肉均随着失神经时间的延长，其阳性染色的凋亡细胞核光密度值增大，但对照组较实验组失神经后肌细胞凋亡现象明显。对照组4周组与2周组，6周组与4周组比较TUNEL染色阳性的光密度值明显增大，P,0.05、P,0.01;而实验组4周组与2周组，6周组与4周组比较TUNEL染色阳性的光密度值虽有增大，但无统计学差异，P,0.05。表9表明骨骼肌失神经支配后细胞凋亡现象明显，而复方太子参颗粒可以显著抑制失神经后骨骼肌的细胞凋亡。 表10，图8及照片28—34显示，骨骼肌失神经支配后，凋亡相关基因Fas蛋白的表达逐渐增强。对照组4周组与2周组，6周组与4周组比较Fas 基因蛋白的表达明显增加，P,0.05;而实验组4周组与2周组比较增加不显著，6周组与4周组比较升高明显。但实验组Fas 基因蛋白的表达在术后均显著低于对照组。 表11，图8及照片35—41显示，骨骼肌失神经支配后凋亡相关基因Bcl-2有表达，但表达水平较低，随失神经时间的延长，Bcl-2的表达水平变化不明显。实验组Bcl-2基因蛋白的表达水平在术后2、4、6周均升高，以术后4周时表达最强，与对照组比较显著高于对照组。 从表9、10、11，图8可以看出:失神经支配后骨骼肌细胞出现细胞凋亡现象，且失神经时间越长，细胞凋亡越明显;失神经支配后萎缩骨骼肌出现凋亡相关基因Fas 蛋 19 白的高表达，及Bcl-2蛋白的低表达。复方太子参颗粒可以显著减少TUNEL阳性染色的凋亡细胞核数量，即抑制骨骼肌细胞凋亡;复方太子参颗粒可以显著促进失神经支配骨骼肌Bcl-2基因蛋白的表达，而显著抑制Fas基因蛋白的表达。 8.失神经支配骨骼肌超微结构的变化 正常肌肉电镜下观察:骨骼肌纤维是细长圆柱形的细胞，有多个椭圆形的细胞核，肌细胞核位于肌细胞边缘肌膜下方，核内以常染色质为主，核仁有时也可见。胞浆内含许多与细胞长轴平行排列的肌原纤维，肌原纤维排列整齐，肌丝、肌节排列整齐，Z线清晰。肌原纤维之间有大量线粒体、糖原以及少量脂滴。线粒体均匀分布在肌原纤维之间，排列规则，肌质网、线粒体未见肿胀等改变。肌细胞间分布有多少不等的毛细血管，未见胶原纤维增生，未见溶酶体。(见照片42) 与对照组相比，实验组在术后2、4、6周时的超微结构形态的退变均较对照组轻。(见照片43—48) 失神经支配2周: 对照组:部分肌细胞轻、中度萎缩变细，肌细胞表面凹凸不平，呈锯齿状，萎缩的肌细胞呈簇状分布;个别肌细胞核内移，核周池略有扩张;有的肌细胞内肌质网略有扩张，少数线粒体略有肿胀，嵴减少或消失;肌丝、肌节的排列在不同的部位存在不同程度的紊乱;肌细胞间隙略有扩大，细胞间隙的胶原纤维增生较少，毛细血管管腔变小;未见凋亡细胞。 实验组:肌细胞轻、中度萎缩变细，以轻度萎缩为主，萎缩的肌细胞表面凹凸不平，呈锯齿状;个别肌细胞核内移，未见核周池扩张;肌丝、肌节的排列结构较整齐，部分肌细胞肌丝、肌节排列不整齐，肌质网、线粒体改变不明显;肌细胞间隙未见胶原增生，毛细血管管腔变大，数目较对照组多;未见凋亡的肌细胞。 失神经支配4周: 对照组:部分肌细胞轻度萎缩，部分肌细胞萎缩较明显，表面凹凸不平呈锯齿状;部分肌细胞核内移，部分细胞核表现出代谢活跃的征象，如核变大，核仁清晰，核居中等，细胞核仁略大，染色质结构松散;部分肌细胞肌丝、肌节排列紊乱，紊乱程度较对照组2周时增加;线粒体肿大，嵴变短、减少或消失，肌质网略扩张，糖原颗粒减少，溶酶体增多;肌细胞间隙扩大，胶原纤维明显增生，成纤维细胞、纤维细胞增生，毛细血管少见，管腔狭窄;肌卫星细胞略有增生;见少量再生的肌细胞，其核大，胞浆内核糖体较多，肌丝、肌节未形成;未见凋亡的肌细胞;偶见节段性坏死的肌细胞，其坏死区域胞膜不完整，胞浆内肌丝结构不清，并呈节段性固缩。 实验组:部分肌细胞轻度萎缩，部分肌细胞萎缩较明显，表面凹凸不平呈锯齿状;核内移也较少见;部分肌细胞肌丝、肌节排列不整齐，与对照组比较肌丝、肌节的排列 20 结构较整齐;肌质网、线粒体略有扩张、肿胀，线粒体嵴消失比例小，程度轻;也出现溶酶体，但较对照组少;有少量的再生肌细胞;成纤维细胞，增生的胶原纤维较对照组少见，毛细血管管腔大，数量较多;未见凋亡的肌细胞。 失神经支配6周: 对照组:多数肌纤维有萎缩，大部分肌纤维萎缩明显，少数较轻，萎缩的肌纤维表面凹凸不平呈锯齿状;细胞核内移现象相对普遍，细胞核略大，有空泡出现，偶见核周池扩张;肌丝、肌节的排列更加紊乱，甚至见断裂、融合、缺失;细胞内肌质网扩张，线粒体肿胀，线粒体数目减少，部分呈空泡化;糖原颗粒减少;少数肌细胞呈节段性坏死，其坏死区域肌丝溶解或肌丝、肌节结构模糊不清;肌细胞间隙胶原纤维增生加剧，成纤维细胞、纤维细胞增生较前明显，有少量肥大细胞浸润;毛细血管管腔变形、狭窄，数量少;偶可见到细胞皱缩，核固缩，染色质呈块状分布，染色质浓缩，核周池扩大等细胞凋亡早期的形态改变，但未发现明显的核碎片。 实验组:肌纤维萎缩明显，较对照组轻;肌纤维肌丝、肌节的排列，细胞器的改变较轻，细胞内肌质网扩张，线粒体肿胀;成纤维细胞、胶原纤维增生虽较明显，但较对照组少见;毛细血管丰富且管腔较大;偶可见少量再生的肌细胞，其肌膜较光滑，核大，胞浆内糖元较多，有的再生肌纤维内已有较完整的肌丝、肌节;也可见坏死的肌纤维;偶可见到细胞皱缩，染色质呈块状分布，染色质浓缩等细胞凋亡早期的形态改变，未见典型的凋亡小体。 讨 论 1.失神经支配骨骼肌萎缩模型的建立 大鼠腓肠肌由于解剖表浅，肌腹发达，取材容易，是建立失神经支配骨骼肌萎缩常 [33]用实验模型。目前常用方法是在坐骨结节平面切断坐骨神经主干，使腓肠肌失神经支 [34]配而萎缩。但切断坐骨神经主干后，同时切断了前往腓总神经、腓肠神经及胫神经支配其他组织的神经纤维，平面远端的大部分肢体组织失去了神经营养及皮肤感觉。因此自术后10天起远端肢体陆续出现皮肤溃疡，部分大鼠甚至自食或相互撕咬掉实验侧肢体，使实验归于失败，而且经久不愈的肢体溃疡也严重影响实验材料检测的准确性。有[35]人切断坐骨神经或其不同分支建立实验模型，通过比较研究发现，切断坐骨神经主干的24只大鼠中有7只出现肢体溃疡，且有3只撕咬掉了实验侧肢体;而切断胫神经主干组只有1只出现肢体溃疡，切断腓肠肌支组无皮肤溃疡出现。各组失神经支配腓肠肌湿重、肌细胞直径等方面无差异。从大鼠坐骨神经显微解剖学研究来看，支配腓肠肌的神经来自胫后神经的内、外侧肌支，且无其他神经纤维的交叉支配，切断胫神经或腓肠肌肌支可以完全阻断腓肠肌的神经支配，而最大限度地保存肢体其他组织的神经营 21 养及皮肤感觉，避免大鼠出现肢体溃疡及撕咬肢体现象，保证实验模型建立的成功。因此，在建立失神经支配腓肠肌实验模型时，以切断腓肠肌肌支或胫神经为宜。本课题研究中采用切断胫神经的方法建立了失神经支配腓肠肌实验模型，发现大鼠手术后10天左右，实验组有1例，对照组有2例大鼠踝关节附近出现皮肤溃疡，但3周后，溃疡恢复正常。 2.细胞凋亡的特征及其检测方法 细胞死亡是细胞本身和外界环境因素综合作用的结果，可分为生理性死亡和病理性死亡。近十余年，人们以细胞死亡相关基因的表达调控为重点，对细胞死亡规律进行了深入研究，证实除坏死(Necrosis)以外，还有另一种死亡形式，即细胞凋亡(Apoptosis)。 [36]在1972年Kerr首次详细描述了程序性细胞死亡和病理性细胞死亡的形态学差异，随后这种死亡方式被称为细胞凋亡(Apoptosis)。Apoptosis一词来源于希腊语，它是指树叶从树上凋落，在此指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，由基因调控的主动的死亡过程。 细胞凋亡的形态学特征与坏死性细胞死亡的形态特点不同。坏死通常是外界因素造成细胞膜通透性增加，或者能量依赖性离子泵被破坏造成离子沿各自的浓度梯度进入细胞，从而导致细胞膨胀，细胞外形发生不规则变化，内质网扩张，核染色质发生不规则的移位，核染色体沉淀为絮状，进而线粒体及核肿胀，溶酶体破坏，细胞膜破裂，细胞内涵物释放至细胞外并激发机体炎症反应。 细胞凋亡是细胞内在的有规律的机制引起的。这种死亡的特征是细胞首先变圆，随即与邻周细胞脱离，微绒毛消失，胞浆浓缩，内质网扩张成泡沫状并与细胞膜融合，线粒体保持形态上的正常。核染色质凝集在核周边呈半月形，随后核固缩，进而碎裂、崩解。细胞膜皱缩、内陷将细胞自行分割包被形成多个内含数目不等的细胞器凋亡小体。这些小体从凋亡细胞表面出芽并脱落，在机体内被具有吞噬功能的细胞所识别、吞噬，或自然脱落而离开生物体。由于这种死亡过程不导致溶酶体及细胞膜破裂，细胞内涵物 [36-38]始终保留在膜结构内，因此不引起机体炎症和次级损伤。 2+2+细胞凋亡最明显的生化特征是Ca、Mg依赖的内源性核酸内切酶的激活，将细胞核染色体从核小体间断裂，形成由大约180-200bp或其整数倍的多聚体组成的寡核苷酸片[39]段,在琼脂糖凝胶电泳上呈阶梯状DNA区带图谱(DNA ladder),这个长度即是核小体上的DNA单位的大小。 目前发现细胞凋亡存在三条通路:死亡受体通路、线粒体通路和内质网通路，三条通路间是相互密切关联的，它们和Bcl-2家族，p53，c-myc，凋亡抑制蛋白及胞内信号转导等通路间构成一个复杂的网络对凋亡进行精细的调控。近年来的研究表明，在大多数细胞凋亡的过程中，都需要有新的基因表达，根据其作用的不同，可分为凋亡促进基 22 因(或致死基因)和凋亡抑制基因(或存活基因)两大类，这些基因产物可参与促进或抑制细胞凋亡的发生、发展。凋亡促进基因有Ced-3、Ced-4、p53、ICE、Bax、BCL-xs等;凋亡抑制基因有Bcl-2、Ced-9、Mcl-1等，其中最重要也是当前研究最多的是Bcl-2。 研究细胞凋亡的方法有很多，如形态学观察，琼脂糖凝胶电泳，原位末端标记法， [40]流式细胞仪检测等。归纳起来，可分为三个方面，即根据细胞凋亡的形态学特征、细胞凋亡的生化特征检测以及细胞凋亡的流式细胞仪检测。形态学是鉴定细胞凋亡最可靠的方法，主要是通过光学显微镜和电子显微镜，对组织或细胞进行各种染色。细胞凋亡 2+2+最明显的生化特征是Ca、Mg依赖的内源性核酸内切酶的激活，将细胞核染色体断裂形成由大约180-200bp或其多聚体组成的寡核苷酸片段。针对该寡核苷酸片段发展了凋亡细胞生化特征检测方法，如各种琼脂糖凝胶电泳方法、原位末端标记法和ELISA等，这些方法均具有很高的特异性和敏感性。用流式细胞仪检测细胞时，必须用荧光染料对细胞进行染色，并要求细胞呈悬浮状态。形态学观察、常规琼脂糖凝胶电泳研究方法只能定性而不能定量研究细胞凋亡。原位末端标记法可以对石蜡包埋的组织切片行原位末端标记，并且可以定性定量研究。 3.骨骼肌失神经支配后的变化及其检测 3.1小腿腓肠肌湿重、肌纤维直径和截面积的变化 周围神经损伤后，骨骼肌因失去神经营养因子及废用而发生萎缩，尤其是小肌肉，其变性和纤维化的速度较大肌肉快的多，程度也更加严重。检测大鼠肌肉湿重是了解肌 [41]肉萎缩程度最简单而有效的方法。Sunderland发现运动神经元与肌细胞间存在着非依赖于神经冲动的复杂关系，肌细胞正常形态结构维持需靠一些神经营养因子的作用，失神经支配后最大变化便是这些神经营养因子丢失导致的肌肉形态结构、生理生化及新陈代谢等方面改变。而失神经支配肌肉在形态学上首先表现为肌细胞浆丢失及直径减小。 [42]有人通过切断大鼠胫神经建立失神经支配腓肠肌实验模型，观察失神经骨骼肌组织形态学及运动终板退变，来寻找反映肌肉萎缩形态学的指标。发现肌肉湿重、肌细胞直径及截面积可作为反映肌肉萎缩的形态学指标，后两者更为可靠。其研究结果发现，肌细胞直径及截面积下降在失神经支配2周时即达正常值的40,，以后随失神经支配时间延长呈进行性下降;这与肌肉湿重变化有所不同，失神经支配2周时，肌湿重下降近50,，而以后一直保持在正常值的30,左右，这与本课题研究结果基本一致，这可能与肌间结缔组织增生及组织间水份增多有关。因此，肌肉湿重、肌纤维直径和截面积可作为反映肌肉萎缩的形态学指标，肌细胞直径及截面积比肌肉湿重更可靠。 3.2肌肉总蛋白含量的变化 机体蛋白质不断更新，处于合成与分解的动态变化中。肌肉的80%由肌原纤维组成，其成分即为蛋白质。既然蛋白质是肌肉很大的组成部分，肌肉萎缩伴有组织蛋白的净丢 23 [4]失是很必然的。Ohira研究表明失神经后肌肉总蛋白下降趋势同肌湿重下降趋势，提示蛋白质代谢的变化是失神经肌萎缩的一个重要特征。因此肌肉总蛋白含量的变化可较客观地反映肌萎缩的程度。 双缩脲法是蛋白质定量测定的最常用的方法之一，重复性、线性关系好。在生物体中除蛋白质外几乎没有能起双缩脲反应的物质，双缩脲法的结果也不因蛋白的种类不同而变化。 3.3胶原纤维含量的变化 骨骼肌失神经支配后，发生一系列形态、生理、生化、功能及新陈代谢方面的改变，肌纤维萎缩及继发性纤维化，间质结缔组织积聚，使肌肉的弹性降低。随着间质胶原的增多，毛细血管及其它小血管被多层的致密胶原围绕，使其与相邻肌纤维分离，潜在地 [43,影响血管床和肌纤维间的物质交换，也影响了再支配过程中神经轴突的长入和延伸， [44,45,肌肉获得神经再支配后，其功能不能完全恢复。因此防止失神经骨骼肌内胶原的增生非常必要。胶原是肌肉结缔组织中最主要的蛋白，因此控制失神经骨骼肌内胶原等结 [46]缔组织增生是维护失神经肌肉功能的重要方面。 [47-49]传统的胶原纤维染色法多为Vangieson 染色法，而天狼星红染色法对胶原纤维染色效果较好。天狼星红是一种与胶原分子中的碱性基团起反应的阴离子强酸性染料， [50]是一种长型展开的分子，可与胶原分子特异性吸附，紧密结合。经过天狼星红染色，胶原纤维呈鲜红色，与呈浅黄色的肌纤维对比，色彩鲜艳，不仅疏松结缔组织的胶原纤维易上色，呈鲜红色，而且肌束之间的胶原纤维以及血管内膜、中膜的微量的胶原纤维上色也较好，在偏振光显微镜下还可区分胶原纤维的类型。而Vangieson 染色法只对疏松结缔组织的胶原纤维上色，色彩呈品红色，不够鲜艳，其余地方几乎不上色，此外Vangieson 染色法所用的染料酸性品红易褪色，不易长久保存，而且无法显示胶原纤维的偏振光性。因此，用天狼星红染色可以对胶原纤维进行定性定量研究。本课题主要考察失神经后胶原纤维的总体变化及复方太子参颗粒对胶原纤维总体上的影响，故采用了天狼星红染色法显示胶原纤维，但未对胶原纤维进行分型研究。 3.4失神经支配骨骼肌中肌动蛋白、肌球蛋白的表达的变化 作为肌细胞的肌纤维，其内部的大部分是被称作收缩装置的肌原纤维，这种肌原纤维是由规则排列的粗、细两种肌微丝构成，粗的肌微丝主要是由肌球蛋白分子组成，细的肌微丝主要是由肌动蛋白分子组成。所以骨骼肌肌动蛋白和肌球蛋白是骨骼肌的结构蛋白、收缩蛋白。当骨骼肌失去神经支配以后，随着肌细胞的萎缩和退变，肌原纤维减少，肌动蛋白和肌球蛋白的表达出现变化，骨骼肌收缩功能必然受到影响。 失神经骨骼肌中肌动蛋白、肌球蛋白的表达采用免疫组织化学方法可以进行准确的检测。免疫组织化学或称免疫细胞化学(简称免疫组化)，主要原理是用标记的抗体对 24 细胞或组织内的相应的抗原进行定性、定位或定量检测。经过组织化学的呈色反应而呈现醒目的阳性色彩。凡是能作为抗原、半抗原的物质，如蛋白质、多肽、核酸等都可用 [51]相应的特异性抗体在组织、细胞内用该法准确的定位。免疫组化有如下优点:(1)具有高度的特异性，识别能力可达到单个氨基酸的水平，其它组织化学方法难以相比;(2)有高度的敏感性。可采用各种有效方法最大限度保存组织或细胞内待检物质的抗原性，或采用增敏方法，使用高度敏感的和高亲和力的抗体，以保证检出细胞内超微量的抗原成分。因而它是在细胞、分子水平或基因水平的检测技术。(3)它是一种综合定性、定位和定量密切结合，形态、机能和代谢密切结合为一体的检测技术。在细胞、染色体或亚细胞水平原位检测抗原分子，是其它任何生物技术难以达到和代替的，它能在细胞、基因、分子水平同时原位显示基因及其表达产物。 3.5骨骼肌细胞凋亡情况，及凋亡相关基因的表达 近年来，细胞凋亡的研究受到人们广泛的重视。细胞凋亡是受基因调控的细胞死亡方式。人们已经研究了多种组织的细胞凋亡现象，发现生物机体组织的萎缩和退化与细胞凋亡有着密切的关系。近来有人将骨骼肌的萎缩和退化与细胞凋亡联系起来，认为细胞凋亡可能在骨骼肌萎缩和退化中发挥重要作用。 哥本哈根大学的研究人员在电镜下观察到失神经比目鱼肌出现细胞皱缩、核固缩、核周池扩大、染色质浓缩等细胞凋亡的形态学改变，但未发现明显核碎片。原位缺口末端标记(in situ nick translation,ISNT)未发现DNA裂解，认为这可能是一种无DNA [52][53]降解的细胞凋亡，但这种凋亡在正常情况下是否发生还有待证明。而Schmalbruch 的研究结果略有不同，他除了在电镜下观察到新生大鼠比目鱼肌出现核周池扩大、染色质浓缩、肌纤维减少外，在电镜和ISNT中发现了少量有凋亡改变的细胞核，并观察到肌萎缩时有NK细胞和巨噬细胞的聚集，认为凋亡现象伴随NK细胞而发生，凋亡与NK [54]细胞有密切关系。Tews则比较肯定地认为失去神经支配后的肌肉存在细胞凋亡现象。他采用末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TdT-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)检测了切断神经的大鼠面肌，发现失去神经支配后大鼠面肌细胞出现 [55,56]DNA碎片。国内有学者研究发现臂丛神经损伤后，失神经骨骼肌肌萎缩的肌细胞存在细胞凋亡现象，并指出细胞凋亡导致的肌细胞核数量减少可能是影响神经修复手术疗效的主要原因之一。 在失神经肌萎缩细胞凋亡的基因调控方面，有研究提示bax和ICE在失神经骨骼肌中的显著表达，将使肌丝断裂、胞浆浓缩、胞膜出芽，从而形成凋亡小体;Fas基因与II型肌纤维的凋亡相关。而近期研究提示Bcl-2的表达有助于维持大鼠面肌细胞的存 [54]活，同时对抗bax促细胞凋亡的作用。这为如何在基因水平阻断细胞凋亡而治疗失神 [57]经肌萎缩提供了一条新思路。Yamada等曾经用免疫组织化学和Westernblot方法，研 25 究了肌营养不良病人萎缩肌肉活检组织中凋亡相关基因Fas和Bcl-2的蛋白表达，发现II型肌纤维的凋亡与Fas基因的表达有关，与Bcl-2基因无关，而大鼠腓肠肌即属于 [58]II型肌纤维。国内有人首先用免疫组织化学ABC法检测了凋亡相关基因Fas、Bcl-2、c-myc和p53的蛋白表达，发现在臂丛神经损伤引起的骨骼肌萎缩中也有Fas表达增高，同时伴有Bcl-2基因的表达减少，而c-myc和p53变化不明显。用Northern-Blot检测了Fas、Bcl-2基因的mRNA的表达，发现臂丛神经损伤后萎缩的骨骼肌细胞Fas基因mRNA表达增高，Bcl-2基因mRNA表达减少。说明上述基因蛋白水平的改变是由于mRNA水平的改变造成的。 检测细胞凋亡的原位末端标记(in situ end-labeling,ISEL)可以提供单个细胞的凋亡信息，可以显示细胞凋亡的组织定位。它包括两种方法: 末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TdT-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)和DNA聚合酶I或Klenow大片段介导的原位缺口平移(in situ sick translation,INST)。这两种方法可以检测早期的细胞凋亡，且特异性和敏感性都较高，而TUNEL的敏感性要高于INST，在核苷酸掺入上，TUNEL比INST快得多。 值得注意的是，就ISEL技术本身而言，是不能区别凋亡、坏死和自溶性死亡，必 [40]须结合凋亡细胞的形态学特征加以判断。TUNEL和ISNT鉴定标记的阳性细胞可结合下列标准加以判断:显示单个或少数几个阳性细胞孤立地分布在组织中;具有凋亡细胞的核特征，即核固缩显一个或多个染色体团块，凋亡小体核片段;周围或局部无炎症反应的征象。另外，TUNEL优先标记凋亡细胞而不是坏死细胞。 TUNEL法是一种检测细胞凋亡的常用方法。细胞凋亡时双链DNA会出现许多不对称的断裂点，形成断裂的缺口，使3?端断端羟基(OH)暴露，末端转移酶(TdT)可标记DNA缺口末端的3?-OH。利用末端转移酶将标记的dUTP结合在DNA 3?末端游离羟基上。这种在组织细胞原位显示细胞凋亡的方法称“末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记技 [59]术”(TdT-mediated X-dUTP nick end labeling, TUNEL),其中的X可以是地高辛、生物素或荧光素等。再用方法显示，可在原位检出凋亡细胞断裂的DNA。如标记后的样品与相应的酶联抗体作用后，可催化底物产生颜色反应后在普通显微镜下观察;样品被 [60]荧光素标记可直接通过荧光显微镜，激光共聚焦显微镜或流式细胞仪检测。TUNEL 实验可以在培养细胞、石蜡包埋或冰冻切片上进行，因此具有较好的定位作用。此外，只要凋亡的细胞DNA中有一定量的断裂点形成，就可以出现阳性反应，因此敏感性较高。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，所以没有3?-OH形成，很少能够被染色。TUNEL法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的凋亡细胞或凋亡小体进行原位染色，能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征，并可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度远比一般的组织化学法和DNA Ladder测定法要高,因而 26 [61]在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。 TUNEL法可以显示单个细胞的凋亡状况和组织定位，灵敏度高于原位缺口末端标记(ISNT)法。因此，本课题采用TUNEL染色对失神经支配后的萎缩骨骼肌细胞凋亡情况进行检测。通过免疫组化染色法检测凋亡相关基因Fas、Bcl-2的蛋白表达，以探讨药物复方太子参颗粒对失神经支配骨骼肌细胞凋亡调控的影响。 3.6超微结构的变化 失神经支配后骨骼肌萎缩时骨骼肌的超微结构必然会发生一系列的变化。这些变化可通过特殊染色技术等方法用透射电镜观察到。电镜超微结构的观察也是诊断细胞凋亡最可靠的指标，尤其是凋亡小体的发现，但电镜只能定性而无法定量，而且观察到凋亡小体的机率也不高，因为在体内实验时凋亡细胞形成的凋亡小体可以很快被巨噬细胞等 [62]清除，不易观察到。 4.复方太子参颗粒组成中药的祖国医学认识及其现代研究 4.1复方太子参颗粒组成中药的祖国医学认识 方中太子参，味甘、微苦，性微寒，归脾、肺经，具益气健脾、生津润肺之功，为方中君药。川芎，味辛，性温，归肝、胆、心包经，能活血祛瘀、行气开郁、祛风止痛。川芎辛散温通，既能活血，又能行气，李时珍称其为“血中气药”，善治血瘀气滞病证。当归，味甘、辛、苦，性温，归肝、心、脾经，可补血、活血、止痛，主治血虚诸证，痿痹，肌肤麻木，跌仆损伤。川芎、当归共用为臣药。黄芪益气升阳、利水消肿、托毒生肌;白芍养血和营、缓急止痛、敛阴平肝;续断补肝肾、强筋骨、调血脉;骨碎补补肾强骨、活血止痛;制首乌养血滋阴、祛风解毒。以上诸药共为佐药。炙甘草益气补中、缓急止痛、润肺解毒、调和诸药，用以为使。诸药共用，共奏益气健脾、行气活血、补益肝肾、接骨续筋之功。 祖国医学认为:周围神经和骨骼肌均属于筋肉的范畴。脾在体合肌肉、主四肢，脾胃为气血生化之源，全身的肌肉均赖脾胃运化之水谷精微营养，才能使肌肉发达丰满，臻于健壮。脾主运化和升清，脾气健运则四肢肌肉的营养充足，而活动也轻劲有力。脾胃的运化功能障碍，必致肌肉瘦削无力，甚至痿弱不用。因此，《素问?痿论》中说:“治痿独取阳明”。痿即肌肉痿弱不用，手不能握物，足不能任身，日久渐至肌肉萎缩，不能随意运动的一类病证。阳明即脾胃之统称。肺的宣发功能失调，水谷精微失于输布，也会累及肌肉，致肌肉削瘦，软弱无力。肝藏血，主筋，肝藏血功能正常，筋肉方能得到濡养，发挥其生理功能。肝血虚或不能正常地调节机体外周血量时，会使筋肉失于濡养而致筋肉瘦瘪，手足软弱无力。肝肾同源，筋附于骨，肾虚也常为筋伤疾患的内因。同样，筋伤也可内伤肝肾，致肝肾亏虚。筋的正常生理活动还赖气煦血濡，气血不足或气滞血瘀则筋肉失养，出现肢体麻木、屈伸不利，甚至出现肌肉瘦削、软弱无力的痿证。 27 复方太子参颗粒有益气健脾、行气活血、补益肝肾、接骨续筋的功效，故其具有延缓失神经支配骨骼肌萎缩的作用。 [63-65,4.2复方太子参颗粒组成中药的现代研究 [66]太子参:具有清除超氧自由基的能力;对小鼠脾虚及细胞免疫功能低下均具有改善作用，能降低小鼠脾虚阳性发生率，升高脾虚小鼠体重、肛温、胸腺指数及脾脏指数，延长脾虚小鼠低温游泳时间和常压耐缺氧时间，并对免疫功能低下有较好的改善作用[67][68];有人研究发现太子参具有抗疲劳、抗应激和增强机体免疫功能的作用，可视为太子参补益作用的物质基础之一。 [69,70]川芎:川芎及其有效成分有扩张冠脉和外周血管的作用;川芎嗪能提高实验动物的耐缺氧能力，清除自由基，抑制血小板聚集及抗血栓形成，降低血脂，调节血凝状态，改善血液流变性;对平滑肌有解痉作用。 当归:明显抗血小板聚集，明显抗血栓形成作用;降血脂;促进血红蛋白及红细胞的生成;改善外周循环及扩张外周血管;抗炎、镇痛作用;抗缺氧、促进带氧血红蛋白在组织中释放氧，从而增强红细胞输氧的功能;抗脂质过氧化，清除自由基作用。 黄芪:促进造血功能，促进各类血细胞的生成、发育和成熟过程;扩张外周血管，促进微循环;抗血小板聚集及对血小板聚集具有明显的解聚作用;升高超氧化物岐化酶(SOD)活性，抗氧化，减少自由基生成，增加自由基清除;促进RNA及蛋白质合成提示其能延长细胞寿命、增强细胞代谢，延缓细胞衰老;能明显降低动脉和肺内胶原含量。 白芍:白芍提取物芍药甙对冠状血管及外周血管有扩张作用，其对ADP诱导的大鼠血小板聚集有抑制作用;白芍水煎剂对巨噬细胞功能有明显促进作用;白芍具有抗氧化和氧化损伤作用。 骨碎补:降低血脂;增强耐缺氧能力;降低血小板聚集作用。 续断:镇痛、促进组织再生作用。 制首乌:明显的降血脂作用;增加组织中SOD含量，抗氧化作用;提高血红蛋白及红细胞的含量。 炙甘草:抗炎作用;抗氧化、抗衰老;抑制血小板聚集;降低血脂。 5.复方太子参颗粒延缓失神经支配骨骼肌萎缩的机理 5.1抑制失神经支配骨骼肌的细胞凋亡 细胞凋亡现象在失神经支配骨骼肌中是否存在引起了人们的重视。本课题采用原位末端标记(TUNEL)法标记凋亡细胞结果发现:在正常的骨骼肌细胞中未见呈阳性反应的凋亡细胞核;失神经支配萎缩骨骼肌中存在骨骼肌细胞的凋亡，有较多的凋亡细胞核，随着失神经支配的时间延长，凋亡的细胞核数量逐渐增多，萎缩越严重，凋亡的细胞核数量越多。萎缩肌肉组织的电镜观察虽未发现典型的凋亡小体，但发现肌萎缩时肌细胞 28 DNA染色体聚集，核周池扩大，核缩小，周围皱褶增多的细胞凋亡早期改变。通过以上几种方法相互印证，表明大鼠胫神经损伤后骨骼肌萎缩时肌细胞存在细胞凋亡，且随失神经时间的延长，凋亡明显加重。在这些肌组织细胞中具有凋亡特征的肌细胞核，因此推测细胞核的凋亡确实与失神经肌肉萎缩相关，凋亡是肌细胞核减少和萎缩变性的细胞 [71]机制。这一结果与Borisov等推测骨骼肌失神经支配后细胞核数量减少的原因可能与细胞凋亡有关相吻合。TUNEL法检测及电镜观察发现失神经后有相当部分细胞核处于凋亡早期，于是推测这些细胞核可能使肌细胞存活相当长一段时间。当越来越多的细胞凋亡后，这些具有凋亡早期待征的肌细胞便不能维持其基本功能。服用复方太子参颗粒后，TUNEL染色阳性光密度较对照组明显降低，提示实验组大鼠肌萎缩减缓的同时，细胞凋亡现象减少，复方太子参颗粒可以减少失神经后萎缩的骨骼肌细胞凋亡的发生。 研究结果提示凋亡细胞的数量与临床疗效呈负相关关系，即失神经支配时间越长，凋亡细胞核数越多，则肌肉萎缩越严重，这必然影响神经修复的疗效。因此，对骨骼肌细胞凋亡情况的检测有助于判断神经修复手术的预后，进而指导临床手术方法的选择。但细胞凋亡的发生到何种程度意味着萎缩的不可逆性以及该指标的临床应用价值，有待今后进一步的深入研究。 细胞凋亡是一系列基因调控的自杀性死亡过程。细胞凋亡的发生与一系列凋亡相关基因的表达改变有关。 Fas又称APO,1或CD95，为非特异性抗原分子，广泛存在于各种组织和器官的细胞表面，是分子量约45KD的I型膜蛋白，属于肿瘤坏死因子(TNF)/神经生长因子(NGF)受体超家族。这一家族成员在分子结构上均含有细胞外区、跨膜区和胞浆区;细胞外区由3,6个富含半胱氨酸区组成，彼此间有24%,30%的同源性。Fas的NH端位于膜外，2由3个富含半胱氨酸的结构域组成。胞外区有157个氨基酸，含2个N糖基化位点，跨膜区有17个氨基酸，而胞内区有145个氨基酸。Fas基因定位于人染色体10号长臂及小鼠第19号染色体上，由8个内含子和9个外显子组成。其中外显子2、3、4编码蛋白的膜外区，外显子6编码跨膜区，胞浆区由外显子9编码。抗Fas抗体可以诱导正常 [72,或肿瘤Fas阳性细胞凋亡。表达Fas的细胞与Fas配基(Fas-L)共同孵育，可导致表达Fas的细胞凋亡。这一过程不需要补体成分的参与，提示Fas作为一种膜受体可向细胞内传递凋亡信号。Fas蛋白胞浆区有68个氨基酸序列高度保守。这一区域被认为是传递凋亡信号所必需的，称为死亡区域(death domain,DD)。 细胞膜蛋白Fas介导的凋亡信号，传导途径已经研究得较为深入。目前已克隆出两种与Fas死亡域结合的蛋白质:Fas关联蛋白(FADD)和受体联系蛋白(RIP)，这两种蛋白质在转染细胞过量表达都能诱导敏感细胞凋亡。FADD和RIP二者都具有与Fas死亡域同源的序列，在C-末端含有死亡结构域(DD)，在N-末端原结构域中含有死亡效应域 29 (DED)，DD和DED都是死亡信号传导的必需关键结构。当Fas与Fas配体结合或抗Fas抗体交联后，可诱导自身三聚体化，通过胞浆C-端的DD使FADD聚集，并发生构象变化 [73]暴露DED，随之与Caspase-8和Caspase-10N-末端前域的相应DED结合，形成死亡诱 [74]导信号复合体(death-inducing signaling complex,DISC),并使Caspase-8或Caspase-10裂解、活化，呈递凋亡信号的传导，启动下游Caspases，如Caspase-1、3、6、7。Caspases通过对底物降解可转导凋亡信号或直接作为凋亡的效应分子促进细胞骨 [75]架降解和DNA片段化，最终出现细胞凋亡。 Bcl-2基因编码的Bcl-2蛋白具有促进细胞存活的作用,可以抑制细胞凋亡的发生[76]。Bcl-2是B淋巴细胞瘤/白血病(B cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)基因的缩写，最初从小鼠B细胞淋巴瘤中分离得到。Bcl-2基因定位于18号染色体，包括3个外显子，2个内含子，仅第2个和第3个外显子具有编码功能。Bcl-2编码产物为由239个氨基酸组成，分子量为26KD的蛋白，Bcl-2主要定位于核膜的胞质层、内质网和线粒体的外 [77]膜，这与其在凋亡过程中行使功能有关。Bcl-2蛋白可表达于正常细胞的激活和发育过程中，在成熟组织中亦有表达，在走向凋亡的细胞中低表达或不表达。Bcl-2蛋白可存在于免疫、神经、内分泌系统等正常组织中，也可存在于人体多种形态的肿瘤组织中。 Bcl-2是在进化过程中高度保守的，功能也相对保守。最初人们认为Bcl-2促进细胞增殖和转化，但研究发现Bcl-2的功能是通过阻断程序性细胞死亡而促进细胞存活。由于Bcl-2能够抑制许多因素介导的程序性细胞死亡，从而引起极大的关注。大量实验研究表明Bcl-2调节细胞凋亡，但其作用机制却不清楚，并认为是多种途径的共同作用。一般认为与以下几方面有关:(1)通过拮抗另一原癌基因c-myc的致凋亡作用;(2)通过抑制活性氧(ROS)而抑制脂质过氧化物的产生，从而可抑制HO诱导的凋亡;(3)Bcl-222 2+可通过改变细胞内细胞器的Ca跨膜流动而抑制凋亡;(4) Bcl-2在核转运中可能起某些作用，Bcl-2可改变p53的核,胞浆转运。Bcl-2与编码p53基因的共表达延缓p53诱导的凋亡。对Bcl-2家族蛋白信号通路的上游机制知之甚少。但组织器官的正常发育 -2的活性是被精确调控的，细胞生存因子及某些细胞外应激均可能参过程确实表明Bcl 与了Bcl-2的激活。对Bcl-2通路的下游机制转导也同样不清楚。已知Bcl-2可抑制许多刺激诱导的细胞凋亡，如TNF-а,FasL、p53或c-myc的激活、活性氧、热休克、钙离子、射线、甾体激素、各种化疗药物等。Bcl-2是如何影响如此众多不同的死亡信号转导呢,鉴于各种因素诱导的细胞凋亡几乎都有相似的形态学和生化改变，人们推测不同的细胞死亡信号转导路径最终将汇聚于一共同途径，而Bcl-2即可能作用于此汇聚点而阻止细胞凋亡的发生。不过这一假设尚缺乏足够的证据，而且Bcl-2也不能抑制所有的细胞凋亡。 Bcl-2的表达水平能影响Fas敏感细胞的凋亡控制。但是否Bcl-2必不可少的影响 30 Fas介导的凋亡仍有争议。在某些细胞系Bcl-2或其相关蛋白确实提供强有力的保护来 [78]反对Fas介导的凋亡，而在另外一些细胞系Bcl-2完全不起作用。 本课题通过免疫组化染色发现，失神经后萎缩骨骼肌细胞中Fas基因蛋白的表达明显增加，Bcl-2基因蛋白的表达明显减少。由此认为，大鼠骨骼肌失神经支配后，可能是由于Fas表达的增高诱导了肌细胞的凋亡，Bcl-2表达减少，使抑制细胞凋亡的作用减弱，两者协同作用导致细胞凋亡加强。胫神经损伤后引起腓肠肌萎缩过程中发生的细胞凋亡与Fas被激活有关。服用复方太子参颗粒后，Fas染色阳性光密度较对照组明显降低，Bcl-2染色阳性光密度较对照组明显升高，说明复方太子参颗粒抑制失神经后骨骼肌细胞凋亡的作用可能与这种药物抑制了肌细胞中Fas的表达，并且促进了Bcl-2的表达有关。复方太子参颗粒对大鼠胫神经损伤后腓肠肌萎缩具有延缓作用可能与此有关。 大量研究表明，自由基可以诱导细胞凋亡，缺血缺氧也可诱导细胞凋亡。骨骼肌失神经支配后，肌肉活动丧失，血液在静脉内郁积，再加上肌纤维间、肌束间胶原纤维的增生，影响了肌肉组织的微循环，致失神经肌肉组织缺血、缺氧，氧自由基生成增多。氧自由基及缺血缺氧引起细胞凋亡的分子机制的研究才刚刚起步，尚有许多问题有待探讨。复方太子参颗粒抑制肌细胞凋亡也可能与其组成中药白芍、黄芪、炙甘草、当归、制首乌等增加SOD含量，升高SOD活性，抗氧化，清除自由基有关;还可能与白芍、川芎、黄芪、当归、制首乌等扩张血管，改善微循环，增加组织供氧有关。 5.2抑制失神经支配骨骼肌胶原纤维的形成 胶原主要由成纤维细胞合成并分泌，作为细胞外基质成分，是结缔组织的主要蛋白成分，在细胞的发生、发育以及整个生命周期中起着重要作用。依据分子组成的不同，目前发现的胶原至少有15种类型。I型胶原主要存在于骨、肌腱、牙釉质及皮肤中;III型胶原主要存在于皮肤、血管、子宫内膜等组织发生的早期;有些组织中I型、III型胶原可同时存在，如骨骼肌组织同时含有I、III、IV、V型胶原，其中I、III型胶原含量最丰富。胶原中的一半位于肌内膜和肌束膜中。正常骨骼肌肌内膜和肌束膜中主要含有I型、III型胶原;肌肉中IV型、V型胶原主要见于肌纤维基底膜及血管基底膜上。I型胶原形成致密的长束状，而III型胶原形成疏松的网状，故骨骼肌的弹性和抗应力性都很好。在骨骼肌组织中，胶原作为其组织连接的主要结构成分具有重要功能:它形成原纤维使骨骼肌细胞彼此相连，也使骨骼肌细胞与肌腱、筋膜组织相连接;另外，它对肌肉细胞、毛细血管及神经有支持作用;它还与肌肉的机械性质及粘弹性有关。 骨骼肌中结缔组织具有转运肌纤维的代谢物质，传输肌纤维的收缩力，为肌肉组织的修复和再生提供支架等作用。然而若过量增生将导致肌肉纤维化，毛细血管及其它小血管被多层的致密胶原围绕，使其与相邻肌纤维分离，影响血管床和肌纤维间的物质交 31 换。增生的胶原纤维是再生神经重新支配骨骼肌的一个物理屏障，阻碍再生神经纤维无 [79]法与变细的骨骼肌纤维接触，造成失神经骨骼肌功能恢复不佳。而胶原是肌肉结缔组织中最主要的蛋白，因此控制失神经骨骼肌内胶原等结缔组织增生是维护失神经肌肉功能的重要方面。I型胶原为一种硬胶原，它的显著增生可导致骨骼肌的顺应性和弹性降 [45,46,80,低，影响神经再支配后肌肉的功能。 无论是肌源性还是神经源性的肌肉疾病，其特征均为肌肉组织间隙胶原的过度积累 [45]导致肌肉组织的纤维化而明显影响肌肉收缩功能。在骨骼肌损伤后的修复过程中，早期的肉芽组织因其I型胶原含量少而较脆弱，容易发生再断裂。重复的断裂会导致肌肉 [81]中纤维疤痕组织的过度形成，阻碍肌纤维的再生，从而影响肌肉功能的恢复。 骨骼肌失神经后，胶原合成酶脯氨酸-4-羟化酶(prolyl-4-hydroxyloase,PH)、半乳糖—羟赖氨酸—葡萄糖转移酶(galctosyl-hydroxylysyl glucosyl transrerase,GGT) 的活性成倍上升，而且羟脯氨酸的含量也成倍升高，并见肌内膜、肌束膜及基底膜增厚， [45,46,80,[46]染色反应增强。国内有学者也观察到I型、IV型胶原随失神经时间的延长而增加。 骨骼肌长期失神经支配，不仅可出现广泛的间质纤维化，肌肉内成纤维细胞增殖，分泌胶原纤维增多并沉积，而且肌纤维可变性并被纤维组织代替。在伴有血管损伤或缺血时，肌肉出现纤维化，挛缩更广泛，更严重，原因在于肌纤维缺血可导致肌肉的大片 [82]坏死，加快了纤维化进程，肌肉内广泛间质纤维化，可使肌肉挛缩。 从表5、6可以看出，复方太子参颗粒可以显著抑制失神经支配骨骼肌胶原纤维的形成，但对胶原代谢的具体影响机制尚不清楚。可能与复方太子参颗粒促进局部血管扩张有关，它增加了肌肉的氧和营养，从而抑制了胶原增生。抑制了胶原纤维的形成，就消除了再生神经纤维与萎缩骨骼肌之间，血管床与萎缩肌纤维之间的物理屏障，有利于肌肉功能的恢复。 5.3抑制失神经支配骨骼肌蛋白质的分解 2+经研究发现，骨骼肌细胞内存在着4种蛋白降解途径，即溶酶体途径、Ca-依赖途径、非ATP依赖途径和依赖ATP-泛素-26s蛋白酶复合体途径。骨骼肌蛋白质特别是肌 [83]2+纤维蛋白质的降解主要是通过依赖ATP-泛素-26s蛋白酶复合体途径实现的，Ca-依赖途径也参与失神经肌萎缩的骨骼肌蛋白质的降解。 [84]Wing等认为失神经后蛋白质的迅速减少是由于非溶酶体ATP依赖性蛋白水解过程加快造成的。他用特异性多克隆抗体检测了泛素结合蛋白在萎缩肌肉中的量，发现有 [85]明显升高，证实蛋白降解与泛素降解通路有关。Medina等研究发现大鼠比目鱼肌去神经后一天内蛋白水解增加50%—250%，同时泛素蛋白及其mRNA增加2-3倍,因此认为骨 2+骼肌的快速萎缩与失神经后大量加强的蛋白水解作用有关。阻止溶酶体或Ca-依赖性途 32 径并不能阻止肌肉蛋白水解，而依靠ATP供能的泛素途径在细胞蛋白降解中发挥重要作 [86]用。Bockowski等发现失神经后肌肉氧化和糖酵解活动减弱,蛋白质和嘌呤降解加快,肌肉对胰岛素抵抗作用增加。 [87]缩时发现并命名。肌球蛋白是一种马达蛋白，由Kuehne于1864年在研究骨骼肌收 肌球蛋白是长形不对称分子，形状如“Y”字，长约160nm。电子显微镜下观察到它含有两条完全相同的长肽链和两条短肽链，组成两个球状头部和一个长杆状尾部。长肽链称重链，短链称轻链。肌球蛋白以聚合形式参与细胞生理过程，单个的肌球蛋白分子没有功能。肌球蛋白通过组装域自我组装成具有双极性的粗丝，对其实现合适的功能至关重要。肌球蛋白属球蛋白类，不溶于水而溶于0.6mol/ml KCl或NaCl溶液。它具有酶活性，通过与肌动蛋白相互作用，水解ATP的末端磷酸基团，同时也能水解GTP、CTP等， [88]将化学能转化为机械能，从而产生各种形式的运动。肌球蛋白作为细胞骨架的分子马达，是一种多功能蛋白质，其主要功能是为肌肉收缩提供力。 纤丝滑动学说认为肌肉收缩是由于肌动蛋白细丝与肌球蛋白粗丝相互滑动的结果。在肌肉收缩过程中，粗丝和细丝本身的长度都不发生改变，当纤丝滑动时，肌球蛋白的头部与肌动蛋白的分子发生接触、转动，最后脱离的连续过程，其结果使细丝进行相对的滑动。关于肌丝滑动的分子机理，有经典的摆动横桥模型，及新近出现的摆动杆臂模型和线形马达模型学说。然而，至今尚无一种比较完善的，能普遍被人们接受的理论以解释肌丝滑动的原理。但可以肯定的是，肌动蛋白、肌球蛋白的减少，必然会引起肌肉收缩能力的下降。 从表2可以看出，大鼠骨骼肌失神经支配后蛋白质含量下降明显，服用复方太子参颗粒后蛋白质含量下降速度减缓，即复方太子参颗粒明显抑制了肌肉蛋白质的丧失，故其能够抑制肌肉蛋白质的分解。从表7、8可以看出，失神经后肌动蛋白、肌球蛋白阳性染色变浅，横纹模糊甚至消失，肌动蛋白、肌球蛋白的表达逐渐减少。复方太子参颗粒能显著减缓肌动蛋白、肌球蛋白的表达的下降，从而减缓了肌肉的萎缩。所以复方太子参颗粒可以抑制失神经支配骨骼肌蛋白质的分解，从而延缓了肌肉的萎缩。有大量肌球蛋白、肌动蛋白存在，就有了肌肉收缩的物质基础，对肌肉功能的恢复有重要的价值。 5.4改善失神经支配骨骼肌的微循环 横纹肌具有丰富的血液供应，其收缩活动依赖于能量的供给及代谢物质的不断清除。运动时肌肉收缩的能源，氧的供给发挥重要的作用。肌肉所需的氧的运输，是由血液中的血红蛋白来完成的，所以运动中肌肉的血流量是相当重要的。与肌肉血流量相关的重要因素之一是肌纤维中毛细血管分布的密度。一般认为，工作状态下骨骼肌的氧消耗量达到全身组织的第二位，每根肌纤维周围都有一个网状的毛细血管围绕之，即使短期阻断骨骼肌的正常血供，都会对肌细胞造成严重的损害。骨骼肌内毛细血管的这种空 33 间分布模式控制着组织的氧供给。氧对维持细胞功能来说非常重要，有氧代谢可产生维持细胞功能的高能磷酸键。当组织缺氧时，细胞新陈代谢变为无氧代谢，乳酸聚集，使正常的细胞酶动力学发生改变，同时细胞内储存的能量尤其高能磷酸键消耗，细胞功能失调，直至发生不可逆损伤，最终导致细胞死亡。 结构是功能的基础。肌间隙的毛细血管分布，是局部血运及营养供应的保障，防止肌纤维变性与坏死，也提供了神经再生和再支配适宜的微环境。正常骨骼肌的血液供应与肌肉的代谢及功能状态相适应，这种调节是通过机体的神经体液调节及局部代谢产物量来实现的。肌肉细胞不断调节其能量产量以满足需要，这种调节包括潜在能量的转化，这些潜在能量存在于糖和脂肪中，经各种代谢途径产生ATP，ATP是唯一可被收缩蛋白质利用的高能化合物。在线粒体内存在多种代谢途径，它们都需要氧气才能完成能量从食物到ATP的转化。安静时，骨骼肌收缩蛋白处于非活动状态，维持细胞稳态只需最低限度的能量;在肢体活动时，收缩蛋白被激活而做功，肌细胞内产生更多的能量，以满足新的能量需要。氧气是呼吸链的最终电子受体，必须有氧气存在线粒体才能产生ATP。线粒体是细胞内供能器，它的主要功能是把ADP磷酸化成ATP，供给肌纤维收缩时所需的能量。线粒体的基质中存在着大量的三羧酸循环酶和β-氧化酶，在线粒体嵴的内表面附着有许多有柄的小球，这里有电子传递和氧化磷酸化的酶系统，它们按一定的顺序排列在膜上，以保证生物氧化反应有条不紊地在膜上进行。嵴的减少意味着能够固着生物氧化的酶系统表面积减少，不利于能量的转换和积累。正常骨骼肌内毛细血管周围的肌膜下有线粒体聚集现象，这样便于氧从血液直接而快速地到达肌纤维线粒体。 骨骼肌失神经支配后骨骼肌的变化过程是复杂的，除了有肌纤维的萎缩外，其血管床亦有显著的变化。骨骼肌失神经支配后，肌肉活动丧失，肌肉的正常舒缩活动对血液回流的“泵样”挤压作用消失，血液在静脉内发生郁积，组织液渗出增加;加上肌肉活动产生的代谢产物乳酸等在局部堆积等，肌肉的血液供应及营养发生障碍。失神经后，毛细血管退化和丧失的速度较肌纤维丧失的速度快，这样将导致失神经肌肉毛细血管数与肌纤维数的比例下降。同时，肌肉微血管的解剖模式将发生巨大变化:正常肌肉的每根肌纤维直接接受3—5根毛细血管的供应，长期失神经肌肉的一组肌纤维仅有一根毛细血管供血，而且这些肌纤维被密集的胶原所阻隔，甚至形成骨骼肌内血管完全缺如区。血管床的重新构建将影响氧的代谢，同时损害微循环。不充足的血液供应及大量的胶原 [89][90]聚集，可能是阻止长期失神经肌肉神经再支配的重要原因。Borisov等研究表明失神经后毛细血管/肌纤维比的进行性下降，至少是造成现存肌纤维坏死的原因之一。 本研究中，HE光镜观察见实验组毛细血管明显较对照组数量多，管腔大。这样就提高了骨骼肌的血流量和相应的增加了骨骼肌的氧流量。透射电镜下超微结构观察，实验组肌细胞间隙的毛细血管数量较多，线粒体肿胀轻，肌丝、肌节排列较整齐。对照组毛 34 细血管变形严重，管腔模糊、狭窄，肌丝、肌节排列不整齐，线粒体嵴变短、减少或消失明显。这表明失神经后萎缩骨骼肌血液循环欠佳，而复方太子参颗粒改善了失神经肌肉的微循环，从而为肌肉代谢和功能活动提供更多的氧和营养物质，有效防止了缺氧引起的细胞损害，保证肌细胞正常功能的发挥。 综上所述，随着失神经时间的延长，肌肉萎缩加重，肌肉体积减小，肌湿重下降，作为骨骼肌收缩蛋白和结构蛋白的肌球蛋白和肌动蛋白表达显著减少，削弱了肌肉收缩功能的物质基础;与肌肉收缩力大小成正比例关系的肌纤维直径、肌纤维截面积的减小，预示着萎缩骨骼肌肌力的必然下降;而引起肌肉组织纤维化，阻碍再生神经纤维对肌纤维的再支配及阻碍血运对骨骼肌的供给的胶原纤维的大量增生，将严重影响萎缩骨骼肌的功能恢复;肌细胞凋亡的出现并逐渐加重，促进细胞凋亡的Fas基因蛋白的表达持续增高，及抑制细胞凋亡的Bcl-2基因蛋白的表达减少，终将失神经支配骨骼肌的萎缩引向不可逆性的方向。所以失神经时间越长，萎缩越严重，神经再支配后肌肉功能恢复的可能性越小。因此，周围神经损伤后，手术修复越早，周围神经的连续性越早建立，则神经再支配肌肉的时间就可能越早，骨骼肌功能的恢复就可能越好。 小 结 复方太子参颗粒虽不能最终改变失神经后肌肉萎缩的发展方向，但可以延缓肌肉萎缩的进程，为神经再生和肌肉功能恢复创造条件。 1.失神经支配后骨骼肌的萎缩与骨骼肌细胞凋亡有关。凋亡相关基因Fas表达增高，Bcl-2表达减少在骨骼肌细胞凋亡的发生机制中起着重要作用。 复方太子参颗粒可以延缓失神经支配骨骼肌的萎缩，它可能是通过以下几个途径2. 实现的:(1)抑制失神经支配后骨骼肌萎缩时肌细胞的凋亡;(2)抑制失神经支配后骨骼肌萎缩时肌组织中胶原纤维的形成;(3)抑制失神经支配后骨骼肌萎缩时肌肉蛋白质的分解;(4)改善失神经支配萎缩骨骼肌的微循环。 3.周围神经损伤后，周围神经手术修复越早，术后功能恢复越好。 失神经骨骼肌萎缩的防治日益被广大外科医师重视，该问题的解决将大大提高神经损伤的治疗效果及受累肌肉的功能恢复，尤其在手内在肌的功能维持方面有着重大意义。失神经支配骨骼肌萎缩机制的研究已经呈多角度多方面展开，但目前仍不能明确在整个失神经肌萎缩的发生中，是各种因素共同起作用，还是其中个别因素起主导作用，还是有其它的原因，这些需待深入的研究。尽管国内外的研究均证实失神经骨骼肌萎缩与细胞凋亡相关，细胞凋亡导致了骨骼肌的萎缩，但其确切的途径和机制尚不完全清楚。对骨骼肌细胞凋亡进行检测有助于判断神经修复手术的效果和预后情况,从而进一步指 35 导手术方案的制定。然而目前客观指标即细胞凋亡程度和肌肉萎缩可逆性之间的关系需要进一步研究。 对于复方太子参颗粒对失神经支配骨骼肌萎缩的影响表明，复方太子参颗粒作为一种经济易得的药物，可能对于临床治疗周围神经损伤，防治失神经支配骨骼肌萎缩，从而促进肢体功能的恢复，提供一种简单、经济、有效的方法，尤其在手内在肌的功能维持方面有着重大意义，能产生良好的经济效益和社会效益，应用前景广阔。复方太子参颗粒延缓失神经支配骨骼肌萎缩的具体作用机制仍需进一步研究。本课题观察时间较短，对于长期失神经支配骨骼肌萎缩应用复方太子参颗粒的疗效，也需进一步探讨。目前关于细胞凋亡的通路，细胞凋亡相关基因的调节，细胞凋亡的影响因素研究的越来越深入，复方太子参颗粒对细胞凋亡影响的具体机制还需深入的研究。 36 参 考 文 献 [1]Wong BJ,Crumley RL.Nerve wound healing.An overview.Otolaryngol Clin North Am(J),1995,28(5):881. 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