不同治则中药复方对胆汁淤积性肝纤维化大鼠PAI-1影响的研究

研究所)；Trizol Reagent(上海申能博彩生物科技 有 限 公 司 )；DEPC (Sigma)；AMV RT／PCRKit、DNA Marker(上海申能博彩生物科技有限公司)；琼脂糖 (Sig— ma)、氯仿、异丙醇 (上海试剂一厂)；UV-2102C分光光度 计 (尤尼克公司)；OLYMPUS-ix71显 微镜 (日本 OLYM— PUS公司)；低温离心机 (eppendorf公 司)；PCR仪 (BIO- RAD)；RNA／DNA calculator(Pharmacia)；凝胶 成像 系统 (上海四星生物技术有限公司)。 1．1．3 药物制备 二至丸出 自 《证治准绳》，由旱莲草、女 贞子等分组成 ，旱莲草、女贞子各 9g；失笑散出自 《太平惠 民和剂局方》，由五灵脂、蒲黄两味药物等份组成 ，五灵脂、 蒲黄各 6g组成 ；合方：由旱莲草、女贞子各 9g，五灵脂、蒲 黄各 6g。根据 《中药药理学研究方法学》[大鼠剂量一人剂量 ×35(人转换因子)／6(大鼠转换因子)]计算出人鼠等效剂 量二至丸为 1．75g·kg ·d- ，失笑散为 1．17g·kg · d- ，合方为 2．92g·kg_1·d ，均按传统制备成水煎 剂，减压浓缩分别至 1．75g／ml，1．17g／m|，2．92g／ml备用。 优思弗 (熊去氧胆酸)，Dr．Falk Pahrma GmbH产品，注册证 号：H20050181，购 自上海 中医药大学龙华医院，按同样方 法计算出人鼠等效剂量 58．3mg·kg ·d (所有药物制备、 质控由上海中医药大学附属龙华医院制剂中心完成)。 1．2 方 法 · 285 · 1．2．1 模型制备 参照文献 采用胆管结扎复制胆汁淤积性 肝纤维 化模 型。术 前禁 食 不禁 水 l2小时，盐 酸氯 胺 酮 100mg／kg肌肉注射麻醉，常规腹部皮肤消毒，沿腹正中线切 开皮肤，暴露胆总管，于远近端结扎胆总管，中间离断，关 腹；假手术组仅开腹暴露并游离胆总管不结扎，关腹。 1．2．2 动物分组及给药 SD大 鼠 7O只，假手术组 1O只， 其余 6O只为造模组 ，造模 1周后，造模组随机分为模型组 (12只)，优思弗、二至丸、失笑散及合方组各 1O只。术后 1 周开始各治疗组分别给予相应药物灌 胃，1次／d，共计 3周； 假手术组与模型对照组以同体积生理盐水灌胃。4周末以盐酸 氯胺酮腹腔注射麻醉 (2ml／kg)，腹主动脉采血，处死全部实 验动物，分离血清，一80。C保存备用。摘取肝脏称重后，于 肝右叶切取 1．0cm×1．0cm大小肝组织 2块，4 中性甲醛溶 液固定。 1．2．3 指标检测 1．2．3．1 一般情况 包括精神状态、活动情况、皮毛光泽 度、食量、大小便情况等。 1．2．3．2 肝 脏形态 包括肝脏 的重 量 、外形 、色泽 、质地 。 1．2．3．3 生化指标测定 ALT、AST、TBil、ALP按试剂盒 说明书所示方法测定。 1．2．3．4 病理学检测 HE染色、胶原纤维染色 (天狼猩红 染色)、肝纤维化程度分级：汇管区纤维组织无增生为 “ 一 ” ；增生后面积 占肝小 叶 1／3以下 为 “+”；占肝 小 叶 1／3 ～ 2／3为 “++”；占肝小 叶 2／3以上 为 “+ ++”。每个 “+”记 1分 ，每个标本记总分。积分越高，表明肝脏纤维化 程度及病理损害越重。 1．2．3．5 RT-PCR法检测肝组织 PAI-lmRNA表达 提取经 一 8O℃保存 的大鼠肝组织标本，匀浆后用上海申能博彩生物 公司的 TRIZOL试剂抽提总 RNA。采用分光光度法测定提取 的总 RNA含量及纯度 ，OD260／OD280在 1．8～2．0之间。引 物由上海申能博采生物科技有限公司合成，上游引物 GTG GTT CGG CAC AAT CCA ACA GAG，下 游引物 GCA ATG GAG GAC GAT ACA AGA GGT， actin上 游 TGT GAT GGT GGG TAT GGG TCA GAA G，t?-actin下游 TCA CGG GTT GGC CTT AGG GTT CAG AG；PCR扩增 ：49gl体系： 1 strand eDNA 5 1，10X PCR Buffer 5 1，dNTP lgl，目的基 因正负链各 2gl，3-actin正 负链各 2gl，H2O 29gl，Taq酶 1／A；PCR循环条件：95℃预变性 5分钟，95℃ 3O秒，6O℃ 4O秒，72℃ 1分钟，3O次循环，72℃ 1O分钟。PCR产物加 样于 2 琼脂糖凝胶，电泳，紫外灯下观察，凝胶系统拍 照，计算机图像扫描和吸光度值分析，从而得到 PAI-1／13- 维普资讯 http://www.cqvip.com · 286· 中西医结合肝病杂志2007年第 17鲞箍 塑 表 1 不同治则中药复方对模型大鼠肝功能的影响 ( ± ) 与模型组比较，*P(0．05，#P(0．01；与优思弗组比较·AP(0．05，AP(0．01 表 2 不同治则中药复方对模型大鼠纤维化程度的影响 (x+s) 与模型组、优思弗比较，#P 0．05)。 2．2 肝脏形态变化 假手术组肝脏表面光滑，呈红褐色，质 地软。模型组大鼠肝脏体积增大，表面黄染，质地较硬。3个 中药复方组大鼠肝脏体积较模型组小，表 面较模型组光滑。 优思弗组肝脏肉眼观察与模型组无明显区别。 2．3 不问治则中药复方对模型大鼠肝功能的影响 见表 1。 2．4 不 同治则 中药复 方对模 型 大 鼠肝 组 织病理 的影 响 HE 染色显示，假手术组大鼠肝小叶结构清晰，肝细胞索排列整 齐，呈放射状，肝窦正常，胞核结构清晰。模型组大鼠肝脏 内小胆管大量增生，以汇管区为中心呈放射状向肝实质内延 伸，增殖的胆管呈花环样，胆管上皮细胞周围有肌成纤维细 胞的聚集和细胞外基质的沉积；肝细胞与增生的胆小管相 比 明显减少，剩余肝细胞的形态结构尚正常。与模型组比较，3 个中药组小胆管增生较模型组明显减少，剩余肝细胞量较多； 合方组较两个中药单方组病理改变轻，失笑散组和二至丸组 无明显差异；优思弗组胆管增生无明显减少 ；模型及药物组 的炎症及坏死均不明显。肝组织纤维化程度计分评定结果 (见表 2)。 2．5 不同治则中药复方对模型大鼠肝组织 PAI—lmRNA表达 的影响 RT—PCR检测显示 ：假手术组肝组织 PAI-lmRNA 表达较低 ，与假手术组 比较，模型组 PAI—lmRNA表达显著 增强 (P