· 284· 中西医结合肝病杂志2007年箜 !鲞筮 塑
不同治则中药复方对胆汁淤积性肝纤维化大鼠 PAI一1影响的研究
郑培永 安德明 季 光
1。上海中医药大学脾胃病研究所 (上海,200032) 2.甘肃省中医院消化内科
摘 要 目的:观察补益肝 肾、活血化瘀方荆二至丸、失笑散及其组合对胆 汁淤积性肝纤维化大鼠肝组织 PAI—
lmRNA的影响。方法:采用胆管结扎复制胆汁淤积性肝纤维化模型。术后 1周,造模组随机分模型组、优思弗、二至丸、
失笑散及舍方组;各药物干预组分别给予相应药物灌胃,模型组和假手术组给予等量生理盐水灌胃,至 4周末处死全部
动物取材。观察
包括一般情况、肝功能(ALT、AST、ALP、TBil)、肝组织病理、PAI—lmRNA表达。结果:与假手术组
比较,模型组大鼠 ALT、AST、ALP、TBil、纤维化程度均显著升高;与模型组比较,3个复方均能降低胆汁淤积性肝纤维
化大鼠血清 ALP、ALT、AST水平(P
工艺制备成水煎
剂,减压浓缩分别至 1.75g/ml,1.17g/m|,2.92g/ml备用。
优思弗 (熊去氧胆酸),Dr.Falk Pahrma GmbH产品,注册证
号:H20050181,购 自上海 中医药大学龙华医院,按同样方
法计算出人鼠等效剂量 58.3mg·kg ·d (所有药物制备、
质控由上海中医药大学附属龙华医院制剂中心完成)。
1.2 方 法
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1.2.1 模型制备 参照文献 采用胆管结扎复制胆汁淤积性
肝纤维 化模 型。术 前禁 食 不禁 水 l2小时,盐 酸氯 胺 酮
100mg/kg肌肉注射麻醉,常规腹部皮肤消毒,沿腹正中线切
开皮肤,暴露胆总管,于远近端结扎胆总管,中间离断,关
腹;假手术组仅开腹暴露并游离胆总管不结扎,关腹。
1.2.2 动物分组及给药 SD大 鼠 7O只,假手术组 1O只,
其余 6O只为造模组 ,造模 1周后,造模组随机分为模型组
(12只),优思弗、二至丸、失笑散及合方组各 1O只。术后 1
周开始各治疗组分别给予相应药物灌 胃,1次/d,共计 3周;
假手术组与模型对照组以同体积生理盐水灌胃。4周末以盐酸
氯胺酮腹腔注射麻醉 (2ml/kg),腹主动脉采血,处死全部实
验动物,分离血清,一80。C保存备用。摘取肝脏称重后,于
肝右叶切取 1.0cm×1.0cm大小肝组织 2块,4 中性甲醛溶
液固定。
1.2.3 指标检测
1.2.3.1 一般情况 包括精神状态、活动情况、皮毛光泽
度、食量、大小便情况等。
1.2.3.2 肝 脏形态 包括肝脏 的重 量 、外形 、色泽 、质地 。
1.2.3.3 生化指标测定 ALT、AST、TBil、ALP按试剂盒
所示方法测定。
1.2.3.4 病理学检测 HE染色、胶原纤维染色 (天狼猩红
染色)、肝纤维化程度分级标准:汇管区纤维组织无增生为
“
一
” ;增生后面积 占肝小 叶 1/3以下 为 “+”;占肝 小 叶 1/3
~ 2/3为 “++”;占肝小 叶 2/3以上 为 “+ ++”。每个
“+”记 1分 ,每个标本记总分。积分越高,表明肝脏纤维化
程度及病理损害越重。
1.2.3.5 RT-PCR法检测肝组织 PAI-lmRNA表达 提取经
一 8O℃保存 的大鼠肝组织标本,匀浆后用上海申能博彩生物
公司的 TRIZOL试剂抽提总 RNA。采用分光光度法测定提取
的总 RNA含量及纯度 ,OD260/OD280在 1.8~2.0之间。引
物由上海申能博采生物科技有限公司合成,上游引物 GTG
GTT CGG CAC AAT CCA ACA GAG,下 游引物 GCA ATG
GAG GAC GAT ACA AGA GGT, actin上 游 TGT GAT
GGT GGG TAT GGG TCA GAA G,t?-actin下游 TCA CGG
GTT GGC CTT AGG GTT CAG AG;PCR扩增 :49gl体系:
1 strand eDNA 5 1,10X PCR Buffer 5 1,dNTP lgl,目的基
因正负链各 2gl,3-actin正 负链各 2gl,H2O 29gl,Taq酶
1/A;PCR循环条件:95℃预变性 5分钟,95℃ 3O秒,6O℃
4O秒,72℃ 1分钟,3O次循环,72℃ 1O分钟。PCR产物加
样于 2 琼脂糖凝胶,电泳,紫外灯下观察,凝胶分析系统拍
照,计算机图像扫描和吸光度值分析,从而得到 PAI-1/13-
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表 1 不同治则中药复方对模型大鼠肝功能的影响 ( ± )
与模型组比较,*P(0.05,#P(0.01;与优思弗组比较·AP(0.05,AP(0.01
表 2 不同治则中药复方对模型大鼠纤维化程度的影响 (x+s)
与模型组、优思弗比较,#P
0.05)。
2.2 肝脏形态变化 假手术组肝脏表面光滑,呈红褐色,质
地软。模型组大鼠肝脏体积增大,表面黄染,质地较硬。3个
中药复方组大鼠肝脏体积较模型组小,表 面较模型组光滑。
优思弗组肝脏肉眼观察与模型组无明显区别。
2.3 不问治则中药复方对模型大鼠肝功能的影响 见表 1。
2.4 不 同治则 中药复 方对模 型 大 鼠肝 组 织病理 的影 响 HE
染色显示,假手术组大鼠肝小叶结构清晰,肝细胞索排列整
齐,呈放射状,肝窦正常,胞核结构清晰。模型组大鼠肝脏
内小胆管大量增生,以汇管区为中心呈放射状向肝实质内延
伸,增殖的胆管呈花环样,胆管上皮细胞周围有肌成纤维细
胞的聚集和细胞外基质的沉积;肝细胞与增生的胆小管相 比
明显减少,剩余肝细胞的形态结构尚正常。与模型组比较,3
个中药组小胆管增生较模型组明显减少,剩余肝细胞量较多;
合方组较两个中药单方组病理改变轻,失笑散组和二至丸组
无明显差异;优思弗组胆管增生无明显减少 ;模型及药物组
的炎症及坏死均不明显。肝组织纤维化程度计分评定结果
(见表 2)。
2.5 不同治则中药复方对模型大鼠肝组织 PAI—lmRNA表达
的影响 RT—PCR检测显示 :假手术组肝组织 PAI-lmRNA
表达较低 ,与假手术组 比较,模型组 PAI—lmRNA表达显著
增强 (P