烟草染色体倍性快速鉴定方法下载_在线阅读_4

首页 > 烟草染色体倍性快速鉴定方法

is_434365

暂无简介

烟草染色体倍性快速鉴定方法农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology 2006,14 (2): 255~258 *基金项目：国家自然科学基金(No.39870421),国家烟草专卖局项目(No.G19990248)和浙江省重点科研项目(No.2003C22007)资助。作者简介:朱惠琴女，1969年生，硕士。 **通讯作者。 Author for correspondence. E-mail：. 收稿日期：2004-05-08 接受日期：2004-07-19 ·研究论文· 烟草染色体倍性...

农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology 2006,14 (2): 255~258 *基金项目：国家自然科学基金(No.39870421),国家烟草专卖局项目(No.G19990248)和浙江省重点科研项目(No.2003C22007)资助。作者简介:朱惠琴女，1969年生，硕士。 **通讯作者。 Author for correspondence. E-mail：. 收稿日期：2004-05-08 接受日期：2004-07-19 ·研究论文· 烟草染色体倍性快速鉴定方法 * 朱惠琴 1，2,张宪银 1,薛庆中 1** (1. 浙江大学农业与生物技术学院，杭州 310029; 2. 青海大学农牧学院，西宁 810003) 摘要:对两个杂交组合(G28 伊 NC2326和 K326 伊 Coker176) F1烟草 ( )花药培养诱导出 763个不同倍性植株。基于植株的花和种子结实率常规鉴定倍性水平比较，用气孔保卫细胞叶绿体数目预测植株倍性准确率达 93.52%。表明采用气孔保卫细胞叶绿体计数法可以在苗期快速、准确地确定植株染色体倍性。同时,在移栽前间接地鉴定、筛选出叶绿体数 <14的单倍体苗，作进一步秋水仙碱加倍处理，以减少对单倍体材料的浪费，加快 DH群体构建速度。关键词: 烟草；倍性；叶绿体；DH群体中图分类号: S184 文献标识码: A 文章编号: 1006-1304(2006)02-0255-04 Rapid Determination of Ploidy Level of Chromosome in Tobacco( ) ZHU Hui-qin1，2 , ZHANG Xian-yin1, XUE Qing-zhong1** ( ) The ploidy level of 763 anthers deirived from both crosses (G28伊NC2326 and K326伊Coker176) of tobbaco ( ) were determined. The result of identification by counting the number of stoma chloroplast in guard cell was consistent with those observations of flower and seed fertillity of the plants, with the average accurate rate of 93.52%, showing that measurement of the number of stoma chloroplast in guard cell could be considered as a fast and accurate method to determine haploid, diploid or poly- ploid of tobacco in the seedling stage. In order to reduce the waste of haploid plants and speed up establishment DH population, it was feasible to select out undoubted haploid plants with <14 chloroplast number in stoma treated with colchicine when young plantlets just transplanted in the field. tobacco; ploidy level ; chloroplast; DH population. 从烟草花药培养诱导的植株几乎全部是单倍体，通常需要对单倍体植株进行秋水仙碱处理，完成染色体的人工加倍。但如果加倍频率不理想时，通过对处理植株的染色体倍性早期快速鉴定，对尚未加倍的单倍体材料，继续加倍，是构建 DH群体十分重要的技术环节。传统的倍性鉴定是基于对根尖细胞染色体计数，但是，普通烟草染色体数多(2 =48)、且小，经药物处理后中期的染色体长度也仅为 2~4 滋m (Li, 1991)，制作细胞染色体制片需要相当熟练的实践技能，并且这种方法过程烦琐、费工费时。虽然已有其它替代鉴定方法的报道 (Chandler and Lyrene, 1982; Powell .,1988; Sari ., 1999)，但未曾作过大规模的筛选，其实用性尚待验证。本实验根据构建烟草 DH群体的需要，通过多种方法比较，重点探讨气孔保卫细胞叶绿体数目鉴定法应用价值，成功地构建了 2个 DH群体; 完善了烟草染色体倍性早期快速鉴定的方法。 1 材料和方法 1.1 供试品种在烟草 ( ) 现蕾期采集 G28伊 NC2326和 K326伊Coker176两组合 F1花蕾，取花药培养在 H培养基上(Bourgin and Nitisch，1967)诱发单倍体试管苗，小植株用秋水仙碱添加二甲基亚砜 (DMSO)进行加倍处理获得加倍单倍体植株，随后种植并观察加倍单倍体植株性状。 PDF 文件使用 "pdfFactory Pro" 试用版本创建 www.fineprint.cn 农业生物技术学报 2006 年图 1.烟草不同倍性植株的保卫细胞及其叶绿体 Fig.1. Stomata guard cells and their chloroplast at different ploidy levels in tobacco A.单倍体; B.二倍体; C.多倍体. A. Haploid; B. Diploid; C. Polyploid. 1.2 倍性鉴定方法对经过加倍处理的烟草，从第 4片真叶完全出现开始，撕取样叶的下表皮于载玻片上并滴加 10 000 mg/L的碘 -碘化钾(1颐3)染色，加盖玻片后，在 40伊的显微镜下计数保卫细胞内的叶绿体数；每叶片随机选取 5个气孔，观察叶绿体数目并计算平均数。在开花期观察不同倍性材料的开花及其结实情况并验证叶绿体鉴定结果。对各组合的单倍体、二倍体及多倍体材料按 1、 4、7、10和 13叶位的完全展开叶片分别取样，制片观测气孔叶绿体保卫细胞数目。 2 结果和分析 2.1 保卫细胞叶绿体数与染色体倍性的相关性不同组合和倍性间气孔叶绿体数目平均值及方差分析(表 1)显示：气孔保卫细胞叶绿体数目随倍性增加而增加，不同倍性烟草植株气孔保卫细胞叶绿体数目的平均值差异极显著( <0.01)，而不同组合同一倍性间差异不显著( >0.05)。因此，烟草植株气孔保卫细胞叶绿体数目平均值可以作为染色体倍性水平的鉴定依据(图 1)。烟草植株为异源四倍体，其染色体数为 2n=4x=48，单倍体的染色体数 n=24；烟草加倍单倍体气孔保卫细胞叶绿体数平均为 21.28，单倍体为 11.02，多倍体为 32.25(表 1)，加倍单倍体和单倍体气孔保卫细胞叶绿体平均值之比为 1.9颐1，通过字2 检验，符合二倍体和单倍体 2颐1比例。 2.2 利用保卫细胞叶绿体计数法鉴定倍染色体性对 763个花粉植株，显微镜统计第 4叶气孔保卫细胞叶绿体数目，以预测染色体倍性结果(表 2)。与常规花和育性差异鉴定倍性的方法比较，用气孔保卫细胞叶绿体数目鉴定植株倍性的准确率达 93.52%。G28伊NC2326和 K326伊Coker176组合的准确率分别为 95.45%和 92.11%，说明该方法应用于烟草染色体鉴定非常有效。表 1 烟草不同倍性植株气孔叶绿体数的比较 Table 1 Comparisons of stomata guard cells and their chloroplast at different ploidy levels in tobacco 不同字母表示平均值在 5%或 1%水平差异显著。Different letters show significant differences between mean values according to Duncan significance test at 5% or 1% level. 2.3 不同叶位对保卫细胞叶绿体数的影响对 1、4、7、10和 15叶不同叶位气孔保卫细胞叶绿体的测定结果表明，除第 1叶外，第 4、7、10和 15 叶气孔保卫细胞叶绿体数的平均数非常接近(表 3)。由此可见，取第 4叶或以上叶片进行鉴定，其结果稳定可靠；以 4叶以下作鉴定材料，倍性单株间差异显著，鉴定误判率达 45%左右；同时，4叶以下的组织太幼嫩难于制片观察。故本实验采用第 4叶统计气孔保卫细胞叶绿体数目作鉴定，并据此构建 DH群体。 2.4 不同倍性植株气孔叶绿体数的分布对单倍体，二倍体和多倍体植株气孔保卫细胞叶绿体数分布字2 检验，分别近似符合 N (11.01， 2.98)，N (21.28，4.74)，N (32.25，4.94)的正态分布(图 2)。其中，单倍体叶绿体数多分布在 6~13，二倍体多分布在 12~26，多倍体大多分布在 21~38范围内。因此，将叶绿体数 12、26和 32确定为区分单倍体、二倍体、多倍体的染色体倍性指标(表 4)。虽然少量植倍性水平组合 Crosses 平均值 Ploidy levels G28伊NC2326 K326伊Coker176 Average 单倍体 Haploid 12.6 9.43 11.02aA 二倍体 Diploid 20.96 21.6 21.28bB 多倍体 Polyploid 32.34 32.15 32.25cC 256 PDF 文件使用 "pdfFactory Pro" 试用版本创建 www.fineprint.cn 第 2期朱惠琴等：烟草染色体倍性快速鉴定方法组合 Crosses 表 2用保卫细胞叶绿体计数鉴定倍性水平的准确率 Table 2 Accuracy of determination ploidy levels by the count of chloroplast number of stomata guard cells in tobacco 表 3烟草不同倍性植株不同叶位气孔保卫细胞叶绿体数 Table 3 Stomata guard cell chloroplast number of leaf position at different ploidy levels in tobacco 表 4烟草不同倍性植株气孔叶绿体数分布频率 Table 4 Destribution frequencies of stomata chloroplast number at different ploidy levels in tobacco 叶绿体计数鉴定花和育性鉴定 By conting chloroplast By observing flower and fertility 单倍体二倍体多倍体单倍体二倍体多倍体 Haploid Diploid Polyploid Haploid Diploid Polyploid G28伊NC2326 428 206 154 58 199 147 54 95.45 K326伊Coker176 335 243 38 27 232 351 24 92.11 Total 763 449 192 85 431 182 78 93.78 准确率 /% Accuracy 叶位保卫细胞数平均值变幅变异系数 /% Leaf positions No.of guard cells Average Ranges CV 单倍体 Haploid 1 1334 7.89 4~14 30.53 4 840 11.02 4~16 17.32 7 750 11.56 4~18 17.65 10 735 11.88 4~18 17.32 15 724 12.01 6~19 18.00 二倍体 Diploid 1 440 18.92 12~27 28.46 4 702 21.28 14~28 8.09 7 125 21.96 12~26 8.78 10 205 21.83 16~26 8.96 15 100 22.33 16~26 8.96 多倍体 Polyploid 1 56 28.32 22~36 26.65 4 45 32.25 26~42 11.55 7 50 32.75 26~38 11.34 10 32 33.02 27~43 11.96 15 35 33.95 27~46 11.01 株各倍性间叶绿体数出现一定程度的重叠(图 2)，但只要计数足够多，其准确率相当高。本实验中每单株平均计数 80个气孔。倍性水平叶绿体数 Chloroplast number Ploidy levels <12 12~13 14~15 16~17 18~20 21~25 26~29 >30 单倍体 Haploid 68.96 27.94 3.1 0 0 0 0 0 二倍体 Diploid 0 2.12 5.67 15.6 55.95 17.63 3.03 0 多倍体 Polyploid 0 0 0 0 0 4.79 12 83.21 3 讨论有关染色体倍性鉴定通常有直接和间接鉴定两类方法。采用根尖压片法对染色体直接计数，是最精确和应用最早的方法 (Li, 1991)，但这种方法要求具有相当熟练的实验技能及一定的实验室设备。某些作物的染色体数目多或本身很小给直接计数带来困难，通过形态学性状作间接鉴定则所需时间较长。目株数 Plant No. 257 PDF 文件使用 "pdfFactory Pro" 试用版本创建 www.fineprint.cn 农业生物技术学报 2006 年前借助流式细胞分析仪(Flow Cytometry)识别染色体倍性，只需提取少量 DNA，在苗期即可鉴定(De Laat ., 1987)，但由于需要昂贵的仪器设备且较高费用，其应用的范围受到很大限制。而测量气孔大小和保卫细胞叶绿体数目则简单、省力(Chandler and Lyrene，1982)，但以气孔长度进行倍性分类的误判率高(Ho ., 1990)。在不同倍性植株间，气孔大小特别是气孔长度的差异小于气孔保卫细胞叶绿体数，以保卫细胞叶绿体数为基础的倍性鉴定，也是一种快速、简便的鉴定方法(刘仁祥和黄莺, 1998)，但有重叠情况的发生(Powell ., 1988)，故其实用性尚待进行验证。本研究较系统比较了单倍体，二倍体及多倍体植株气孔保卫细胞叶绿体数及其变异，通过大规模的验证表明，利用气孔保卫细胞叶绿体计数法间接鉴定，结果和田间结实情况的吻合率在 93%以上；我们确认气孔保卫细胞叶绿体计数是判定烟草倍性水平的一种有效方法，处理一份材料仅需 1~2 min，而且对于未加倍成功的材料，可及早采取补救措施提高对材料的利用率，能够满足鉴定大量处理材料，筛选足够数量的加倍单倍体来构建 DH群体。作者还提出在移栽前，将叶绿体数 <14的单倍体苗筛选出，继续加倍处理，以减少对单倍体材料的浪费，加快 DH群体构建速度。参考文献 Bourgin J P and Nitsch J P. Production of haploid Nicotiana from excised stamens (J). , 1967, 9:377~382 Chandler C K and Lyrene P M. Relationship between guard cell length and ploidy in (J). , 1982,17: 53~54 De Laat A M M, G hde W and Vogelzang M J D C. Determi- nation of ploidy of single plants and plant populations by flow cytometry(J). , 1987, 99: 303~307 Ho I, Wan Y, Widholm J M and Rayburn A L. The use of stomata chloroplast number for rapid determination of ploidy level in maize(J). , 1990, 105, 203~210 Li M X (李懋学). Plant Chromosome Research Technology(M). Harbin: Harbin Northeast Forestry University Publishing House, 1991. Liu R X (刘仁祥 ) and Huang Y (黄莺 ). Early, quick determination of chromosomes polyploid of anther culture derived of tobacco plant (J). (贵州农业科学),1998. 26(6)：4~7 Powell W, Borrino E M and Goodall V. The effect of anther orientation on microspore-derived plant production in barley ( L.) (J). , 1988, 38,159~163 Sari N, Abak K and Pitrat M. Comparison of ploidy level screening methods in watermelon: (Thunb.) Matsum and Nakai (J). , 1999, 82: 265~277 图 2.烟草不同倍性植株气孔叶绿体数分布 Fig. 2. Distribution of stomata chloroplast number at different ploidy level plants in tobacco 258 PDF 文件使用 "pdfFactory Pro" 试用版本创建 www.fineprint.cn

本文档为【烟草染色体倍性快速鉴定方法】，请使用软件OFFICE或WPS软件打开。作品中的文字与图均可以修改和编辑，图片更改请在作品中右键图片并更换，文字修改请直接点击文字进行修改，也可以新增和删除文档中的内容。

烟草染色体倍性快速鉴定方法

热门搜索

历史搜索