人骨髓间充质干细胞的分离培养、多向分化与鉴定

http://www.paper.edu.cn 人骨髓间充质干细胞的分离培养、多向分化与鉴定1 戴文达，方涛林，李熙雷，林红，董 健，陈峥嵘 复旦大学附属中山医院骨科，复旦大学上海医学院外科学系，上海 （200032） Email：dong.jian@zs-hospital.sh.cn 摘要: 目的 探索一个高效分离和扩增人骨髓间充质干细胞的方法，并通过形态学和多向分 化能力进行鉴定。方法 抽取人胸椎骨髓标本，联合利用密度梯度离心和差异贴壁法分离 MSCs，体外扩增后传代，相差显微镜形态学观察和流式细胞仪检测细胞表面标记 CD13、CD29、 HLA-2、CD34、CD45 和 HLA-DR。在地塞米松、左旋 VitC、β-磷酸甘油、FK506 作用下向成骨 细胞诱导分化；在 TGF-beta 3、重组人胰岛素、丙酮酸钠、亚硒酸等作用下向软骨细胞诱 导分化；在地塞米松、IBMX、吲哚美辛的作用下向脂肪细胞诱导分化；在 VEGF、bFGF 作用 下向血管内皮细胞分化。结果 原代和传代细胞呈梭形外观，生长增殖能力良好。细胞表面 标记物 CD13、CD29，HLA-2 阳性，CD34、CD45 和 HLA-DR 阴性。经定向诱导分化后，细胞分 别呈现成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和血管内皮细胞的表型特征。结论 该方法能从人骨 髓中高效分离和扩增 MSCs，能成功定向分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和血管内皮 细胞。 关键词:骨髓间充质干细胞；细胞培养；细胞分化；组织工程 中图分类号: Q813 1 本课题得到 973 项目（骨骼、周围神经损伤修复机制与措施和重度脑创伤救治研究，2005CB522600），教 育部博士点基金（HIF-1α/VP16 嵌合基因转染促进大块人工骨中心区域的微血管化，20060246074）资助 - 1 - 1．引言 干细胞是目前生命科学的研究热点。骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Derived Mesenchymal Stem Cells，MSCs）因其自身所具有的特殊性而日益受到人们的关注。MSCs 最早由Friedenstein发现，具有多向分化潜能，在特定的条件下可分化为成骨细胞、成软骨 细胞、脂肪细胞、血管内皮细胞、肌肉细胞、神经细胞等多种中胚叶来源组织细胞 [1-3] ；而 且MSCs特性稳定，易于获得及扩增，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能 [4]。在 组织工程中具有良好的应用前景。人体骨髓中MSCs含量稀少，仅占单个核细胞的百万分之一 到十万分之一。而组织工程需要大量的种子细胞，故需进行体外纯化和扩增。本实验研究人 MSCs的体外分离、纯化、扩增以及定向分化条件，为MSCs的临床应用提供理论依据和技术方 法。 2．材料和方法 2.1主要试剂和仪器 低糖DMEM培养基(Gibco, USA)，优等胎牛血清(Hyclone, USA)，Percoll（1.073×10-3 g/L, Sigma, USA），青霉素G钠，硫酸链霉素，两性霉素B（GIBCOBRL, Life Technologies, USA）， 地塞米松，β-甘油磷酸，左旋维生素C（Sigma, USA），FK506 (Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd, Japan)，丙酮酸钠（Sigma, USA），TGF-beta 3（R&D Systems, Inc. USA），重 组人胰岛素（优沁林®常规，中国礼来公司），转铁蛋白，亚硒酸，牛血清白蛋白，亚油酸 （Sigma, USA），IBMX（1-甲基3-异丁基-黄嘌呤）（Biosource, USA），吲哚美辛（Cayman Chemical, USA），油红O（Sigma, USA），抗CD29、CD44、CD34 及CD45单克隆抗体(Sigma)， VEGF，bFGF，Ⅰ、Ⅱ型胶原抗体（SIGMA, USA），生物素化二抗（DAKO, DENMARK），培养 板、培养瓶（Cornig, USA）。 2.2HBMSCs的分离与培养 经患者知情同意，自男性24岁胸椎骨折病人健康椎体取得骨髓10mL，肝素抗凝后Percoll （1.073×10-3 g/L）密度梯度离心，取中间单核细胞层以低糖DMEM洗涤2次，接种入75cm2培 养瓶（Cornig, USA），以含10% FBS，100 units/mL 青霉素G钠，100 μg/mL 硫酸链霉素， 0.25 μg/mL 两性霉素B的低糖DMEM培养。24h后换液，弃未贴壁的细胞，剩余的贴壁细胞主 要是MSCs [5]。以后每2~3天换液，待细胞生长至90%汇合后胰蛋白酶消化传代。 2.3人骨髓MSCs的生长曲线测定 以原代、第4代和第14代细胞为标本，制备单细胞悬液,调整密度为4×104个/ mL，接种 于24孔培养板,每孔200μL ,每3 d换液。分别于1、2、3、4、5、6、7、8 d, 每组取3孔行 MTT法检测，酶标仪(Bio-Rad, Model 550) 读取490 nm吸光度(A )值, 绘制细胞生长曲线。 - 2 - http://www.paper.edu.cn - 3 - 流式细胞仪检测 取生长良好的第3代细胞，制成1×107个/mL的单细胞悬液。取洁净的普通 塑料试管，分别加入荧光标记小鼠抗人单克隆抗体CD13-PE，CD29-FITC，CD34-FITC，CD45-PE， HLA-2-FITC，HLA-DR-FITC和同型阴性对照小鼠抗小鼠IgG单克隆抗体各20μL，每管加入细胞 悬液100μL，混匀，室温下孵育30min，每管加入1.5 mL PBS，混匀，离心5min（1800r/min）， 弃上清，每管加200μL PBS，混匀后，Becton-Dickinson FACScan检测，Apple公司随机软件 分析，每个样本分析10,000个细胞。 2.4体外多向诱导分化 以生长良好的第3代细胞为实验细胞。细胞经消化后调节密度为2×104个/mL，分别接种 入12孔培养板和预置盖玻片的6孔培养板，24h后细胞完全贴壁，更换分化诱导培养基并分别 设对照组。 2.4.1向成骨细胞诱导分化 以成骨诱导培养基培养[6]（100 nmol/L 地塞米松、50µmol/L 左旋VitC、10nmol/L β- 磷酸甘油、50nmol/L FK506）。第7、14天时行碱性磷酸酶钙钴法染色、钙茜素红染色和Ⅰ 型胶原免疫组化。 2.4.2向软骨细胞诱导分化 以成软骨诱导培养基培养[7]（1mmol/L 丙酮酸钠、0.1mmol/L 左旋维生素C、0.1nmol/L 地塞米松、10ng/mL TGF-beta 3、6.25μg/mL 重组人胰岛素、6.25μg/mL 转铁蛋白、6.25ng/mL 亚硒酸、1.25ng/mL 牛血清白蛋白、5.35μg/mL亚油酸）。第7、14天时行Ⅱ型胶原免疫组化 和Alcian蓝染色。 2.4.3向脂肪细胞诱导分化 以成脂肪诱导培养基培养（1µmol/L 地塞米松、10mg/L重组人胰岛素、0.5mmol/L IBMX、 100µmol/L 吲哚美辛）。培养至第15天时作油红O染色。 2.4.4向血管内皮细胞诱导分化 以内皮细胞诱导培养基培养（高糖DMEM、10%FBS、10ng/mL VEGF、5ng/mL bFGF）。于第 14天行CD31和vW因子间接免疫荧光染色：细胞爬片经4%的多聚甲醛固定，PBS洗涤，正常羊 血清封闭30min；一抗为鼠抗人CD31单抗（Neomarkers, 1:25）和兔抗人vWF多抗( Sigma, 1:200)，湿盒中4℃过夜；二抗为FITC—马抗小鼠IgG和罗丹明—羊抗兔IgG，室温孵育30min。 阴性对照用0.01 mol/L PBS 代替一抗。 3．结果 3.1倒置相差显微镜观察 原代接种1d即可见较多细胞贴壁，外观呈纺锤形和多角形，并可见细胞核（图1A）。72h 后细胞数量开始增多，细胞形态呈成纤维细胞样，并可见较多细胞核内有双核仁，细胞呈集 http://www.paper.edu.cn - 4 - 落样生长。培养至12d左右细胞汇合达到90％左右，细胞呈极性排列，集落呈漩涡状（图1B）。 细胞传代后仍保持成纤维细胞样外形，增殖速度很快，5~7d即再次汇合达90％。 人骨髓MSCs生长曲线 骨髓MSCs生长曲线呈S形,接种后第1~2天为潜伏适应期，从第3 天起 细胞开始增殖并进入对数生长期，第8天达到高峰，以后进入平台期。根据生长曲线可知骨 髓MSCs的群体倍增时间为26 h (图2)。本实验中P1、P4、P14细胞增殖速率无明显差异（P ＞0.1）。 3.2细胞表面标记物 经流式细胞仪检测，MSCs 均一地表达CD13、CD29，HLA-2，阳性率分别为99.97%，98.46% 和94.27%；而CD34、CD45 和HLA-DR 阴性，阳性率分别为5.16%，1.34%和3.13%（图3）。 3.3成骨细胞诱导分化 3.3.1碱性磷酸酶钙钴法 诱导组细胞于第7天左右可见细胞表面，培养液内有较多棕褐色细小颗粒出现。随着诱 导时间延长棕褐色颗粒明显增加，第14天时阳性反应更明显(图4A)。对照组两个时间段阳性 程度明显较弱(图4B)。 3.3.2钙茜素红染色 诱导组细胞于第7天即可见阳性反应，细胞表面出现较多红色着色。第14天时阳性反应 更明显(图4C)。对照组两个时间段阳性程度明显较弱(图4D)。 3.3.3Ⅰ型胶原免疫组化 诱导组细胞培养至第14天，细胞外基质可见大量条带状棕褐色着色。第14天时阳性反应 更明显(图4E)。对照组基本无阳性反应(图4F)。 3.4软骨细胞诱导分化 诱导组Ⅱ型胶原免疫组化呈阳性反应，细胞外基质内可见大量絮状棕褐色着色(图5A)， 对照组基本无阳性反应(图5B)。Alcian蓝染色诱导组细胞第7天即呈阳性反应，细胞内外见 较多深蓝色斑块状着色，第14天时阳性反应更明显(图5C)；而对照组两个时间段阳性明显较 弱(图5D)。 3.5脂肪细胞诱导分化 诱导分化15d后细胞形态逐渐向类圆形转变，体积变大，细胞质内出现少量圆形透亮小 滴。油红染色发现大部分细胞胞浆内大小不一的脂滴呈橘红色，浅蓝色胞核被挤于细胞一侧 或中央(图6A)；对照组基本无阳性着色(图6B)。 3.6内皮细胞分化诱导 3.6.1倒置显微镜观察 细胞诱导培养5~7d后，体积逐渐变大，由长梭形变为多角形，传代后呈典型“铺路石” 样内皮细胞形态（图7A）。 http://www.paper.edu.cn - 5 - 3.6.2免疫荧光染色 CD31免疫荧光染色(图7B)及vW因子免疫荧光染色(图7C)均为阳性。 4．讨论 目前认为，骨髓间充质干细胞的分离与培养必须在形态学上和功能学上均满足要求。获 得优良的种子细胞对于构建良好的组织工程人工组织具有非常重要的意义[8]。本研究对传统 的分离方法进行一些改进，联合利用密度梯度离心法和差异贴壁法，使所获细胞纯度更高； 在体外多次传代能保持良好的增殖和分化能力，生物学活性优良。流式细胞仪检测均一表达 CD13、CD29、HLA-2，而造血系表面标记CD34、CD45 和HLA-DR 阴性，符合骨髓间充质干细 胞的组织学来源的表现。其次，种子细胞的分化能力对组织工程构建人工组织的效果亦具有 决定性的意义。本研究使用的方法所获的MSCs经定向分化诱导培养能高效向成骨细胞、软骨 细胞、脂肪细胞和血管内皮细胞分化，在功能学上完全满足组织工程学应用的要求；在多向 诱导分化实验中，本研究利用新型的成骨诱导因子FK506，协同传统因子地塞米松共同作用 于MSCs，已被证实具有更好更强的成骨诱导作用；本研究同时将MSCs成功向成血管内皮细胞 诱导分化，有望解决骨组织工程研究中的血管化问题，最终提高人工骨的成骨效果。 组织工程的兴起将医学推进一个新的领域——再生医学，但目前仍存在技术和伦理上的 瓶颈。种子细胞、支架材料和生物活性因子是推动组织工程发展的三大基本研究方向，要使 人工组织和器官能早日进入临床，人体自身的骨髓间充质干细胞将会起到非常重要的作用， 本研究为其应用奠定实验基础。 http://www.paper.edu.cn - 6 - 参考文献： [1] Darwin J, Procko P, et al. Marrow stromal cell as stem cell for non-hematopoietic tissues[J]. Science, 1997, 276(4): 71-74. [2] Pittenger MF, Mackay AM, Stephen CB, et al. Multi-lineage potential of adult human mesenchymal stem cells[J]. Science, 1999, 284: 143-147. [3] Ferrari G, De Angelis GC, Coletta M, et al. Muscle regeneration by bone marrow-derived myogenic progenitors[J]. Science, 1998, 279 (6): 1528-1530. [4] Scott PB, Neelam J, Stephen EH. Growth kinetics, self-renewal and the osteogenic potential of purified human mesenchymal stem cells during extensive sub-cultivation and following cryopreservation[J]. J Cell Biochem, 1997, 64: 278-294. [5] Yoshikawa T, Nakajima H, Yamada E, et al. In vivo osteogenic capability of cultured allogeneic bone in porous hydroxyapatite: immunosuppressive and osteogenic potential of FK506 in vivo[J]. J Bone Miner Res, 2000, 15: 1147-1157. [6] Uemura T, Dong J, Wang YC, et al. Transplantation of cultured bone cells using combinations of scaffolds and culture techniques[J]. 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The doubling time of MSCs is about 26 hours. No significant difference was observed in cell proliferation in passage 1, 4 and 14(P＞0.1). - 8 - http://www.paper.edu.cn 图 3 细胞表面标记物 Figure 3 Surface Markers of MSCs The Cell surface markers CD13, CD29 and HLA-2 are positive which are 99.97%, 98.46% and 94.27% respectively; while CD34, CD45 and HLA-DR are negative which are 5.16%, 1.34% and 3.13% respectively. - 9 - http://www.paper.edu.cn 10 A B C D FE 图4 成骨细胞诱导分化 (×100) Figure 4 osteogenic differentiations of MSCs (×100) A, B: Gomori ALP staining at day 14. gure 4A shows dark brown particles in the culture medium which represents positive result. Figure 4B shows the negative result of control group; C, D: Alizarin red staining at day 14. Figure 4C shows red stains in the culture medium which represents positive result. Figure 4D shows the negative result of control group; E, F: TypeⅠcollagen immunohistochemical staining. Figure 4E shows numerous brown straps in the culture medium which represents positive result. Figure 4F shows the negative result of control group. http://www.paper.edu.cn 11 A B C D 图5 软骨细胞诱导分化(×100) Figure 5 Chondrogenic differentiations of MSCs (×100) A, B: TypeⅡcollagen immunohistochemical staining. Figure 4A shows numerous brown fluff in the culture medium which represents positive result. Figure 4B shows the negative result of control group. C, D: Alcian blue staining at day 14. Figure 4C shows deep blue stains in the culture medium which represents positive result. Figure 4D shows the negative result of control group. http://www.paper.edu.cn 12 A B 图 6 脂肪细胞诱导分化 (×100) Figure 6 Adipogenic differentiations of MSCs. (×100) A, B: Oil red O staining. Figure 4A shows numerous bright red stains surrounded under cell membrane which represents positive result. Figure 4B shows the negative result of control group. http://www.paper.edu.cn 13 A B C 图 7 成血管内皮细胞诱导分化 Figure 7 Endothelial cell differentiation of MSCs A: phase contrast microscopy observation of cells after 5~7days of induction. Cells present a typical “cobblestone-like” appearance (×100); B: CD 31 fluorescent immuno-assay at day 14. Cells show bright green fluorescence while control group is negative (×200); C: von Willebrand factor fluorescent immuno-assay at day 14. Cells show bright red fluorescence while control group is negative (×200). http://www.paper.edu.cn 14 Isolation, Multiple Defferentiation and Identification of Human Bone Marrow Derived Mesenchymal Stem Cells DAI Wen-da, FANG Tao-lin, LI Xi-lei,, LIN Hong, DONG Jian, CHEN Zheng-rong. Department of Orthopaedics, ZhongShan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China Abstract Objective To establish a method for effective isolation and multiplication of human bone marrow derived mesenchymal stem cells and verification by morphology and multi-potential differentiation. Methods MSCs were isolated from human bone marrow by combination of gradient centrifugation and different adherent time method. Morphology and growth characteristics were examined by phase contrast microscopy. Cell surface markers CD13, CD29, HLA-2, CD34, CD45 and HLA-DR were tested by flow cytometer. MSCs were induced in vitro respectively to osteoblasts by β-glycerophosphate, L-ascorbicacid-2-phosphate, dexamethasone and FK506; to chondrocytes by TGF-beta 3, recombulin, sodium pyruvate and selenious acid; to adipocytes by IBMX and indomethacin; to endothelial cells by VEGF and bFGF. Results Cells were spindle-shaped and presented active proliferation in primary and passage cultures. The Cell surface markers CD13, CD29, HLA-2 were positive and CD34, CD45 and HLA-DR were negative. Cells were successfully induced into osteoblasts, chondrocytes, adipocytes and endothelial cells. Conclusion Method is established to isolate and multiply MSCs from human bone marrow effectively and to verify by morphology and its multi-potential differentiation. Keywords: Mesenchymal stem cells; Cell culture; Cell differentiation; Tissue engineering http://www.paper.edu.cn