乳铁蛋白肽的研究现状及进展

乳铁蛋白肽的研究现状及进展 乳铁蛋白肽的研究现状及进展 近年来抗菌肽由于自身的优点成为抗生素的替代品，已成为学术界研究与开发的热点，其中乳铁蛋白肽(Lactoferricin，Lfcin)因其强大的生物学功能而备受关注。最初是由Bellamy等从乳铁蛋白水解物中分离到一种乳铁蛋白多肽，即牛乳铁蛋白肽(LfcinB)，此后相继在人、小鼠、山羊、猪等动物乳铁蛋白中证明存在Lfcin的同源物。Lfcin是靠近乳铁蛋白N-端，具有比乳铁蛋白（LF）强400多倍的抗菌活性，并具备LF的所有生物学活性，如抗菌、抗病毒、抑制癌细胞生长、消炎及参与免疫反应等。研究发现，Lfcin与乳铁蛋白的功能密切相关，除不能结合铁离子外，不含稀有氨基酸和外源化学成分，是一种安全健康的产品。Lfcin由于具有强大生物学功能及安全性等优点，显示出其替代抗生素的巨大潜在优势。因此，本文就近年来关于Lfcin的结构、功能、作用机制的研究进展进行综述。 1 Lfcin的结构 乳铁蛋白肽(Lfcin)是LF在酸性环境下经胃蛋白酶作用N端释放的一段多肽。LfcinB是从BLF的N端(17~41)被水解下来的25个氨基酸残基，其顺序为：Phe-Lys-Cys-Arg-Arg-Trp-Gln-Trp-Arg-Met-Lys-Lys-Leu-Gly-Ala-Pro-Ser-Ile-Thr-Cys-Val-Arg-Arg-Ala-Phe，其中的11个氨基酸残基具有与完整的LfcinB相同的抗菌活性。11个氨基酸残基中的6个氨基酸残基(LfcinB4-9)是LfcinB的活性中心。人的乳铁蛋白肽(LfeinH)来源于人乳铁蛋白的1～45位氨基酸；公山羊乳铁蛋白肽(LfeinC)为14~42片段。LfcinB 分子中18个氨基酸残基靠一个分子内二硫键结合而形成一个环，LfcinH是11与12位氨基酸残基之间的肽键断裂，两个肽片段靠二者间的二硫键连接成为一个分子。但研究表明，二硫键在抗菌过程中作用不大，被破坏后LfcinB的抗菌活性并不减弱。LfcinH和LfcinB的单字码一级结构和二硫键形成的环状结构如图1所示。 LfcinB的二级结构是在一级结构的肽链上折叠而成，天然状态下包含α-螺旋和β-折叠构象。LfcinB在LF分子中呈α-螺旋结构，当解离下来后α-螺旋结构消失，转变成以β-折叠为主的两亲性结构，其中疏水的Trp残基和带正电荷的Arg和Lys残基是相互分开的，这种结构上的改变导致其两性分子更易靠近细胞膜，这是其抗菌功能所必须的，也解释了LfcinB抗菌活性明显强于LF的原因。然而，LfcinB在溶液中的这种分子结构具有很大的可变性，能够根据其所处的外部环境形成特定的构型，LfcinB的这种分子动力学性质可能与其所具有的多种生理功能有关。LfcinH在人乳铁蛋白分子中也呈α-螺旋结构，但解离后LfcinH的分子结构还不明确。 BLF的立体结构是在二级结构的基础上折叠成两个基本相等的叶(N-叶和C-叶)，每一个叶状结构中含有一个与Fe3+ 结合的部位，此部位存在于一个很深的裂隙中。LfcinB的立体结构远比BLF简单。为了进一步了解LfcinB的立体结构，Schibli等(1999)通过核磁共振技术对LfcinB的活性中心LfcinB4-9的三维结构进行了研究，结果见图2。 图2显示，碱性的Arg残基和疏水的Trp残基充分分离，形成了两性分子结构，Arg残基在分子的一侧，Trp残基在分子的另一侧，Gln在分子的中间。对含有25个氨基酸残基的LfcinB的结构分析也表明，LfcinB也是两性分子结构；Trp残基和带正电荷的Arg和Lys残基是相互分开的。以上结构特征与LfcinB4-9和LfcinB抗菌、抗病毒功能是分不开的。 2 Lfcin的生物学功能 2.1 抑菌、杀菌 LF的抗菌活性在其众多的生物学功能当中最显著，而Lfcin的抗菌活性要高出LF 400多倍，故Lfcin的抗菌功效在其功能当中也占了很重要的地位，同时预示了其替代抗生素的可能性。Lfcin的抗菌谱广，包括许多G+、G-病原菌及真菌，例如埃氏大肠杆菌、奇异变形杆菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌、普通变形杆菌、结肠耶尔森氏菌、铜绿假单胞菌、白喉棒状杆菌、弯曲杆菌、链球菌、单核细胞增生李斯特氏菌和产气荚膜梭菌；对引起消化道功能紊乱的白色念珠菌有强烈的抑杀作用。在抑制细菌方面有研究发现，E．coli(G-)的脂多糖和金黄色葡萄球菌(G+)的磷壁酸是LfcinB的最初结合位点。Lfcin在细菌表面的结合对杀菌活性有重要作用。对于生长在1%蛋白胨培养基或Sabouraud葡萄糖培养基的真菌、G+菌和G-菌在较低LfcinB浓度下（MIC为10 μg/ml左右）除个别G+菌外均不能生长。Bellamy等（1992）研究了28个菌株对LfcinB 敏感性，所选待测菌株包括G+菌、G-菌、杆菌、球菌、专性需氧菌、兼性厌氧菌、专性厌氧菌等，测定了在蛋白胨基础培养基和YPG培养基上Lfcin的有效抑菌浓度。结果表明，随菌株和培养基变化其有效浓度在0.6～150 μg/ml之间，并且得出G+菌比G-菌对Lfcin更敏感。除此之外，Lfcin对真核微生物如霉菌、酵母也具有抑制作用。 2.2 抗病毒 近年来的研究表明，LfcinB可以抑制细胞巨化病毒和HIV、疱疹1型和2型病毒、肝炎病毒和流感病毒、腺病毒和轮状病毒等，并且降低对宿主的感染力，抑制病毒颗粒复制。有研究表明，LfcinB在病毒感染的第一个阶段吸附过程中起作用，因此推断LfcinB可能与病毒结合，从而阻断病毒与宿主细胞的结合。α-螺旋结构的抗菌肽，如Magainins对HSV-1和HSV-2病毒没有作用；而一些β-折叠结构的抗菌肽，如Defensin、Tachyples和LfcinB则能够抑制这两种病毒和HIV对宿主细胞的感染。因此推断，LfcinB作为一种阳离子型抗菌肽，其β-折叠结构在抗病毒过程中起重要作用，即Lfcin带正电荷、疏水基团和环状结构等因素都与其抗病毒（吸附-封闭）机制有关。 2.3 抗寄生虫 Lfcin对于某些鞭毛虫、鼠弓形体、兔肝艾美虫等具有一定抑制作用。有研究表明，Lfcin能抑制贾第鞭毛虫的生长，并将在培养基中生长的虫体杀死。因为Fe3+可减弱LF和Lfcin对其抑制效应，而Lfcin不含Fe3+结合中心恰好是其抑制贾第鞭毛虫的机制所在。Turchany等(1997)也证实了Fe3+可降低LF或Lfcin与贾第鞭毛虫的结合能力，表明Lfcin对其抑制作用与贾第鞭毛虫对Fe的利用有关。Tanaka等（1995）发现Lfcin可抑制体外环境下的鼠弓形虫生长。Omata等（2001）试验表明，LfcinB可有效减弱弓形体、兔肝艾美虫等病原虫对宿主细胞的感染力，给感染弓形虫的小鼠每天饲喂5.0 mg或皮下注射0.1 mg LfcinB后无一死亡，而对照组死亡率达80%，此外处理组脑组织感染寄生虫量显著低于对照组，因此可推断LfcinB可有效抑制弓形虫对宿主的侵染。 2.4 对内毒素的作用 Lfcin调节免疫与消炎的功效体现在其对于内毒素的作用。脂多糖(LPS)是G-细菌细胞膜上的主要成分，包括许多内毒素类物质都属于LPS类，在通常情况下，LPS在细菌死亡或增殖时被释放出来导致免疫反应。Lfcin作为一种阳离子型抗菌肽，能与带有负电荷的免疫原结合，封闭其抗原性，阻断其对机体的免疫刺激作用，因此可以靠静电作用与LPS结合，使其毒性丧失。近来研究表明，一些阳离子型抗菌肽，如嗜中性粒细胞颗粒释放的α、β防御素，能够与免疫细胞膜上的趋化因子受体结合发挥趋化作用。带有强正电荷的LfcinB同样也可能通过趋化性来达到调节免疫反应和消炎的功能。众所周知，蛋白质或多肽在初生哺乳动物消化道内可被完整吸收并转运，而对于正常动物或人，二肽、三肽由特异性转运载体吸收，多肽则很难以非特异性吸收形式进入血液。LfcinB作为一种由25个氨基酸残基组成的多肽同样难以吸收，但却有研究结果表明，口服Lfcin可调节机体免疫水平分子，辅助杀死体内致病细菌、原虫或病毒等，故其作用机制成为现在的研究热点。有报道小肠刷状缘膜和肠道淋巴细胞存在LF特异性结合受体，而Lfcin在LF与受体结合中起关键作用，Lfcin可与人多形核白细胞作用，促进释放干扰素-8，由此人们推测，Lfcin是以受体介导形式被小肠粘膜特异性吸收或者通过与消化道中的淋巴组织作用，增强细胞免疫反应，间接提高宿主抵抗力。 2.5 调节基因表达 蛋白激酶Ⅱ(CK2)是广泛存在于真核细胞中的一种多功能Ser/Thr 蛋白激酶，在DNA复制与转录过程中起重要作用。大量研究表明，Lfcin能够作为第二信使启动某一信号转导通路，调控基因表达。Lfcin能够与CK2结合，增强其活性，特异性磷酸化一些介导因子或调控因子，影响细胞功能，如促进骨髓细胞增殖、中性淋巴细胞激活、促进细胞分化等。同时，Lfcin可以直接作为转录因子，调控基因表达。Kanyshkova等发现牛乳铁蛋白N端一段多肽具有抗菌性并能与DNA结合；Lfcin也能与RNA结合，干预细胞功能。 2.6 其它功能 Lfcin 作为一种新型抗菌肽其具备多种生物学功能，除上面介绍的以外Lfcin还对肿瘤细胞有抑制作用，可与多种抗生素协同作用，具有乳化功能及抗氧化作用。与正常细胞相比，癌细胞成分也有所不同，某些癌细胞质膜上含有的磷脂头部成分由磷脂酰丝氨酸(PS)组成，而正常细胞仅在质膜胞液才含有PS。PS与磷脂酰甘油的共同特点是均带有净负电荷，因此推测，Lfcin对肿瘤细胞的抑制作用与其细胞膜上的PS等负电荷成分有关。Lfcin的两亲性决定其可促进营养物质的消化吸收。机体内氧自由基的过剩被认为衰老或疾病的征兆，通常铁等金属离子可起催化作用加速氧自由基的产生，LF可螯合铁离子抑制脂质氧化作用。Lfcin虽不能与Fe3+结合，但有研究表明，它可阻断脂质体氧化，减少自由基产生。 3 Lfcin研究中目前存在的问题及其应用前景 Lfcin作为一种多生物学功能新型抗菌肽有着异于传统抗生素的抗菌机理，广泛存在于动物的多种组织及粘膜层，参与机体的非特异性体液免疫反应，并已经作为一种免疫增强剂广泛应用于提高人体非特异性免疫功能。近年来大量的研究使得人们对Lfcin的结构、生物学功能及其分子机制有了一定的认识，但还存在以下一些问题。 ① LfcinH的空间结构，Lfcin与质膜结合后的构象变化以及调节免疫反应、增强机体抵抗力的分子机制等。 ② 对于Lfcin的制备，目前可由LF水解后离心，但此法工艺复杂，回收率低，成本高，故Lfcin的制备及来源问题是制约其研究和应用的关键环节，当然这些也是Lfcin研究的热点。 ③ 目前研究认为，可以利用基因工程技术在家畜乳腺反应器或微生物中高效表达Lfcin来解决，使之成为新一代肽类抗菌药的来源。另外，与传统抗生素相比，其抗菌活性还不够理想。专家认为可根据Lfcin结构与功能的关系改造Lfcin和设计新抗菌肽分子，以满足需要，当然还需进一步研究Lfcin结构与活性的关系和作用机理，为改造和设计提供足够的理论依据。 Lfcin 广泛而独特的生物学功能和理化特性预示了其在饲料工业中应用的独特优势。 ① 它不含稀有氨基酸和外源化学成分，是健康安全产品。 ② 在消化道中稳定，免疫原性小，水溶性好，广谱杀菌，可耐受蛋白酶及肽酶降解。 ③ 具有良好的热稳定性，可耐受酸、高温高压处理，因此在饲料加工和储存过程中仍能持续发挥其功能，保证饲料品质，延长贮存期。 ④ Lfcin具有抗真菌和抗脂质氧化的作用，因此可用作防霉剂和抗氧化剂。 综上所述，Lfcin因其独特的生物学功能及应用前景显示了其良好的开发潜力，在人们呼唤自然、要求健康的情况下，Lfcin将在开发新型的保健促生长剂方面显示其重要的应用价值。