柴胡疏肝散对肝郁证模型大鼠脑海马ERK及其磷酸化的影响_杜雅薇

收稿日期:2012 － 01 － 26 作者简介:杜雅薇(1980 －) ，女(蒙古族) ，博士，研究方向:中医脑 病。 热下行，引邪从小便而出，苦寒直折，使三焦火邪去而热毒 解，达到治疗中风的目的，从而控制其胃肠道并发症，减少 胃黏膜组织损伤。 经过本团队的前期研究成果明，脑梗塞后的胃肠道 症状是一种脑梗塞后的并发症，而非机体的应激反应［5］。 脑梗塞急性期在低灌注的情况下，全身血流减少，血液需要 重新分配，胃肠因其特殊的供血系统和解剖结构成为血液 灌流减少发生最早，最明显的脏器 ［6 － 7］。同时脑梗塞的急 性期容易继发脑水肿以及颅内压增高，导致胃肠血管收缩 甚至痉挛，引起胃肠道血流灌注不足、黏膜微循环障碍 －胃 黏膜血流量减少，进一步破坏胃肠屏障，加重胃肠道的并发 症。从中医角度来讲，脑为髓海，胃为水谷之海，二者在生 理、病理，经络等方面紧密相连，互为因果。脑之动力来源 于水谷精微，胃的活动接受于脑的支配，脑病及胃，胃病及 脑，二者相互影响。 本实验研究证明大鼠在脑梗塞急性期时，的确能够 造成胃肠道的黏膜损害，予以灌服达到治疗量的黄连解 毒汤能够有效的减少其胃肠道的损害，并且就电镜观察 结果来看略优于西咪替丁。黄连解毒汤具有药物简单， 药价低廉的优点，容易在临床广为推广。当然对于脑梗 塞的胃肠道并发症目前研究还较少，起步较晚，对于其 机制及不同干预因素对其的不同影响还值得进一步深 入研究，这将对脑梗塞急性期的胃肠并发症的防治有深 远的意义。 第 30 卷 第 6 期 2 0 1 2 年 6 月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE Vol． 30 No． 6 Jun． 2 0 1 2 中 华 中 医 药 1367 学 刊 柴胡疏肝散对肝郁证模型大鼠 脑海马 ERK及其磷酸化的影响 杜雅薇1，王玉来2，尹岭3，赵秀敏3，秦绍林2，赵永烈2 (1．北京中医药大学东直门医院，北京 100700;2．北京中医药大学东方医院，北京 100078; 3．中国人民解放军总医院神经信息中心，北京 100853) 摘 要:目的:研究柴胡疏肝散对肝郁证模型大鼠脑海马 CA1、CA3、DG区 ERK及其磷酸化免疫阳性神经元 的影响。方法:将大鼠分为空白对照组、肝郁模型组、柴胡疏肝散组，运用模具束缚结合孤养的方法制备肝气郁结 证候动物模型，采用免疫组化法检测大鼠脑海马 CA1、CA3、DG 区 ERK 及其磷酸化免疫阳性神经元的细胞数。 结果:柴胡疏肝散可增高 ERK1 /2、P － ERK 在海马 CA3、DG 区的阳性细胞数。结论:柴胡疏肝散具有抗肝郁作 用，其机制可能与通过上调肝郁大鼠海马 CA3、DG区 ERK1 /2、P － ERK信号通路的活动而起到保护受损神经元， 改善大脑功能，缓解肝郁症状的作用。 关键词:肝气郁结证;柴胡疏肝散;ERK;海马;大鼠 中图分类号:R285． 5 文献标识码:A 文章编号:1673 － 7717(2012)06 － 1367 － 03 Effects of CHSG Powder on ERK and P － ERK in Hippocampus of Rats with Liver － qi Stagnation DU Ya-wei1，Wang Yu-lai2，YIN Ling2，ZHAO Xiu-min3，QIN Shao-lin2，ZHAO Yong-lie2 (1． Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China; 2． East Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100078，China; 3． Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，China) Abstract:Objective:To observe the effects of CHSG powder on ERK and P － ERK in hippocampus of rats with liver － qi stagnation． Methods:The rats were divided into three groups:control，model and CHSG powder group． This animal mod- el is made by the method of confining the rats＇movement． The cell numbers of ERK1 /2、P － ERK in CA1、CA3 and DG sections of hippocampus in different groups were observed by immunohistochemical method． Results:CHSG powder can significantly improve the cell numbers of ERK1 /2、P － ERK in CA3 and DG sections of hippocampus ． Conclusion:CHSG powder has antagonism against liver － qi stagnation by improving the cell numbers of ERK1 /2、P － ERK in CA3 and DG sections of hippocampus． Key words:liver － qi stagnation ;CHSG powder ;ERK ;hippocampus;rat 7631 第 30 卷 第 6 期 2 0 1 2 年 6 月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE Vol． 30 No． 6 Jun． 2 0 1 2 中 华 中 医 药 1368 学 刊 肝气郁结证是中医情志致病的代表证候，引起肝郁证 的主要原因是情志不遂或其他原因影响气机升发和疏泄。 其临床表现为郁郁寡欢、善太息、悲伤欲哭等。本实验通过 运用模具束缚结合孤养的方法制备肝气郁结证侯动物模 型，用疏肝解郁的代表方柴胡疏肝散作为治疗药物，研究柴 胡疏肝散对肝郁证模型大鼠脑海马 ERK 及其磷酸化的影 响。 1 材 料 1． 1 动物 Wistar 大鼠，雄性，清洁级，体重 200 ～ 220 g， 由解放军总医院实验动物中心提供。 1． 2 药物 柴胡疏肝散(柴胡 6 g，陈皮 6 g，川芎 5 g，香附 5 g，枳壳 5 g，白芍 5 g，甘草 3 g，由解放军总医院中药房提 供)经冷水浸泡药材 2 h，常规两煎，头煎 1． 5 h，二煎 1 h，2 次水煎液混合并过滤，经水浴蒸发浓缩成含生药 0． 35 g / mL的浓缩药液冷藏备用。大鼠灌胃煎剂溶液量按人与动 物的每公斤体重剂量折算，为 3． 5 g / kg。 1． 3 仪器 RM －2014 石蜡切片机(德国莱卡) ，KD － BM 生物组织包埋机，Image － Pro Plus MIS2000 图像系统 (美国 Media Cybernetics 公司) ，OLYMPUSBX51 光学显微 镜，OLYMPUSDP71 照相显微镜(日本)。 1． 4 试剂 0． 01 M PBS，0． 01 M柠檬酸缓冲液，细胞通透 液，5%羊血清或封闭血清，含 0． 03%H2O2的 0． 05%DAB 2 方 法 2． 1 大鼠肝郁证动物模型的建立及分组 首先将 40 只大 鼠正常饲养、自由饮食、适应性饲养 1 周后，选用敞箱实验 (Openfield test )将评分相近的大鼠 30 只随机分为 3 组，分 别为空白对照组 10 只、肝郁模型组 10 只，、柴胡疏肝散治 疗组 10 只。模型的制备:在乔明琦［1］发明的大鼠肝郁模 型制做方法的基础上运用模具束缚结合孤养的方法制备。 将造模大鼠放入自制的细钢丝网笼内，对身躯及四肢起到 捆绑和束缚作用，使其行走困难、活动受限。每日束缚 6h， 从 9am － 3pm，然后定时观察并记录大鼠状态。从造模之日 起各组给予相关药物或生理盐水灌胃处理。空白对照组 (对照组) :不作任何刺激，等量生理盐水灌胃，1 次 /天;肝 郁模型组(模型组) :细钢丝网笼束缚，等量生理盐水灌胃， 1 次 /天;柴胡疏肝散组(治疗组) :细钢丝网笼束缚，中药灌 胃(3． 5g /kg) ，1 次 /天。服药时间为 2 周。 2． 2 取材 于造模第 2 周末次给药第 2 天，20%乌拉坦腹 腔麻醉大鼠(30mg /kg) ，仰卧位固定于手术盘中，暴露胸及 腹腔，沿胸骨剑突向两侧剪开皮肤，剪断膈肌，掀开整个胸 廓，打开心包，暴露心脏。灌注装置管道用 0． 9% Nacl 清洗 干净，排除气泡后，将灌注针在心尖处即左心室部插入到左 心室至主动脉，固定插管，立即剪开右心耳，可见静脉血流 出。迅速以预冷的 0． 9% Nacl 溶液灌流冲洗，直到肝脏颜 色变白，右心耳流出的液体变清为止(一般约需 200 ～ 300mL) ;然后再灌注 4℃预冷的 10%甲醛固定液，灌注量 约 200 ～ 250mL，速度先快后慢，当大鼠出现四肢和尾部抽 动时开始缓慢注入约 30min。灌注完成后立即取出大鼠完 整全脑，放入 10%的甲醛固定液中后固定 2 周。待固定完 成后取出脑组织，进行常规组织脱水、透明，行石蜡包埋。 2． 3 免疫组化染色 石蜡切片脱蜡入水，30% H2O2 封 闭内源性过氧化物酶，0． 01M 柠檬酸钠缓冲液中微波加 热修复 15min，山羊血清封闭液封闭后滴加兔抗鼠多克 隆抗体 ERK1 /2 4℃孵育过夜后，采用 SABC 法，滴加已 稀释的二抗，滴加试剂 SP 后放入 37℃ 烤箱中各孵育 30min，DAB 显色，复染、脱水、透明、封片。PBS 代替一 抗作为阴性对照。 2． 4 图像处理 选取每批每组冠状切面相似的切片进行 照像。用 OLYMPUS数码相机和 OLYMPUS 显微镜组合拍 摄图像，关闭数码相机所有自动功能，分别在显微镜 20 倍 物镜和数码相机 4 倍光学放大下进行照像。拍摄部位参照 包新民《大鼠脑立体定位图谱》［2］进行，CA1 区摄像点位于 门区的上方，CA3 区摄取迂回部，齿状回摄取接近折回部包 括上下两个颗粒层。图像在 Imagepro Plus 6． 0 图像分析系 统进行图像分析。每组 8 张切片，根据参考文献［3］，按图 1 进行海马分区的图像处理。处理前先用同等条件下拍摄 的测微尺图像和空白片进行空间和光密度校正，CA1 区选 取 200 × 100μm2，CA3、DG，进行手动阳性细胞计数，左右侧 数据平均后即为该片的阳性细胞数。 图 1 海马分区图 2． 5 统计学处理 运用 SPSS 13． 0 统计软件分析，实验结 果以平均值士标准差(珋x ± s)表示，各组间进行单因素方差 分析，方差齐性，使用 LSD 法进行验后多重比较，P ＜ 0． 05 为差异有显著性意义，P ＜ 0． 01 为差异有非常显著性意义。 3 结 果 3． 1 各组大鼠海马 ERK1 /2 免疫反应阳性表达的影响 ERK1 /2免疫反应阳性神经元在大鼠海马各区均有分布。 主要定位于胞浆与胞膜内，呈棕黄色，排列紧密，胞体较大， 圆形或椭圆形。而模型组阳性神经元数目明显减少，胞体变 小，核固缩，排列松散。柴胡疏肝散组可见阳性神经元数目 较模型组增多，排列较紧密，胞体变大。见插页ⅩⅤ图 2 ～5。 ERK1阳性神经元在模型组大鼠海马 CA3、DG 区的数 量与空白对照组比较均明显减少(P ＜ 0． 01) ，而柴胡疏肝散 组大鼠海马 CA3、DG ERK1 阳性神经元数目与模型组比较 均明显增多(P ＜ 0． 01) ，且与空白对照组比较无统计学差 异。 8631 第 30 卷 第 6 期 2 0 1 2 年 6 月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE Vol． 30 No． 6 Jun． 2 0 1 2 中 华 中 医 药 1369 学 刊 表 1 各组大鼠海马 ERK1 阳性细胞数的 影响(n = 8，珋x ± s) 组别 n CA1 CA3 DG 空白对照组 8 23． 5 ± 1． 2 27． 38 ± 1． 69 47． 00 ± 1． 51 模型组 8 21． 0 ± 3． 16 21． 13 ± 1． 55* 39． 25 ± 1． 49* 柴胡疏肝散组 8 21． 5 ± 2． 45 23． 75 ± 1． 16▲ 45． 63 ± 3． 34▲ 注:与空白对照组比较，* P ＜ 0． 01;与模型组相比，▲P ＜ 0． 01。 ERK2 阳性神经元在模型组大鼠海马 CA3、DG 区的数 量与空白对照组比较均明显减少(P ＜ 0． 01) ，而柴胡疏肝 散组大鼠海马 CA3、DG区 ERK2 阳性神经元数目与模型组 比较均明显增多(P ＜ 0． 01) ，且与空白对照组比较无统计 学差异。 表 2 各组大鼠海马 ERK2 阳性细胞数的 影响(n = 8，珋x ± s) 组别 n CA1 CA3 DG 空白对照组 8 24． 38 ± 1． 3 28． 38 ± 2． 07 50． 75 ± 1． 98 模型组 8 22． 00 ± 3． 07 22． 25 ± 1． 28* 42． 13 ± 1． 81* 柴胡疏肝散组 8 23． 00 ± 2． 33 25． 00 ± 1． 07▲ 48． 75 ± 2． 96▲ 注:与空白对照组比较，* P ＜ 0． 01;与模型组相比，▲P ＜ 0． 01。 3． 2 各组大鼠海马 P － ERK免疫反应阳性表达的影响 P － ERK阳性反应物在大鼠海马各区均有分布。免疫反应阳 性产物主要位于神经元的胞浆、胞核及突起内，呈棕褐色，染 色较深。P － ERK 免疫阳性产物见于海马 CA1、CA2、CA3 区，而模型组阳性神经元数目明显减少，染色较浅，胞体变 小，核固缩，排列松散。柴胡疏肝散组可见阳性神经元数目 较模型组增多，排列较紧密，胞体变大。见插页ⅩⅥ图 6 ～7。 P － ERK阳性神经元在模型组大鼠海马 CA3、D 区的 数量与空白对照组比较均明显减少(P ＜ 0． 01) ，而柴胡疏 肝散组大鼠海马 CA3、DG区 P － ERK阳性神经元数目与模 型组比较均明显增多(P ＜ 0． 05) ，且与空白对照组比较无 统计学差异。 表 3 各组大鼠海马 P － ERK阳性细胞数 的影响(n = 8，珋x ± s) 组别 n CA1 CA3 DG 空白对照组 8 55． 50 ± 5． 5 57． 13 ± 4． 85 104． 38 ± 11． 76 模型组 8 50． 25 ± 5． 26 34． 00 ± 9． 23* 77． 50 ± 8． 91* 柴胡疏肝散组 8 55． 38 ± 5． 29 47． 63 ± 6． 95▲ 93． 63 ± 8． 60▲ 注:与空白对照组比较，* P ＜ 0． 01;与模型组相比，▲P ＜ 0． 01。 4 讨 论 目前，从系统、细胞到分子水平的研究，极大地丰富了 对肝郁证发病机制的认识。认为肝郁证是在压抑、焦虑、悲 痛等负性情绪心理应激状态下，以高级神经中枢调节机制 紊乱为前提，神经、内分泌、循环、消化、免疫、感觉、运动等 多系统病理改变、病证表现的有机概括［4］。肝体阴而用 阳，贮藏有形之血，又疏泄无形之气，通过疏泄功能影响气 血的运行，进而调节情志的变化。 海马是目前肝郁证研究涉及最多的脑区，这主要是因 为海马神经元群主要包括齿状回颗粒细胞层，CA1 和 CA3 区的锥体细胞层，易于界定和研究。ERK1 /2 信号通路的 主要作用是调节细胞的增殖和分化［5］。胞外信号如生长 因子、神经营养因子、细胞因子、神经递质与细胞膜相应受 体结合最后导致蛋白激酶级联途径 Raf － MEK—ERk 被相 继的线性激活。活化的 ERK 可在胞浆内磷酸化一系列蛋 白和激酶［6］，同时移位到细胞核磷酸化一系列转录因子， 从而参与细胞增殖与分化的调控。ERK 调控神经组织细 胞的死亡、分化和突触可塑性等重要功能，学习记忆的形成 也需要 ERK 的激活和参与［7 － 8］。用 ERK1 /2 与 P － ERK 作为指标，观察与负性心理应激有关的脑区，目前仅见一些 用Western blot方法在部分脑区所观察的结果，本研究进一 步用免疫细胞化学方法对肝郁模型动物的相关的脑区进行 了全面的观察。本实验中，肝郁模型组大鼠 ERK1 /2 与 P － ERK阳性神经元在海马 CA3、DG 区细胞数明显减少，说 明肝郁证大鼠模型存在海马 CA3、DG 区 ERK1 /2 与 P － ERK细胞数减少，而柴胡疏肝散大鼠海马 CA3、DG 区 ERK1 /2 与 P － ERK 细胞数明显增多，提示柴胡疏肝散抗 肝郁机制可能是通过上调 ERK1 /2 与 P － ERK信号通路的 活动而发挥作用，从而促进肝失疏泄损伤神经元的恢复而 发挥抗肝郁的作用。 该实验研究显示，柴胡疏肝散具有抗肝郁作用，其机制 可能与通过上调肝郁大鼠海马 CA3、DG 区 ERK1 /2、P － ERK信号通路的活动而起到保护受损神经元，改善大脑功 能，缓解肝郁症状的作用。然而柴胡疏肝散抗肝郁的机制 还有待于进一步的研究。 参考文献 ［1］ 乔明琦，张惠云，陈雨振，等． 肝郁证动物模型研究的理论思 考［J］． 中国医药学报，1997 ，12 (5) :42． ［2］ 包新民，舒斯云．大鼠脑立体定位图谱［M］． 北京:人民卫生 出版社，1991． ［3］ Martens U，Capito B，Wree A． Septotemporal distribution of ［3H］MK －801，［3H］AMPA and［3H］Kainate binding sites in the rat hippocampus［J］． Anat Embryol (Berl) ，1998，198(3) : 195 － 204． ［4］ HATALSKI CG，BRUNSON KL，TANTAYANUBUTA B，et al． Neuronalactivity and stress differentially regulate hippocampal and hypothalamic corticotrophin releasing 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