水稻抗稻瘟病基因Pi35基因内特异SNP共显性分子标记开发及应用研究[权威资料]

水稻抗稻瘟病基因Pi35基因内特异SNP共显性分子标记开发及应用研究[权威资料] 水稻抗稻瘟病基因Pi35基因内特异SNP共显性分子 标记开发及应用研究 摘要 Pi35是具有广谱持久抗性的水稻抗稻瘟病基因，在水稻抗病育种中具有重要作用。通过将不同等位基因测序及序列比对鉴定到1个Pi35基因内特异SNP位点并开发了一套鉴定该SNP的分子标记引物研究结果表明，利用该引物对水稻DNA进行PCR扩增，可快速判断待测水稻Pi35的基因型。该简便快速、成本低廉，可广泛应用于分子标记辅助选择育种或者水稻种质资源Pi35基因型鉴定。 关键词 水稻;Pi35基因;特异SNP;共显性分子标记 S511;Q78 A 1007-5739(2016)21-0020-02 水稻是我国重要的粮食作物，稻瘟病是我国稻作区最严重的的病害之一，严重影响稻谷产量和质量。利用分子标记辅助选择组装、聚合具有不同抗谱的抗性基因，培育广谱、持久抗性水稻品种成为解决问题的最佳途径。Pi35位于水稻1号染色体，供体亲本来源于日本粳稻品种Hokkai 188(Nguyen等，2006)，携带Pi35基因的Hokkai 188(北海188)和Fukei 138(藤系138)是日本水稻育种的骨干抗源，抗叶瘟水平高且稳定，因此Pi35对于培育具有稻瘟抗性的水稻品种具有巨大的利用价值[1-2]。本研究在2对交叉引物PCR(PCR with confronting two-pair primers，PCR-CTPP)方法的基础上加以改进创新，通过在内引物倒数第3位引入错配碱基，开发出鉴定该SNP位点不同碱基类型的共显性标记，可广泛应用于分子标记辅助选择育种或者水稻种质资源Pi35基因型鉴定。 1 与方法 1.1 试验材料 供试水稻材料包括抗性品种Fukei 138(藤系138);感病等位基因亲本材料9311;Fukei 138(藤系138)与9311杂交获得的F1代材料;生产上常用骨干亲本材料培矮64S、广占63S、HD9802S、明恢63、中国香稻、日本晴、桂朝2号、黄华占、Lemont、HP121、超级巴斯玛蒂、盐稻4号、R1128。 1.2 引物设计 本研究在2对交叉引物PCR(PCR with confronting two-pair primers，PCR-CTPP)方法的基础上加以改进创新，通过在内引物倒数第3位引入错配碱基，开发出鉴定该SNP位点不同碱基类型的共显性标记，如图1所示，通过设计4条引物(PF、PR、NF、NR)并利用待测品种基因组DNA进行PCR扩增，引物详细信息见表1，根据扩增条带类型鉴定基因型。 1.3 PCR扩增 PCR反应体系为15 μL，含1.5 μL 10×Buffer，1.0 μL dNTPs(10 mmol/L)，4条引物PF、PR、NF与NR各为0.1 μmol/L;Taq酶0.2 μL(5 U/μL)，1.0 μL模板DNA(50 ng/μL)，其余用ddH2O补齐;PCR反应程序:94 ?预变性5 min;94 ?变性30 s，55 ?退火30 s，72 ?延伸40 s，共35个循环;72 ?延伸5 min，扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶成像仪扫描结果。 2 结果与分析 2.1 序列比对及标记开发 对Pi35来源材料的Pi35编码区的等位基因进行了PCR扩增、等位基因重测序，将获得序列首先与包含感病等位基因的材料日本晴及9311的对应序列进行比对，对于具有差异序列的位点再利用包含其余3个等位基因的材料进序比对确认，最终在Pi35基因3780T处获得1个Pi35特异性SNP位点，Pi35等位基因型为T碱基，其余基因型均为G碱基。 因此，通过设计特异性引物对该SNP位点特异性扩增即可实现Pi35等位基因的鉴定。 引物设计原理如下(图1):在设计T型等位基因鉴定引物时，根据PCR-CTPP方法原理，首先在该SNP位点上游设计正向引物PF(表1)，以该SNP位点的T碱基的互补碱基A作为3′端在该位点设计反向引物PR，PR的3′端的A碱基与T型等位基因材料正常结合扩增而与G型材料形成A/G错配无法扩增。同理，按照上述思路开发出扩增G型等位基因材料的NF与NR，试验结果表明，NF与NR在T型材料中也有较微弱的扩增，因此为增强该引物特异性在NF的倒数第3位引入了一个错配碱基A增强其特异性，结果表明该引物只有与G型等位基因材料扩增时有1条266 bp条带，与T型材料没有条带扩增;4条引物名称、序列及扩增片段长度如表1所示。 2.2 供试材料Pi35基因型鉴定 利用Pi35-PF、Pi35-PR、Pi35-NF、Pi35-NR鉴定Fukei 138(藤系138)、9311、Fukei 138(藤系138)与9311杂交获得的F1代材料、生产上常用骨干亲本材料培矮64S、广占63S、HD9802S、明恢63、中国香稻、日本晴、桂朝2号、黄华占、Lemont、HP121、超级巴斯玛蒂、盐稻4号及R1128。结果显示纯合Pi35基因型材料可以扩增出535 bp和317 bp 2条条带，杂合Pi35基因型材料扩增出535 bp、317 bp和266 bp 3条条带，不含Pi35基因的材料只有535 bp和266 bp 2条条带(图2)。对扩增产物测序的结果表明，该标记引物可以准确地鉴定水稻材料中的Pi35基因型。 3 结论与讨论 利用分子标记辅助选择组装、聚合具有不同抗谱的抗性基因，培育广谱、持久抗性水稻品种是解决水稻稻瘟病抗性问题的最佳途径。紧密连锁的分子标记存在交换的可能，不能完全准确地鉴定水稻材料中的抗性基因，因此开发适合分子育种需要，能够高通量、低成本检测抗病基因的基因内 功能标记成为当务之急。马 建等[3]开发的Pi35-dCAPS标记能够准确鉴定水稻材料中是否含有Pi35基因，但是需要对水稻材料DNA扩增后进行酶切才能判定目标基因型。本研究开发的Pi35基因内特异性共显性SNP分子标记可以直接通过鉴定PCR产物判定目标材料的基因型，无需酶切，检测准确率100%，不仅可以判断目标材料是否含有Pi35基因，还可以检测出目标材料的基因型是杂合还是纯合[4-6]。该标记具有高通量、低成本的优点，适合分子育种材料的大批量检测，为水稻抗稻瘟病育种提供了便利。 4 参考文献 [1] 雷财林，凌忠专，王久林.水稻抗病育种研究进展[J].生物学通报，2004(39):4-7. [2] FUKUOKA S，YAMAMOTO S，MIZOBUCHI R，et al.Multiple functional polymorphisms in a single disease resistance gene in rice enhance durable resistance to blast[J].Sci Rep，2014，4:4550. [3] 马建，马小定，赵志超，等.水稻抗稻瘟病基因Pi35功能性分子标记的开发及应用[J].作物学报，2015，41(12):1779-1790. [4] 易怒安，李魏，戴良英.水稻抗稻瘟病基因的克隆及其分子育种研究进展[J].分子植物育种，2015，13(7):1653-1659. [5] 邢鹏，张幸，李冬梅.稻瘟病抗性基因在主要育种亲本中的分步研究[J].分子植物育种，2015，13(3):505-512. [6] 李江，,S东益.水稻抗稻瘟病分子育种研究进展[J].安徽农业科学，2007，35(35):11413-11415. 文档资料:水稻抗稻瘟病基因Pi35基因内特异SNP共显性分子标记开发及应用研究 完整下载 完整阅读 全文下载 全文阅读 免费阅读及下载 阅读相关文档:缓控释肥在苏北沿海地区宁麦13小麦上的应用效果研究 涝灾后不同补种时间及方式对水稻产量的影响调查 miRNA在农作物研究中的应用进展 温度对杂交水稻恢复系和不育系生育期的影响研究 不同播期与收获期对夏玉米产量的影响 玉米肥效与间作效应及主推品种筛选试验的综合研究 公路桥梁伸缩缝施工质量控制要点分析 旅行社人力资源开发研究 浅谈供电企业社会化用工风险的管控 国有企业内部工资分配的创新 浅析国有企业党建与企业文化创新的系统构建 资产全寿命周期管理体系现状评价 传统经济管理思想对当代经济管理实践的启示 践行五大发展理念提升企业发展境界 新经济时代下电子商务的盈利模式研 感谢你的阅读和下载 *资源、信息来源于网络。本文若侵犯了您的权益，请留言或者发站内信息。我将尽快删除。*