甲磺酸达氟沙星溶液微生物限度检查方法验证研究.doc

甲磺酸达氟沙星溶液微生物限度检查方法验证研究.doc 甲磺酸达氟沙星溶液微生物限度检查方法验证研究 摘 要:目的:甲磺酸达氟沙星溶液微生物限度检查方法验证。方法:根据该样品的微生物限度标准，按《中国兽药典》2010年版附录微生物限度检查法的验证试验指导原则，用甲磺酸达氟沙星溶液进行验证试验，以考察确定甲磺酸达氟沙星溶液微生物限度的检查方法。 关键词:微生物限度检查方法; 验证; 甲磺酸达氟沙星溶液 中图分类号:R927.12 文献标识码:A 文章编号:1006-3315(2013)03-178-001 材料: 1.供试品:甲磺酸达氟沙星溶液，规格:100ml，批号:120601 2.培养基及稀释剂:营养琼脂培养基，玫瑰红钠琼脂培养基，胆盐乳糖培养基，MUG培养基，麦康凯培养基，改良马丁培养基，营养肉汤培养基。PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。 3.验证用标准菌株:金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]，枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]，大肠埃希菌[CMCC(B)44102]，白色念珠菌 [CMCC(F)98001]，黑曲霉菌[CMCC(F)98003]。上述标准菌株均源自中国医药细菌保藏中心，验证试验所用的菌株均为第二代。 实验部分: 1.菌液制备:按照《中国兽药典》2010年版附录要求，采用10倍稀释法稀释，取金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，大肠埃希菌的新鲜培养物 接种至营养肉汤中30-35?，培养18-24小时，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每1ml含菌数为50-100cfu的菌悬液备用;取白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基中23-28?，培养24-48小时，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每1ml含菌数为50-100cfu的菌悬液备用。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养5,7天，加入3,5ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50,100cfu 的孢子悬液。 2.供试液制备:取供试品10ml，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇至供试品分散均匀，制成1:10的供试液。 3.细菌，霉菌和酵母菌计数方法验证 3.1薄膜过滤法(1)试验组:取1:10供试品溶液10ml，过滤，用PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗，每次100ml，冲洗5次，在最后一次冲洗液中加入50-100cfu/ml的金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，大肠埃希菌的试验菌，滤干，取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基上，置30,35?培养3天，每株试验菌平行制备2个平皿，分别加入6个平皿中。白色念珠菌，黑曲霉贴于玫瑰红钠琼脂培养基上，置23,28?培养5天，每株菌平行制备2个平皿，计数。(2)菌液组:分别取上述稀释的菌液1ml注入平皿内，每个菌平行制备2个平皿，测定所加的试验菌数。(3)供试品对照组:取1:10供试品溶液10ml，过滤，用PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗，每次100ml，冲洗5次，以测定供试品的本底菌数。(4)稀释剂对照组:用PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液替代供试品，加入50-100cfu/ml 试验菌，按试验组的供试液制备方法和菌落数计数方法测定其菌数。 3.2结果说明:采用薄膜过滤法，试验组金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，白色念珠菌，黑曲霉菌各试验菌的回收率均高于70%，可采用薄膜过滤法(冲洗量500ml/膜)对本品进行细菌数，霉菌数和酵母菌数测定。 4.控制菌检查方法验证 4.1大肠埃希菌检查法(1)试验组:取1:10供试品溶液10ml，薄膜过滤，用冲洗液冲洗5次，每次100ml，最后一次冲洗液中加入大肠埃希菌菌悬液1ml(10-100cfu)，薄膜过滤，取出滤膜，放入100ml胆盐乳糖培养基中， 35?培养24小时，取0.2ml上述培养物加入5mlMUG培养基中，24小时后，加靛基质试液5滴，液面呈现玫瑰环。(2)阴性对照:照上述方法操作，最后一次冲洗时冲洗液中加入2ml金黄色葡萄球菌菌液，薄膜过滤，取出滤膜加入50ml胆盐乳糖培养基中，于35?培养24小时，再取上述培养物划线接种于麦康凯培养基的平板上，于35?培养24小时，未发现有金黄色葡萄球菌典型菌落。(3)阳性对照组:取大肠埃希菌试验菌液10-100cfu接种至胆盐乳糖增菌培养基，依据大肠埃希菌检查法试验生长良好。 4.2试验结果:可采用薄膜过滤法(取1:10供试品溶液10ml，薄膜过滤，用冲洗液冲洗5次，每次100ml)对本品进行控制菌(大肠埃希菌)检查，试验组，阳性对照组均检出大肠埃希菌，阴性对照组无菌生长。 结论: 本品按照《中国兽药典》2010年版附录“微生物限度检查法”要求进行方法学验证试验。结果金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，白色念珠菌， 黑曲霉菌各试验菌的回收率均高于70%，按照《中国兽药典》2010年版附录“微生物限度检查法”进行控制菌的方法学验证试验及检查，控制菌检查阳性菌生长良好，说明本品对大肠埃希菌没有抑菌作用，阴性菌均未检出，说明该控制菌检查方法的专属性好，可用于控制菌检查。 参考文献: [1]中华人民共和国兽药典【M】2010年版，2010，附录143 [2]兽药质量标准，2003年版，2003，34