【doc】犬贾第虫病毒转染载体介导的绿色荧光蛋白在犬贾第虫体内的表达

【doc】犬贾第虫病毒转染载体介导的绿色荧光蛋白在犬贾第虫体内的达 犬贾第虫病毒转染载体介导的绿色荧光蛋 白在犬贾第虫体内的表达 ? 36?中国寄生虫学与寄生虫病杂志2007年2月第25卷第1期ChinJParasito1ParasitDisFeb.2007.Vo1.25.No.1 文章编号:1000.7423(2007).O1.0036.05【实验研究】 犬贾第虫病毒转染载体介导的绿色荧光蛋白 在犬贾第虫体内的表达 陈丽凤,李建华,刘全.,赵月平一,曹利利一,张西臣一 【摘要】目的构建犬贾第虫病毒(Giardiacanisvirus,GCV)转染载体.方法根据GCV基因组(DQ238861) 的转录起始位点,复制起始位点及包装位点的序列特征和表达外源基因的顺式作用元件,将绿色荧光蛋白(GFP)基因 替换GCV基因部分编码区,构建GCV基因与GFP基因的嵌合体,并置启动子之下.用T7RNA聚合酶体外转录 后经电穿孔转染犬贾第虫滋养体,并用荧光显微镜GFP表达情况,问接ELISA测定转染后GFP的表达量.结果 构建了犬贾第虫病毒重组质粒pGCV634/GFP/GCV2174,经SacI和NotI双酶切得到约2.0和3.5kb两条带,与预计值相 符.南其介导的绿色荧光蛋白在犬贾第虫体内得到了高效表达,其表达量在转染后第l天达高峰90=1.8);以后随时 间的延长而逐渐下降,14d后绿色荧光信号基本消失.结论成功构建了犬贾第虫病毒转染载体,为贾第虫细胞基 因表达调控的研究提供了方法. 【关键词】犬贾第虫病毒;转染载体;绿色荧光蛋白 中图分类号:R382.213.R392.11文献标识码:A GiardiacanisVirusTransfectionVector-MediatedExpression ofGreenFluorescentProteinintheParasite CHENLi—feng,LIJian—hua,LIUQuan,ZHAOYue—ping,CAOLi—li,ZHANGXi— chen rlCollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,JilmUniversity,Changchun13oo62,China; 2HebeiNormalUniversityofScience&Technology,Qinhuangdao066000,China;3Veterinary Institute,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Changchun130062,China) 【Abstract】 ObjectiveToconstructGiardiacanisvirus(GCV)transfectionvector.MethodsAccordingto transcriptionalstartsite,replicationoriginandpackagingsiteofGCVgenome(DQ238861),asystemwasdevelopedfor theexpressionofaforeigngeneinthisorganismbyflankingthegreenfluorescentprotein(GFP)genewiththefragments ofGCVpositive— strandRNA.ThetranscriptoftheconstructwassynthesizedinvitrowithT7RNApolymeraseandused totransfectGCV— infectedtrophozoitesbyelectroporation.ResultsTherecombinantplasmidpGCV634/GFP/GCV2174was constructed.TheexpressionofgreenfluorescentproteinmediatedbyGCVtransfectionvectorinGiardiacanispeakedat 1dafterelectroporation490=1.8),andslowlydecreaseduntil14dpost— transfection.ConclusionTheengineeredGCV vectorcanbesuccessfullyusedtointroduceandefficientlyexpressaheterologousgeneintheeukaryoticmicroorganism. 【Keywords】Giardiacanisvirus;Transfervector;Greenfluorescentprotein SupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChinaNo.30300260 Correspondingauthor.E—mail:zhangxic@public.cc.j1.cn 贾第虫病毒(Giardialambliavirus,GLV)是专 性寄生于犬贾第虫体内的病毒,具有宿主特异性…. GLV及其cDNA体外转录体均具有感染性,小而稳 定,易于纯化,感染效率高,对细胞生长无毒性,因 此以GLV建立一种RNA病毒转染系统,用于外源基 因的表达具有明显的优点[驯.目前以贾第虫病毒GLV 基金项目:国家自然科学基金(30300260) 作者单位:1吉林大学畜牧兽医学院,长春130062: 2河北科技师范学院,秦皇岛066000; 3军事医学科学院军事兽医研究所,长春130062 通讯作者,E—mail:jianhuali7207@163.con 改造的载体系统已成功的应用于外源基因的表达,基 因结构和功能分析,蛋白质功能性研究等各个领域, 显示出广泛的应用前景[4-7].本研究根据犬贾第虫病毒 (Giardi?canisvirus,GCV1基因组结构特点,构建 犬贾第虫病毒转染载体,并在犬贾第虫细胞中进行 GFP的表达. 材料与方法 1犬贾第虫携病毒株滋养体体外纯培养 虫株系本室原代培养并保存于液氮中[9J.将冷冻 管自液氮取出后.立即置于4O?水中轻摇.融化后, 中国寄生虫学与寄生虫病杂志2007年2月第25卷第1期 ChinJParasitolParasitDisFeb.2007.Vo1.25.No.1?37? 将培养物移至含适量新鲜培养基的培养管内.500xg 离心5min,洗去保护液.在管内加满新培养基,置 37?培养.第2天吸除1/3--2/3培养基,再加入等 量新培养基继续培养.将虫移至含新鲜培养基的硅玻 璃培养管于37?培养.每天用倒置显微镜观察并记 录虫体生长情况.连续培养3d.每天将管内培养基 吸除1/3,再补充等量的预热(37?)的新鲜培养基. 此后.每隔2,3d重复1次.直至虫体在管壁上形 成密集的细胞单层. 2质粒与载体 质粒pGCV含有GCV全长cDNA.由本室构建. 质粒pGFP—C1由军事医学科学院军事兽医研究所涂 长春研究员馈赠,载体pMD18一T购自宝生物工程(大 连1有限公司. 3主要试剂及溶液配制 酪蛋白水解物,L_半胱氨酸盐酸盐,维生素C, 柠檬酸铁铵均为美国Sigma公司产品,基因转移仪 fBaeron6000)为美国DRL公司产品.GFP标记的兔 抗血清购自美国Invitrogen公司.羊抗兔HRP—IgG血 清购自长春华美生物工程公司:1_7体外转录试剂盒 fP1320)为美国Promega公司产品.改良TYl—S一33完 全培养基,参照文献[10]方法配制.电击缓冲液,参 照文献[4]方法配制.pH7.4PBS(150mmol/LNaC1, 10mmol/LNa,HPOJNaH,PO4)用于过滤除菌. 4引物 根据GCV和GFP序列特征.下列引物.由 宝生物工程(大连)有限公司合成. 634.F:56AGC7fCrAATACGACTCACTATAGGAAGGAGTGCCAGGCC ATTACC.3: 634.R:5.C7IGCAGCGCTGCCGCCCAGCGCGTGATFATC.3: GCV3F:5.TCTAGAGTCGCGGGGTACCCAGCTAGAATGAIB.3: GCV3R:5.Gc;IGCcGCCGACCCCCTCGTACGCTGCCTCCTAC.3: GFP.F:5.C71GC_AGTAAAGGAGAAGAACTrITI1CA.3: GFP.R:5.TCTAGAATYCTYAATCCATGCCATGTGTAATc.3 其中有下划线部分为1_7启动子,黑斜体字部分 为新加的酶切位点. 5重组质粒的构建 5.1重组质粒pGCV634,pGCV2174和pGFP的构建 以质粒pGCV为,分别以634一F和634一R,GCV3F 和GCV3R为两对引物,PCR扩增出GCV的5端634 bp和3端2174bp两个片段,以GFP—F和GFP-R为 引物,以质粒pGFP—C1为模板扩增出GFP编码区. 并分别克隆于pMD18一T载体.获得重组质粒 pGCV634,pGCV2174和pGFP,鉴定阳性的质粒送 宝生物工程f大连)有限公司进行测序. 5,2重组质粒pGCV634/GFP的构建将重组质粒 pGCV634以SacI/tI双酶切.回收GCV5端634 bp片段;将质粒pGFP用PstI60I/双酶切,回 收GFP;将载体pPoy11/sfinot用SacI60I双酶切. 回收线性化载体.将这3个片段以3:3:1的比例混 合,l6?连接过夜,得重组质粒pGCV634/GFP, 鉴定阳性的质粒送宝生物工程f大连)有限公司进行测 序验证. 5.3重组质粒pGCV634/GFP/GCV2174的构建将重 组质粒pGCV634/GFP用SacI60I双酶切.回收目 的片段634/GFP;将质粒pGCV2174用XbaI/NotI双 酶切.回收GCV3端2174bp片段:载体pPoy11/sfinot 用SacI/NotI双酶切.回收线性化载体.将这3个片 段按3:3:1的比例混合.l6?连接过夜,得重组质 粒pGCV634/GFP/GCV2174(图1),最后鉴定为阳性 的质粒送宝生物工程f大连1有限公司进行测序验证. 6转化 将连接产物pGCV634/GFP和pGCV634/GFP/GCV 2174加入到100l感受态大肠埃希菌DH5a株中, 轻轻混匀后冰浴30min,42oC水浴热冲击90S,冰浴 图1犬贾第虫病毒转染载体构建图 Fig.1ConstructionofG/ard/acanisvirustransfectionvector ? 38?中国寄生虫学与寄生虫病杂志2007年2月第25卷第l期 ChinJParasitolParasitDisFeb.2007,V01.25,N0.1 2min,加入400l预热37?的LB液体培养基,37 oC200rpm振摇培养50min.取200l培养液涂布 于含相应抗生素的LB琼脂平板,37?培养l4,l6 h,出现白色转化菌落. 7重组质粒鉴定 7.1PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳挑取转化菌落.接 种于5ml含氨苄青霉素的LB培养基中,提取小量 质粒DNA为模板,用上述特异性引物进行PCR扩增. 0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定. 7.2酶切鉴定PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳鉴定为 阳性的重组质粒pGCV634,pGCV2174,pGFP,pGCV 634/GFP及pGCV634/GFP/GCV2174,分别用内切酶 SacI,tI,XbaI和NotI进行双酶切鉴定,酶切 结果与预计大小一致者,即为阳性. 8体外转录 重组质粒pGCV634/GFP/GCV2174经NotI酶切 凝胶回收试剂盒回收,定量.取约1.5 线性化后,用 g线性化质粒作为模板,应用1_7体外转录试剂盒 进行体外转录,每管20l反应液【包括:6lNTPs 『25mmol/L腺苷三磷酸(ATP),胞苷三磷酸(CTP),尿 苷三磷酸(UTP),鸟苷三磷酸(GTP),1_7RNA聚合酶预 混液2l,加不含核酸酶的水至201],37?反应30 min后电泳观察结果. 9电穿孔转染 取培养至对数生长期的虫体培养基置于冰浴30 min,500xg离心10min,用冷PBS(4?)洗2次后再 用致冷电击缓冲液悬浮至虫体浓度为lxl0'个/ml,向 电击杯中加入0.8ml悬浮虫体液及200g体外转录 体RNA,以1000V/cm,8ms脉冲进行电击反应,冰 浴15min.转入装有培养基的培养管进行培养.转染 后每天用荧光显微镜检测GFP的表达情况. 1OGFP表达量的测定 EUSA测定转染后犬贾第虫GFP基因表达量. 取转染后犬贾第虫滋养体2x10个,离心弃上清.以 2mlPBS悬浮虫体.经超声裂解后作为ELISA检测抗 原.ELISA反应条件,l0%正常胎牛血清为封闭剂, GFP标记的兔抗血清为一抗(稀释度为1:3200),羊抗 兔HRP—IgG血清为酶标二抗(稀释度为1:1600),测 定样品吸光度(A伽值). 结果 1重组质粒pGCV634,pGCV2174和pGFP的构建 以质粒pGCV为模板.扩增GCV的5端634bp 和3端2174bp两个片段,以质粒pGFP—C1为模板 扩增GFP编码区,均得到了与预期大小相符的3个 DNA片段(图2).3个片段分别克隆于pMD18一T载 体后经双酶切鉴定亦分别得到了约634bp,716bp 和2174bp目的片段,与预计结果一致.经测序证明 构建的重组质粒pGCV634,pGFP和pGCV2174完全 正确f图31 Ml2 M:DNA标志物(DI2000),l,2,3:分别为GCV的5端634bp,GFP 和GCV的3端2174bp片段的PCR扩增产物. M:DNAmarker(DL2000),l,2,3:PCRproducts--5terminus634bp fragmentofGCV.GFPand3terminus2l74bpfragmentofGCV repectively. 图2GCV5端634片段,GFP和GCV3端2174片段 PCR扩增结果 Fig.2ThePCRproductof5terminus634bpfragmentofGCV GFP.3terminus2174bpfragmentofGCV M M:DNA标志物(DL2000),l:pGCV634用SacI和PstI双酶切鉴定, 2:pGFP用PstI和6?I双酶切鉴定.3:pGCV2174用6?I和 NotI双酶切鉴定. M:DNAmarker(DL2O0o1.1:IdentificationofpGCV634digestedby SacIandPstI.2:IdentificationofpGFPdigestedbyPstIand 6?I.3:IdentificationofpGCV2l74digestedbyXbalandNot1. 图3重组质粒pGCV634,pGFV和pGCV2174的酶切鉴定结果 Fig.3Enzyme-digestionprofileoftherecombinantplasmids pGCV634pGreandpGCV2174 2重组质粒pGCV634/GFP的构建 将重组质粒pGCV634/GFP,经SacI,XbaI 双酶切.得到约2.0kb的载体片段和1.4kb的插入片 段的两条带,与预期结果大小一致,测序结果显示构 建的重组质粒pGCV634/GFP完全正确(图4). _星_瑚瑚21 _星_伽瑚21 中国寄生虫学与寄生虫病杂志2007年2月第25卷第1期 ChinJParasitolParasitDisFeb.2007.Vo1.25.No.1.39. M M:DNA标志物(DL2000),1:pGCV634/GFP用SacI和XbaI双酶切 鉴定. M:DNAmarker(DL2000).1:IdentificationofpGCV634/GFPdigested bySacIandXbaI. 图4重组质粒pGCV634/GFP的酶切鉴定结果 Fig.4Enzyme-digestionprofileofpGCV634/GFP 3重组质粒pGCV634/GFP/GCV2174的构建 将重组质粒pGCV634/GFP/GCV2174经SacI和 NotI双酶切,得到约2.0kb的载体片段和3.5kb的 插入片段两条带,与预计值相符,测序结果表明各片 段连接顺序正确,成功构建了重组质粒pGCV634/ GFP/GCV2174(图5). M M:DNA/0T14标志物,1:pGCV634/GFP/GCV2174用SacI和 NotI双酶切鉴定. M:DNMEcoT14marker~1:IdentificationofpGCV634/GFPdigested bySacIandNotI 图5重组质粒pGCV634/GFP/GCV2174的酶切鉴定结果 Fig.5Enzyme—digestionprofileofpGCV634/GFP/GCV2174 4体外转录 重组质粒pGCV634/GFP/GCV2174线性化后,应 用1_7体外转录试剂盒进行体外转录,电泳观察转录 结果如图6所示,转录的RNA较完整,符合转染 条件. 5荧光显微镜检测 转染后用荧光显微镜检测GFP基因表达情况,见 转染虫体发出较强的荧光,表明GFP在犬贾第虫体 内得到高效表达(图7). 2 1:质粒pGCV634/GFP/GCV2174体外转录RNA,2:质粒pGCV634/ GFP/cCV2174阴性对照 1:InvitrotranscriptionofpGCV634/GFP/GCV2174.2:Negativecon— trolofpGCV634/GFP/GCV2174. 图6质粒pGCV634/GFP/GCV2174体外转录结果 Fig.6/np/trotranscriptionofpGCV634/GFP/GCV2174 6转染后犬贾第虫存活率 电穿孔转染犬贾第虫滋养体后1d,显微镜下用 血细胞计数板计数,计算犬贾第虫存活率为43%. 7GFP基因表达量 取犬贾第虫滋养体2x10个,离心沉淀分离虫体, 以间接ELISA法测定转染后GFP基因表达量.转染 后第1天GFP的表达量最高1.8),与对照组差异 具有统计学意义(P<0.01)(图8).以后随时间的延长 而逐渐下降,14d后荧光几乎完全消失. 讨论 贾第虫被称为"生物活化石",它是从原核生物 演化而来最保守的真核生物,在生物学分类上处于重 要地位.是真核生物分子生物学研究的理想模型["]. 该虫为二分裂无性繁殖,在细胞分裂过程中既没有不 同基因的融合,也没有基因互换,外源基因无法导人, 不易产生基因变异,因而制约了贾第虫遗传学研究, 对其细胞学及分子生物学研究困难较大.寄生性原虫 病毒的发现为深入研究贾第虫开辟了新的途径.GLV 是专性寄生于贾第虫体内的dsRNA病毒,见于感染 的滋养体的核内,细胞质,最终可释放至培养基.该 病毒也可感染某些未受病毒感染的虫株.大量病毒感 染不会溶解贾第虫滋养体,对细胞生长无毒性,贾第 虫有相当一部分虫株对GLV感染耐受,这可能与这 些虫体表面缺少病毒受体有关,但经电穿孔感染GLV 后,在细胞中出现病毒蛋白和病毒RNA,病毒颗粒被 释放到培养基.又能感染对GLV敏感的贾第虫,因此以 GLV建立一种RNA病毒转染系统具有明显的优点. Wang等【l2】构建了人源蓝氏贾第虫病毒(WB株)全 长cDNA克隆.制备了GLV和荧光素酶基因的嵌合 _昌_咖咖聊渤21 巾舯_昌_强钾鲫鼯船s1 9643211 ? 40?中国寄生虫学与寄生虫病杂志2007年2月第25卷第1期 ChinJParasitolParasitDisFeb.2007.Vo1.25.N0.1 图7绿色荧光蛋白在犬贾第虫体内的表达 Fig.7GFPexpressedinGiardiacanis 体,通过体外转录及电穿孔技术在贾第虫体内表达了 荧光素酶基因,但只持续4d.Yu等[41通过优化GLV 的顺式作用元件,使荧光素酶基因的表达在没有选择 压力时能持续到30d,这为贾第虫病毒载体系统的建 立奠定了基础.本研究根据GCV基因组(DQ238861) 的转录起始位点,复制起始位点及包装位点的序列特 征构建了GCV与GFP的嵌合体,通过荧光显微镜检 测和间接ELISA检测GFP的表达量,发现其体外转 录体转染贾第虫后,GFP在贾第虫体内得到高效表 达,表明成功构建了犬贾第虫病毒转染载体.本研究 结果为贾第虫细胞基因表达调控研究提供了相关的实 验资料 参考文献 [1]WangAL,WangCC.Discoveryofaspecificdouble—strandedRNA virusinGiardiafamblia[J1.MolBiochemParasitol,l986,2l:269— 276. 『21FurfiBeES.WangCC.TransfectionofGiardialambliadouble-stran— dedRNAvirusintoGiardialambliabyelectroporationofasingle— strandedRNAcopyoftheviralgenome[J].MolCellularBiol, 1990,10:3659—3663. [3]MillerRL,WangAL,WangCC.IdentificationofGiardialamblia strainssusceptibleandresistanttoinfectionbythedouble— strandedRNAvirus[J1.ExpParasitol,1988,6:ll8一l23. 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