屈洛昔芬与他莫昔芬对K562／A02耐药性影响的比较

屈洛昔芬与他莫昔芬对K562／A02耐药性影响的比较 屈洛昔芬与他莫昔芬对K562,A02耐药性 影响的比较 肿瘤防治杂志2005年1月第12卷第1期(,HINJCANCE曼yT曼,!!:: 屈洛昔芬与他莫昔芬对K562/A02 耐药性影响的比较 李杰,郭伟剑,夏鹏,陈瑛 1.上海第二医科大学新华医院肿瘤科.上海200092 2.复旦大学药学院,上海200092 ? 41? 《基础?临床研究l Comparativestudyoneffectsofdroloxifeneandtamoxifenonmultidrugresistance inK562/A02cellliRe LIJie,GUOWei—jian,XIAPeng,CHENYing. 1.DepartmentofOncology,XinhuaHospital,ShanghaiSecondMedicalUniversity,Shanghai200092. P.R.China 2.PharmaceuticalCollege,FudanUniversity,Shanghai200092,P.R.China 【摘要】目的:比较屈洛昔芬 (droloxifene,DRO)和他莫昔芬 (tamoxifen,TAM)对K562/A02 耐药性的逆转作用.方法:应用 MTT法,RT-PCR和免疫细胞化 学染色观察细胞毒活性和 MDR1,GSTpi耐药基因达变 化,采用流式细胞仪测定细胞内 多柔比星(ADR)浓度.结果:在 2O,1O和5mmol/L浓度时,DR0 和TAM均显着逆转K562/A02 的耐药性,DR0和TAM的逆转 倍数相比较差异无统计学意义. MDR1和GSTpi的mRNA和蛋 白表达在DRO和TAM处理后第 2天开始降低,第5天出现明显降 低.20mmol/L浓度的DR0和 TAM分别孵育K562AO2,可使 其细胞内ADR积累分剐增加2.9 和3.0倍.结论:DR0与TAM 类似,有较强的逆转活性,可明显 抑制愀1和汀pi基因的表达 及增加细胞内ADR的积累. 肿瘤防治杂志,2005,12(1);41—44 EAnSrRAcr]oBJEcrIVE:T0studythereversaleffectsofdroloxifene(DR0) andtamoxifen(1AM)onMDRinK562/A02.ME1[H0DS:K562eelllineresistant toadriamycin(ADR)eellline(K562/AO2)andK562eelllinesensitivetoADR (K562)weretreatedwithDR0andTAM.respectively.Byusingtetrazoliumdye (MTT)assay,effectsofvariousconcentrationsofDROandTAMon?lRin K562/A02wasstudied.Beforeandafterthetreatmentwith10mmol/IofDRO andTAM,MDR1andGSTpigenes.expressionswereassayedbyreversetran— scription-polymerasechainreaction(RT_PCR),immunocytochemistry(ICC)as— say.Byusingflowcytometry(FCM),intracellularADRconcentrationwasmeas— ured.RESULTS:DI的andTAMsignificantlyreversedMDRinK562/A02,re— spectively.After2O,10,and5mmol/LofDRoandTAMtreatment,thereversal timeshadsignificantdifferencesbetweenDROandTAM.After10mmol/LDRO and1Mtreatment,bothMDR1andGSTpimRNAgenes,expressionsbeganto declineonthesecondday,andsignificantlydecreasedonthefifthday,P<0.01. ChangesofP-gpandGSTpiproteinexpressionsweresimilartothoseoftheirmR— NAexDressions.Twohoursafter20mmol/LDR0andTAMtreatment,intracel— lularADRconcentrationincreasedto2.9and3.0timesrespectively.However, bothagentsdidnotsignificantlyincreaseADRaccumulationinK562.0ONCLU— S10NS:ReversalactivityofDR0issimilartothatofTAM.Bothagentshave strongreversaleffects.Thereverseisviadifferentroutes,i.e,downregulating mRNAandproteinexpressionlevelsofMDR1/P-gpandGSTpi,andincreasingin— tracellulardrugconcentration.SinceDROhaslowtoxicity,itmighthavegood prospectsinclinicalapplication. ,ncer尸revTreat,2005,l2(1):4l一44 【关键词】雌激素拮抗剂;他莫昔芬;K562细胞/药物作用;药物耐受性 ~KEYWORDS]estrogenantagonists;tamoxifenK562cells/drugeffects;drugtolerance 【基金项目】上海市教委课题资助(O2BK15) 【通讯作者简介】李杰,男,山东昌邑人,博士,教授,主要从事 肿瘤内科及个体化治疗的研究工作. Tel:86—21—65010796E-mail:jie-li@CSCO.org.cn 屈洛昔芬(droloxifene,DRO)是他莫昔芬(tamox— ifen,TAM)的类似物,但毒副反应较小.我们既往 研究结果证实,DRO具有多药耐药(maltidnugresist— ance,MDR)的逆转作用.TAM是经典的MDR 逆转剂,为比较DRO的逆转强度,我们从细胞内药物 积累和MDR1/P糖蛋白(P—glycoprotein,P—gp),谷胱 甘肽一S一转移酶p(glutathioneS—transferasepi,GST— pi)的mRNA和蛋白变化等几方面,进一步对DRO和 TAM逆转多柔比星(ADR)诱导的K562耐药细胞株 (K562/A02)MDR的作用进行了比较观察. 1材料与方法 1.1细胞培养及药物处理 K562敏感细胞株(K562)及K562/A02引自上海 市肿瘤研究所,建株于中国医科院天津血液研究所. 在37.C,5CO.充分湿度下培养于含12小牛血 清,青链霉素各100U/mL的RPMI1640培养液中. K562/AO2维持在2mmol/L浓度的ADR中,实验前 无药培养2周,对数生长期的细胞用于实验. DRO和TAM(均由复旦大学药学院提供)处理细 胞:调整细胞数为1OL_.,处理组分别加入1O mmol/L浓度的DRO和TAM常规培养传代,在处理 前及处理后第2天和第5天收集细胞.分别行细胞涂 片和RNA提取.标本均置于一7O?冰箱中,待测. 1.2细胞株对ADR敏感性的检测 采用MTT比色法_4],将待测细胞接种于96孔板 中,敏感株和耐药株均为每孔0.8×10个细胞,加入 ADR和逆转剂,设空白对照和阴性对照孔,终体积为 0.2mL/~:L.孵育48h后,离心弃上清,加含MTT (华美生物工程公司,终浓度0.5mg/mL)的小牛血清 RPMI1640培养液,继续培养4h,离心弃上清,加二甲 基亚砜(Sigma)180mL/~:L显色,用酶标仪(Dynatech, Chantilly.VAUSA)在波长570nm下读取吸光度, 计算细胞生存率和半数抑制率(IC;.). 为防止ADR红色荧光对吸光度的影响,ADR超 过8mmol/L浓度的孔,同时设单独ADR对照孔.将 实验孔吸光度数值减去相应ADR浓度的对照孔本底 吸光度. 细胞生存率()一×100% T:实验组,U:对照组,B:本底 IC..应用目测生存曲线法求得. 逆转(增敏)倍数一 1.3RT.PCR RNA提取:应用TRIzol体系,根据书步骤进 行提取.逆转录反应:AMVRT等均为Promega公 司产品,按说明书进行.cDNA一20?保存.PCR分 析_5]:B—actin作为内标,靶基因为MDR1(引物序列 为5’-GTTGCCATTGACTGAAAGAAC一3’和5『_AC— AGGAGATAGGCTGGTTTGA一3’)和GSTpi(引物 序列为5’-ATGCTGCTGGCAGATCAG一3和5’-GTA一 李杰,等屈洛昔芬与丝墓董莶垒垫丝墅堕筮 GATGAGGGAGATGTATTTGCA一3).PCR扩增: PCR反应置GeneAmpPCRSystem9700(PE.USA) 中扩增,Taq酶等为Promega产品,反应条件:MDR1 和GSTpi基因均为:94?预变性1.5rain,然后94? 1.5min,54C1min,72.C3rain,共3O个循环 (TopolIa基因扩增35个循环),72?延伸10min. PCR产物在2琼脂糖凝胶(含EB0.3mg/L)上电泳 显示.条带在图象仪(AlphaInnotech,UsA)上 分析,应用特异性基因条带与B—actin基因条带的密度 比值计算表达强度. 1.4免疫细胞化学染色 采用ABC法,单抗为JSB-1(德国宝灵曼,1: 20),GSTpi(DAKO,1:25).二抗及ABC试剂为华 美生物工程技术公司产品.IHC判断标准:染色强度 与阳性细胞的百分率乘积>3分为免疫反应(+)_6]. 1.5细胞内药物积累分析 调整细胞数为5×10L_.,分别加入4mmol/L浓 度的ADR以及20mmol/L浓度的DRO和TAM, 37?孵育2h,收集细胞,应用流式细胞仪(FCM,Fac— scalibar,B.EUSA)在波长490nm下检测1×10细 胞内ADR的相对荧光强度. 1.6统计学分析 配对计量的t检验比较两组的差异,重复3 次独立的实验. 2结果 ADR对K562/A02的1C.为8mmol/L,K562为 0.58mmol/L,K562/AO2对ADR的耐药性较亲代 K562强14倍.DRO和TAM本身在20mmol/L浓 度及以下对K562两株细胞无影响. 2.1DRO和TAM增强细胞对ADR的化学敏感性 MTT法分析结果显示,DR0和TAM在2O,10 和5mmol/L浓度均能明显增加K562/A02对ADR 的敏感性.增敏倍数分别为14,13和4倍及15,13和 3.5倍,呈浓度依赖性(表1,Tab.1).两者在3个浓 度下比较增敏倍数差异无统计学意义. 2.2DRO和TAM对耐药基因mRNA表达的影响 K562/AO2的MDR1和GSTpi基因高表达,敏感 株的MDR1和GSTpi基因呈阴性表达.经DRO和 TAM(10mmol/L)分别处理后,MDR1和GSTpi基 因mRNA表达均在第2天开始降低,第5天表达水平 明显降低.而处理K562敏感株后第5天似乎有下降 的趋势,但差异无统计学意义.DRO和TAM分别处 理后第5天两种耐药基因的变化见表2(Tab.2). 2.3耐药基因蛋白表达 处理前K562/A02的P—gp和GSTpi蛋白表达强 阳性.K562敏感株P—gP和GSTpi蛋白表达阴性. 肿瘤防治杂志2笙旦箜!鲞笙塑旦垒!:垦垦:垦』.’.’ DRO和TAM处理后第5天,K562/A02的P—gP和 GSTpi蛋白表达接近消失(图1?Fig.1). 2.4DRO和TAM处理后细胞内ADR积累变化 处理前,K562/A02细胞内ADR的积累量明显小 于敏感株.DRO和TAM分别处理细胞后?发现 K562/A02细胞内ADR的积累有较大幅度增加,20 mmol/L的浓度处理后,DRO和TAM可分别增加 ADR积累2.9和3.0倍.而敏感株细胞内ADR的浓 度变化不明显(图2,Fig.2). 表1DRO和TAM对K562/A02耐药性的逆转 与同浓度的TAM比较,P一0.07,P一0.08,?P一0.06. Tab.1ReversalofeffectsofDROandTAMonMDRinK562/A02cellS P:0.07.P一0.08,?P一0.06,”USTAM(samec0ncentrati0n) 表2逆转剂分别处理K562/A02细胞5d后 耐药基因mRNA的变化 注:与13-actin的比值.实验重复3次,处理前. Tab.2MDR1andGSTpigenemRNAexpressioninDROand TAMpretreatedK562/A02cellsfor5days,respectively Note:Comparedwith~-actinratio.Assaysrepeated3times 3讨论 雌激素受体拮抗剂中逆转作用较强的药物为 TAM;研究证实,TAM可以与P—gP结合,抑制其功 能[7].但是,由于TAM可以引起明显的雌激素样效 应和肝功能损害等不良反应,难以在体内达到理想的 逆转浓度.DRO为第2代雌激素受体拮抗剂,DRO 在体内毒副反应较小口]. DRO对MCF7/ADR和K562/A02均有较强的逆 转作用,为了进一步明确DRO的逆转强度.我们与 TAM的逆转作用进行了同步比较.研究结果证实, DRO和TAM均能够明显逆转K562/A02的MDR, 可以使K562/AO2对ADR的敏感性显着提高.浓度 高低明显影响逆转效果,即呈浓度依赖性.在相同浓 度时,DRO和TAM的逆转倍数差异无统计学意义. 迄今,在对肿瘤细胞MDR机制的研究中证实, MDR1/P—gP的过度表达是最主要的因素之一,其他 逆转剂有抑制MDR1/P—gp表达的作用.我们的 研究结果表明,DRO和TAM对K562/A02的 MDR1/P—gP表达有明显抑制作用,mRNA和蛋白表 达的变化呈一致性,在处理第5天表达明显降低,P—gP 表达接近转为阴性. 我们对GSTpi进行了同步观察,发现DRO和 TAM也可明显ig2A6cUmulatio~afadrlamycininDROandTAM pretreatedK562AO2cellsrespectively Pp属ATP能量怅帻唰运输幕可增加药物外 排和降低内流研究征叫.雌i异2豢受悼拈抗剂可直 接与I’-gp一台埘州I.glI的外排功能我们应H4 Ft’M技术.舒圳呃察JDR()’IAM处I!K5L;:,啦 f扦舯K_ ??截 huJ_地内AI】k积累的情AuR,}=fill胞内的黄 光媸崖叫耻什高.升高懂扦相似f”J接叫r lIW,TAM同菜些遵转荆一样.睡有汽谊椰制 lJ_K讣排功能的怍用, 我们址寅丁DR(JTAM育?H的逆转 K5{~21,l】!曲怍Hj作用强度州蕾似部仆机制n 能下倜K562/AU2的MI小I】’gP卡u(,Ipi的达水 平”硬增加K562Af】=:胞内AI小?|j{仃蔓由r I)?)毒副反应鞍小.此.可能有临床直刑价值 【参考文献l lH…Mtm1d-1…TRPr~tl…l1c1日t1)rnloxll… _JJL?rT11.1994.8dc2l:1[标签:快照]