屈洛昔芬与他莫昔芬对K562/A02耐药性影响的比较
屈洛昔芬与他莫昔芬对K562,A02耐药性
影响的比较
肿瘤防治杂志2005年1月第12卷第1期(,HINJCANCE曼yT曼,!!::
屈洛昔芬与他莫昔芬对K562/A02
耐药性影响的比较
李杰,郭伟剑,夏鹏,陈瑛
1.上海第二医科大学新华医院肿瘤科.上海200092
2.复旦大学药学院,上海200092
?
41?
《基础?临床研究l
Comparativestudyoneffectsofdroloxifeneandtamoxifenonmultidrugresistance
inK562/A02cellliRe
LIJie,GUOWei—jian,XIAPeng,CHENYing.
1.DepartmentofOncology,XinhuaHospital,ShanghaiSecondMedicalUniversity,Shanghai200092.
P.R.China
2.PharmaceuticalCollege,FudanUniversity,Shanghai200092,P.R.China
【摘要】目的:比较屈洛昔芬
(droloxifene,DRO)和他莫昔芬
(tamoxifen,TAM)对K562/A02
耐药性的逆转作用.方法:应用
MTT法,RT-PCR和免疫细胞化
学染色观察细胞毒活性和
MDR1,GSTpi耐药基因表达变
化,采用流式细胞仪测定细胞内
多柔比星(ADR)浓度.结果:在
2O,1O和5mmol/L浓度时,DR0
和TAM均显着逆转K562/A02
的耐药性,DR0和TAM的逆转
倍数相比较差异无统计学意义.
MDR1和GSTpi的mRNA和蛋
白表达在DRO和TAM处理后第
2天开始降低,第5天出现明显降
低.20mmol/L浓度的DR0和
TAM分别孵育K562AO2,可使
其细胞内ADR积累分剐增加2.9
和3.0倍.结论:DR0与TAM
类似,有较强的逆转活性,可明显
抑制愀1和汀pi基因的表达
及增加细胞内ADR的积累.
肿瘤防治杂志,2005,12(1);41—44
EAnSrRAcr]oBJEcrIVE:T0studythereversaleffectsofdroloxifene(DR0)
andtamoxifen(1AM)onMDRinK562/A02.ME1[H0DS:K562eelllineresistant
toadriamycin(ADR)eellline(K562/AO2)andK562eelllinesensitivetoADR
(K562)weretreatedwithDR0andTAM.respectively.Byusingtetrazoliumdye
(MTT)assay,effectsofvariousconcentrationsofDROandTAMon?lRin
K562/A02wasstudied.Beforeandafterthetreatmentwith10mmol/IofDRO
andTAM,MDR1andGSTpigenes.expressionswereassayedbyreversetran—
scription-polymerasechainreaction(RT_PCR),immunocytochemistry(ICC)as—
say.Byusingflowcytometry(FCM),intracellularADRconcentrationwasmeas—
ured.RESULTS:DI的andTAMsignificantlyreversedMDRinK562/A02,re—
spectively.After2O,10,and5mmol/LofDRoandTAMtreatment,thereversal
timeshadsignificantdifferencesbetweenDROandTAM.After10mmol/LDRO
and1Mtreatment,bothMDR1andGSTpimRNAgenes,expressionsbeganto
declineonthesecondday,andsignificantlydecreasedonthefifthday,P<0.01.
ChangesofP-gpandGSTpiproteinexpressionsweresimilartothoseoftheirmR—
NAexDressions.Twohoursafter20mmol/LDR0andTAMtreatment,intracel—
lularADRconcentrationincreasedto2.9and3.0timesrespectively.However,
bothagentsdidnotsignificantlyincreaseADRaccumulationinK562.0ONCLU—
S10NS:ReversalactivityofDR0issimilartothatofTAM.Bothagentshave
strongreversaleffects.Thereverseisviadifferentroutes,i.e,downregulating
mRNAandproteinexpressionlevelsofMDR1/P-gpandGSTpi,andincreasingin—
tracellulardrugconcentration.SinceDROhaslowtoxicity,itmighthavegood
prospectsinclinicalapplication.
,ncer尸revTreat,2005,l2(1):4l一44
【关键词】雌激素拮抗剂;他莫昔芬;K562细胞/药物作用;药物耐受性
~KEYWORDS]estrogenantagonists;tamoxifenK562cells/drugeffects;drugtolerance
【基金项目】上海市教委课题资助(O2BK15)
【通讯作者简介】李杰,男,山东昌邑人,博士,教授,主要从事
肿瘤内科及个体化治疗的研究工作.
Tel:86—21—65010796E-mail:jie-li@CSCO.org.cn
屈洛昔芬(droloxifene,DRO)是他莫昔芬(tamox—
ifen,TAM)的类似物,但毒副反应较小.我们既往
研究结果证实,DRO具有多药耐药(maltidnugresist—
ance,MDR)的逆转作用.TAM是经典的MDR
逆转剂,为比较DRO的逆转强度,我们从细胞内药物
积累和MDR1/P糖蛋白(P—glycoprotein,P—gp),谷胱
甘肽一S一转移酶p(glutathioneS—transferasepi,GST—
pi)的mRNA和蛋白变化等几方面,进一步对DRO和
TAM逆转多柔比星(ADR)诱导的K562耐药细胞株
(K562/A02)MDR的作用进行了比较观察.
1材料与方法
1.1细胞培养及药物处理
K562敏感细胞株(K562)及K562/A02引自上海
市肿瘤研究所,建株于中国医科院天津血液研究所.
在37.C,5CO.充分湿度下培养于含12小牛血
清,青链霉素各100U/mL的RPMI1640培养液中.
K562/AO2维持在2mmol/L浓度的ADR中,实验前
无药培养2周,对数生长期的细胞用于实验.
DRO和TAM(均由复旦大学药学院提供)处理细
胞:调整细胞数为1OL_.,处理组分别加入1O
mmol/L浓度的DRO和TAM常规培养传代,在处理
前及处理后第2天和第5天收集细胞.分别行细胞涂
片和RNA提取.标本均置于一7O?冰箱中,待测.
1.2细胞株对ADR敏感性的检测
采用MTT比色法_4],将待测细胞接种于96孔板
中,敏感株和耐药株均为每孔0.8×10个细胞,加入
ADR和逆转剂,设空白对照和阴性对照孔,终体积为
0.2mL/~:L.孵育48h后,离心弃上清,加含MTT
(华美生物工程公司,终浓度0.5mg/mL)的小牛血清
RPMI1640培养液,继续培养4h,离心弃上清,加二甲
基亚砜(Sigma)180mL/~:L显色,用酶标仪(Dynatech,
Chantilly.VAUSA)在波长570nm下读取吸光度,
计算细胞生存率和半数抑制率(IC;.).
为防止ADR红色荧光对吸光度的影响,ADR超
过8mmol/L浓度的孔,同时设单独ADR对照孔.将
实验孔吸光度数值减去相应ADR浓度的对照孔本底
吸光度.
细胞生存率()一×100%
T:实验组,U:对照组,B:本底
IC..应用目测生存曲线法求得.
逆转(增敏)倍数一
1.3RT.PCR
RNA提取:应用TRIzol体系,根据说明书步骤进
行提取.逆转录反应:AMVRT等均为Promega公
司产品,按说明书进行.cDNA一20?保存.PCR分
析_5]:B—actin作为内标,靶基因为MDR1(引物序列
为5’-GTTGCCATTGACTGAAAGAAC一3’和5『_AC—
AGGAGATAGGCTGGTTTGA一3’)和GSTpi(引物
序列为5’-ATGCTGCTGGCAGATCAG一3和5’-GTA一
李杰,等屈洛昔芬与丝墓董莶垒垫丝墅堕筮
GATGAGGGAGATGTATTTGCA一3).PCR扩增:
PCR反应置GeneAmpPCRSystem9700(PE.USA)
中扩增,Taq酶等为Promega产品,反应条件:MDR1
和GSTpi基因均为:94?预变性1.5rain,然后94?
1.5min,54C1min,72.C3rain,共3O个循环
(TopolIa基因扩增35个循环),72?延伸10min.
PCR产物在2琼脂糖凝胶(含EB0.3mg/L)上电泳
显示.条带在图象
仪(AlphaInnotech,UsA)上
分析,应用特异性基因条带与B—actin基因条带的密度
比值计算表达强度.
1.4免疫细胞化学染色
采用ABC法,单抗为JSB-1(德国宝灵曼,1:
20),GSTpi(DAKO,1:25).二抗及ABC试剂为华
美生物工程技术公司产品.IHC判断标准:染色强度
与阳性细胞的百分率乘积>3分为免疫反应(+)_6].
1.5细胞内药物积累分析
调整细胞数为5×10L_.,分别加入4mmol/L浓
度的ADR以及20mmol/L浓度的DRO和TAM,
37?孵育2h,收集细胞,应用流式细胞仪(FCM,Fac—
scalibar,B.EUSA)在波长490nm下检测1×10细
胞内ADR的相对荧光强度.
1.6统计学分析
配对计量资料的t检验比较两组的差异,重复3
次独立的实验.
2结果
ADR对K562/A02的1C.为8mmol/L,K562为
0.58mmol/L,K562/AO2对ADR的耐药性较亲代
K562强14倍.DRO和TAM本身在20mmol/L浓
度及以下对K562两株细胞无影响.
2.1DRO和TAM增强细胞对ADR的化学敏感性
MTT法分析结果显示,DR0和TAM在2O,10
和5mmol/L浓度均能明显增加K562/A02对ADR
的敏感性.增敏倍数分别为14,13和4倍及15,13和
3.5倍,呈浓度依赖性(表1,Tab.1).两者在3个浓
度下比较增敏倍数差异无统计学意义.
2.2DRO和TAM对耐药基因mRNA表达的影响
K562/AO2的MDR1和GSTpi基因高表达,敏感
株的MDR1和GSTpi基因呈阴性表达.经DRO和
TAM(10mmol/L)分别处理后,MDR1和GSTpi基
因mRNA表达均在第2天开始降低,第5天表达水平
明显降低.而处理K562敏感株后第5天似乎有下降
的趋势,但差异无统计学意义.DRO和TAM分别处
理后第5天两种耐药基因的变化见表2(Tab.2).
2.3耐药基因蛋白表达
处理前K562/A02的P—gp和GSTpi蛋白表达强
阳性.K562敏感株P—gP和GSTpi蛋白表达阴性.
肿瘤防治杂志2笙旦箜!鲞笙塑旦垒!:垦垦:垦』.’.’
DRO和TAM处理后第5天,K562/A02的P—gP和
GSTpi蛋白表达接近消失(图1?Fig.1).
2.4DRO和TAM处理后细胞内ADR积累变化
处理前,K562/A02细胞内ADR的积累量明显小
于敏感株.DRO和TAM分别处理细胞后?发现
K562/A02细胞内ADR的积累有较大幅度增加,20
mmol/L的浓度处理后,DRO和TAM可分别增加
ADR积累2.9和3.0倍.而敏感株细胞内ADR的浓
度变化不明显(图2,Fig.2).
表1DRO和TAM对K562/A02耐药性的逆转
与同浓度的TAM比较,P一0.07,P一0.08,?P一0.06.
Tab.1ReversalofeffectsofDROandTAMonMDRinK562/A02cellS
P:0.07.P一0.08,?P一0.06,”USTAM(samec0ncentrati0n)
表2逆转剂分别处理K562/A02细胞5d后
耐药基因mRNA的变化
注:与13-actin的比值.实验重复3次,处理前.
Tab.2MDR1andGSTpigenemRNAexpressioninDROand
TAMpretreatedK562/A02cellsfor5days,respectively
Note:Comparedwith~-actinratio.Assaysrepeated3times
3讨论
雌激素受体拮抗剂中逆转作用较强的药物为
TAM;研究证实,TAM可以与P—gP结合,抑制其功
能[7].但是,由于TAM可以引起明显的雌激素样效
应和肝功能损害等不良反应,难以在体内达到理想的
逆转浓度.DRO为第2代雌激素受体拮抗剂,DRO
在体内毒副反应较小口].
DRO对MCF7/ADR和K562/A02均有较强的逆
转作用,为了进一步明确DRO的逆转强度.我们与
TAM的逆转作用进行了同步比较.研究结果证实,
DRO和TAM均能够明显逆转K562/A02的MDR,
可以使K562/AO2对ADR的敏感性显着提高.浓度
高低明显影响逆转效果,即呈浓度依赖性.在相同浓
度时,DRO和TAM的逆转倍数差异无统计学意义.
迄今,在对肿瘤细胞MDR机制的研究中证实,
MDR1/P—gP的过度表达是最主要的因素之一,其他
逆转剂有抑制MDR1/P—gp表达的作用.我们的
研究结果表明,DRO和TAM对K562/A02的
MDR1/P—gP表达有明显抑制作用,mRNA和蛋白表
达的变化呈一致性,在处理第5天表达明显降低,P—gP
表达接近转为阴性.
我们对GSTpi进行了同步观察,发现DRO和
TAM也可明显ig2A6cUmulatio~afadrlamycininDROandTAM
pretreatedK562AO2cellsrespectively
Pp属ATP能量怅帻唰运输幕可增加药物外
排和降低内流研究征叫.雌i异2豢受悼拈抗剂可直
接与I’-gp一台埘州I.glI的外排功能我们应H4
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能下倜K562/AU2的MI小I】’gP卡u(,Ipi的达水
平”硬增加K562Af】=:胞内AI小?|j{仃蔓由r
I)?)毒副反应鞍小.此.可能有临床直刑价值
【参考文献l
lH…Mtm1d-1…TRPr~tl…l1c1日t1)rnloxll…
_JJL?rT11.1994.8dc2l:1[标签:快照]