【word】 活的非可培养状态下的粪肠球菌的研究进展

【word】 活的非可培养状态下的粪肠球菌的研究进展 活的非可培养状态下的粪肠球菌的研究进 展 国际口腔医学杂志第38卷4期2011年7月www.gjkqyxzz.cn 活的非可培养状态下的粪肠球菌的研究进展 鄂佳综述梁景平审校 (上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔内科;上海市口腔医学重点实验室上海200011) 【摘要】活的非可培养(VBNC)状态是细菌在不利的环境条件下的一种生理状态,进入VBNC的细菌其生物学特 性将发生一系列的变化,无法用常规的培养进行.对这一生存方式的研究,将对传统的微生物学研究 产生深远的影响.本文就粪肠球菌在VBNC状态的诱导,粪肠球菌进入VBNC状态的生物学特性变化,粪肠球 菌进入VBNC状态的检测,VBNC细菌的复苏等研究进展作一综述. 【关键词】活的非可培养;粪肠球菌;生物学特性;复苏 【中图分类号】R780.2[文献标志码】A【doi】10.3969/j.issn.1673—5749.2011.04.017 Researchprogressonvariablebutnon-culturablestateinEnterococcusfaecal isE嘎LiangJingping. (Dept.ofOralMedicine,TheNinthPeople’SHospital,SchoolofMedicine,S hanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai 200011,China;KeyLaboratoryofShanghaiStomatology,TheNinthPeople’SHospital,SchoolofMedicine,Shanghai JiaoTongUniversity,Shanghai200011,China) [Abstract】 Theviablebutnon-cuhurable(VBNC)stateisaphysiologicalstatewhenbacteriaareexposedtoad— verseenvironments.ThebiologicalcharacteristicsofbacteriaenteringtheVBNCstateoccuraseriesofchanges, andbacteriacan’tbetestedviaconventionalculturemetheds.Itwillbegreatsignificancetotheworkoncon- ventionalmicrobiology.ThispapersummarizedthemethodsofEnterococcusfoecalisenteringinandresumingfrom theVBNCstate.Somemethodsformonitoringandthebiologicalcharacteristicsweresuggested. 【Keywords】 variablebutnon-culturable;Enterococcusfaecdis;biologicalcharacteristics;resuscitation 细菌的活的非可培养(variablebutnon—cul— turable,VBNC)状态于1982年提出,即细菌具有 生物活性和致病性,但用常规培养法检测不出来 的一种特殊存活形式,这种状态下的细菌在特定 条件下可以复苏并具有致病性[1】.VBNC状态的细 菌不再分裂增殖但保持其活性,即仍具有潜在致 病性以及代谢活性和基因达等生物学特性[2. 此状态是细菌面对外周环境压力和恶劣的环境时 激活的一种存活机制,这些环境压力包括地表水 营养不足,盐分质量浓度偏高,非理想温度或太 阳辐射等阁.VBNC状态虽然已得到认同,但其形 成机制尚不清,故备受关注.肠球菌既是人体内 的正常菌群,也是引起感染的一种常见致病菌[6-7], 特别是比较严重的疾病和医院内感染.在面对细 菌素,抗生素等毒性物质或铁缺乏和免疫反应等 不利环境时,可活化肠球菌的压力反应机制嘲,使 【收稿日期】2010—03—28;【修回日期】2011-03-24 【基金项目】国家自然科学基金资助项目(30973321) 【作者简介】鄂佳(1984一),女,黑龙江人,博士 【通讯作者】梁景平,Tel:021—63135214 其进入VBNC状态,从而在不利条件下继续存活, 当条件适宜时再恢复其致病性,造成感染. 1粪肠球菌在活的非可培养状态下的诱导 自1982年提出VBNC状态这一概念以来, 对细菌这一状态的研究多集中于革兰阴性菌,已 报道的诱导方法也多集中于理化条件的改变,如 温度,营养条件,通风和光照等,并因菌种的不 同,其诱导方法也有较大的差异.例如升高温度 至25?可使空肠弯曲菌进入VBNC状态,而诱导 创伤弧菌时则需将温度降至l0?.作为革兰阳性 菌的粪肠球菌也存在VBNC状态,例如将湖水过 滤消毒制成寡营养环境,在4c【=,直接光照条件 下培养30d,可以使粪肠球菌进入VBNC状态[21. 这说明寡营养和低温是诱导粪肠球菌进入状态的 关键因素.Signoretto等【3I9】将4的生井水培养 l620d后获得粪肠球菌的VBNC状态,大大缩 短了培养时间.Heim等?在粪肠球菌的蛋白质组 研究中采用湖水过滤消毒后在(4?0.5)?下培养, 并将其置于4个100W的灯泡中间大约60cm处 国际口腔医学杂志第38卷4期2011年7月www.gjkqyxzz.C/1 2周,细菌进入VBNC状态,充分利用了可见光 对诱导的作用.Signoretto呗0仅采用(4?O.5)oC 的过滤消毒湖水使细菌进入VBNC状态,更加大 大简化了诱导方法. 2粪肠球菌在活的非可培养状态下的生物学特性 细菌进入VBNC状态后,其生理学,生物化 学和遗传学特性都将发生一系列变化[,以帮助 细菌适应环境改变.这些变化主要包括其形态学 改变,代谢改变和基因表达等.VBNC细胞在营 养运输,呼吸率和大分子生成方面都有所降低, 但可生成新的压力蛋白,细胞膜的脂肪酸组成和 细胞壁的肽聚糖结构发生改变【3],可进行基因表 达[13].这些变化对于细菌VBNC状态发生机制的 研究和实际应用具有重要的指导意义. 粪肠球菌在VBNC状态下,胞体发生轻微的 伸长,但其仍然具有生存和代谢活性回,可进行 基因表达并有特异性蛋白质作用.作为活细胞其 胞膜完整,而细胞壁结构发生改变翻,且具有潜 在的致病性,不能在传统的培养基中生长,在一 定条件下可以复苏t41,恢复其可培养能力和致病 力.Lle6等[14】发现,粪肠球菌在恶劣条件下,9, 12d即可快速地丧失可培养性,但仍能够形成中 等密度的生物膜,虽然效率较之对数生长期有所 降低,但此时的粪肠球菌仍保持黏附能力,能够 完成细菌感染的第1步:黏附旧.Pfeffer等19]发现 在VBNC下的粪肠球菌菌体的细胞壁肽聚糖O乙 酰化水平增加,且相对于其他状态,肽聚糖的溶 解量也最少,支持其VBNC细菌通过改变细胞壁 结构来抵抗环境压力的假说. 3粪肠球菌在活的非可培养状态下的检测 根据对细菌VBNC的定义可知,此状态的细 菌要求是可培养菌数为零而活菌数不为零.可培 养细菌总数的记录,用平板菌落计数法.10mL 菌液涂平板后,若其集落生成单位小于1,则细 菌进入VBNC状态.活菌数的测定多采用改良 的直接活菌计数法LIvE/DEADBaclight染色,后 者通过荧光染色剂SYTO9和碘化丙啶(propidium iodide,PI)来评价细胞膜的完整性.SYT09可快 速穿透任何细胞壁与DNA结合;PI则不能穿透 完整细胞壁,只能与不完整细胞的DNA结合,但 在死细胞中可代替SYT09与DNA结合.在激光 共聚焦显微镜下:呈明亮绿色荧光者是经SYTO9 染色的完整细胞,即活菌;而呈红色荧光的,则 是死菌.但此法在实际应用中需配合平板计数法, 才可确定细菌的进入状态. 记录细菌总数多采用荧光显微镜吖啶橙计数 法或roodZBI/ZMcouher计数器.由于mRNA在 细胞代谢过程中的中心地位以及短暂的半衰期, 故mRNA成为鉴定细胞存活与否的重要标志性分 子,在体内或体外条件下[12】,两者均可实现对细 菌生存性的检测.RT—PCR技术以粪肠球菌中青 霉素结合蛋白一5基因作为特异性引物,通过检测 该基因转录的mRNA来判断粪肠球菌是否具有生 存活性,是基于分子水平的检测细菌存活与否的 技术,具有严格的特异性和高度的敏感性.对于 细菌生成的蛋白质等分子的研究,Heimol通过 双向电泳比较了对数增长期,饥饿状态和VBNC 状态下粪肠球菌全菌体表面蛋白表达的差异.Sa— chdanandhamq通过冻融去除可培养细胞,再通 过流式细胞技术检测VBNC状态. 4活的非可培养状态下的细菌复苏 随着细菌的复苏,其致病能力也随之恢复; 因此,VBNC状态的细菌若能再次获得可培养性, 即可复廿【坦7】;但是,复苏是一个极其复杂的过 程,涉及诸多复杂的条件和因素.Yamamoto[司将 复苏因素分为消除诱导因素(环境压力),修补损 伤和功能的再活化,信号分子的加入(作为刺激因 子和生理调节的调控子起作用)3类,这三类因素 至今仍是研究者参考的重要分类方法. 在通常情况下,消除诱导因素即可使细菌从 VBNC状态复苏到可培养状态,如增加营养物质, 改变环境温度,取消光照条件等;但随着菌种的 不同,甚至同种细菌品系的不同,复苏方法也有 较大的差异,某些复苏还很难实现[19-2o].如乳酸 杆菌的复苏需要将菌液加入到乳酸细菌培养基中 并加入表面活性剂聚山梨酯一80(pH7.2,7.6),而 辛辛那提弧菌的复苏则需在酵母提取物蛋白胨培 养基中加入维生素B复合物或过氧化氢酶,并适 当升温才能得以实现[2】】.白2001年Lleb等[41提出 粪肠球菌和其他肠球菌可复苏以来,诸多学者以 不同的方法成功地将粪肠球菌从VBNC状态复苏 至可培养状态;但是所有的复苏都需要在液态培 养基中进行,然而在平板上则尚未获得成功.Sj noretto参考Lleb等[41方法将1mL菌液加入9mL 胰蛋白胨大豆肉汤培养液(tryptones0vbeanbroth, ?432? TsB)中于37?培养3d.Pfeffer等[91将菌液加入到 5mL的TSB后,再将其稀释至5%并于37?振荡 (200r?min)过夜.Lle6等it4】尝试用11SB加质量分 数0.5%的葡萄糖于37o【=过夜,细菌复苏取得成 功.成功掌握将粪肠球菌由不可培养状态复苏为 可培状态,对后续研究具有重要的意义. 5结语 诸多细菌可进入VBNC状态,且种类还有不 断增加的趋势【.细菌的VBNC状态具有重要的 理论和实践意义,涉及医学,微生物学,食品卫 生和水产品养殖等诸多领域.遗憾的是:VBNC 状态的具体机制,此状态的细菌对其他状态的细 菌,正常细胞以及生物机体的影响机制尚不清; 再者,VBNC状态与饥饿状态,受损状态,芽孢 状态等生理学差异也是有待解决的问题. 6参考文献 XuHS,RobertsN,SingletonFL,etaLSurvivalandvia- bilityofnonculturableEscherichiacoliandVibriocho- leraeintheestuarineandmarineenvironment[33.Micro- bialEcology,1982,8(4):313-323. LlebMM,MC,CanepariP.NoncuhurableEnteroco- eell~faecdiscellsaremetabolicallyactiveandcapable ofresumingactivegrowth叨.SystApplMierobiol,1998, 21(3):333—339. SignorettoC,LlebMM,TaftMC,eta1.Cellwallchemi- calcompositionofEnterococcusfaecalisintheviable butnoneulturablestate[33.ApplEnvironMicrabiol,2000, 66(5):1953,1959. Ue6MM,BonatoB,IIa五MC,eta1.Resuscitationrate indifferententerococcalspeciesintheviablebutnon- euhurablestate[J].JApplMicrobiol,2001,91(6):1095- 1102. SintonLW.Bioticandabioticeffects[M]//BelkinS,Col- wellRR.OceansandHealth:Pathogensinthemarine environment.NewYork:SpringerUS,2005:69-92. dePerioMA,YarnoldPR,WarrenJ,eta1.Riskfactom andoutcomesassociatedwithnon-Enterococcusfaecalis, non-Enterococcusfaeciumenterococcalbacteremia[J].In- feetControlHospEpidemiol,2006,27(1):28—33. PrakashVP,RanSR,ParijaSC.Emergenceofunusual speciesofenterococcicausinginfections,SouthIndia[33. BMCInfectDis.2005,5(1):14. GeorgeS,KishenA,SongKP.Theroleofenvironme— ntalchangesonmonospeciesbiofilmformationonroot 国际口腔医学杂志第38卷4期2011年7月W3qW.gjkqyxzz.cn canalwallbyEnterococcusfaecalis.JEndod,2005, 31(12):867—872. PfefferJM,StrafingH,WeadgeJT,eta1.Pepfidoglycan 0acetylationandautolysinprofileofEnterococcu~血一 cintheviablebutnoneuhurablestate叨.JBacteriol, 2006.188(3):902-908. HeimS,?ebMM,BonatoB,eta1.Theviablebutn0n- etdturablestateandstarvationaredifferentstressrespon- $esofEnterococcusfaecdis,asseterminedbyproteome analysis[33.JBacteriol,2002,184(23):6739-6745. SignorettoC,BurlacchiniG,PruzzoC,eta1.Persistence ofEnterococcusfaecdisinaquaticenvironmentsviasu— rfaceinteractionswithcopepods[33.ApplEnvironMicro— bid,2005,71(5):2756—2761. OliverJD.Theviablebutnoneulturablestateinbacteria 们.JMicrobiol,2005,43:93-100. SmithB,OliverJD./nsituandinvitrogeneexpression byVibriovulnificusduringentryinto,persistencewithin, andresuscitationfromtheviablebutnonculturablestate [33.ApplEnvironMicrobial,2006,72(2):1445—1451. Ue6MM,BonatoB,1MC,etaLAdhesiontomedica[ devicematerialsandbiofilmformationcapabilityofsome speciesofenterococciindifferentphysiologicalstates[33. FEMSMierobiolLett,2007,274(2):232-237. FuxCA,CostertonJW,StewartPS,eta1.Survivalstra— tegiesofinfectiousbiofilms[33.TrendsMicrobiol,2005, 13(1):34—40. SachidanandhamR,GinKY,PohCL.Monitoringofae- tivebutnon-culturablebacterialceilsbyfloweytometry 叨.BioteehnolBioeng,2005,89(1):24-31. KeepNH,WardJM,RobertsonG,eta1.Bacterialresu— scitationfactors:Revivalofviablebutnon—culturable bacteria[J].CellMolLifeSci,2006,63(22):2555-2559. YamamotoH.Viablebutnonculturablestateasageneral spere-formingbacteria,anditsmo- phenomenonofnon— deling[J].JInfectChemother,2000,6(2):112-114. VattakavenT’BondP,BradleyG,etatDifferentialel- restsoftemperatureandstarvationoninductionofthe viable-but-noneulturablestateinthecoralpathogensVi— brioshiloiandVibriotasmoaiensis[33.ApplEnvironMi— crobiol,2006,72(1O):6508—6513. DuM,ChenJ,ZhangX,eta1.Retentionofvirulence inaviablebutnonculturableEdwardsiellatardaisolate [33.ApplEnvironMicrobiol,2007,73(4):1349—1354. ZhongL,ChenZhangXH,eta1.EntryofVibrioci- ncinnatiensisintoviablebutnonculturablestateandits resuscitation[33.LettApplMicrobiol,2009,48(2):247— 252. (本文编辑汤亚玲) 研q印刀刚伽 pnHnnnn?nn口