乳鼠心肌成纤维细胞培养方法的改进

乳鼠心肌成纤维细胞培养方法的改进 乳鼠心肌成纤维细胞培养方法的改进 陈勇兵陈如坤陈力吴明施立杨文涛钱永跃 【摘要】目的建立乳鼠心肌成纤维细胞培养模型.方法通过对经典的差速贴壁分 离法稍 作改进,采用每次贴壁60min,两次差速贴壁分离法收集,培养心肌成纤维细胞.结 果形态学观察 和免疫细胞化学染色鉴定显示,成功培养心肌成纤维细胞,纯度达95以上.结论该 研究成功建 立乳鼠心肌成纤维细胞培养模型,为高纯度心肌成纤维细胞的获得和对其病理生 理学的进一步研究 打下良好基础. 【关键词】心肌成纤维细胞;细胞培养 AmodificationofthemodelestablishmentforcellcultureofneonatalratmyocardialfibroblastsCHE? Yongbing,aRukun,CHE?Li,eta1.DepartmentofThoracicandCardiovascularSurgery, SecondAfflictedHospita1.SoochowUniversity,Suzhou215004,cHlNA [Abstract]ObjectiveToestablishthemodelofcellcultureofneonatalratmyocardialfibro— blasts.MethodsNeonatalratmyocardialfibroblastswereisolatedandculturedwithamodifiedtech— niqueofdifferentialanchoringvelocityfortwicewith60mineachMorphologiccharactersofthose cellswereobservedwiththeinvertedmicroscope.Imrnunocytochemicalstainingwasusedtoevaluate andconfirmthemyocardialfibroblasts.ResultsThemorphologicalobservationandimmunocyto— chemicalstainingUSedtoconfirmthemyocardialfibroblastsshowedthatthepurityofcellsc ultured wasmorethan95.ConclusionThemodelofcellcultureofneonatalratmyocardialfibroblasts was successfullyestablished,whichhaslaidgoodfoundationforfurtherresearchonmyocardialfi broblasts. [KeywordslMyocardialfibroblastCellculture 心脏由心肌细胞和非心肌细胞组成.非心肌细 胞占细胞总数的709/6,其中90以上的非心肌细胞 由心肌成纤维细胞组成.近年来,人们逐渐了解到 非心肌细胞不仅对心肌细胞具有结构上的支持,保 护作用,而且还具有自分泌和旁分泌功能,影响心肌 细胞的结构和生理功能,因此,对心肌成纤维细胞的 生理学研究成为现代心血管领域研究的一个重 点[1].本研究通过对常规乳鼠心肌成纤维细胞培 养方法的改进,建立一个纯度更高的细胞培养模型, 为进一步深化心肌成纤维细胞的生理学研究打下 基础. 材料与方法 一 ,动物和试剂 1,4日的SD大鼠乳鼠(浙江省实验动物中心 提供);DMEM培养基(GIBCO公司);胎牛血清 (FCS,杭州四季清生物技术材料研究所);胰蛋白酶 基金项目:苏州大学青年基金;浙江省医药卫生科学研究基金 (编号2000A110) 作者单位:215004苏州大学附属第二医院胸心外科(陈勇兵, 施立,杨文涛,钱永跃);浙江大学附属第二医院胸心外科(陈如坤, 陈力,吴明) ? 论着? (Sigma公司);肌动蛋白,波形蛋白单克隆抗体一免 疫细胞化学染色第一抗体(MaximBiotech,Inc.公 司产品);即用型S-P免疫细胞化学染色超敏试剂盒 (福州迈新生物技术开发公司);CO.培养箱,无菌 超净台,离心机(均为德国Heraeus公司产品);倒 置显微镜(日本Olympus公司). 二,心肌成纤维细胞的分离和培养 无菌条件下开胸取出SD大鼠乳鼠心脏,立即 置人4?D-Hanks液中剪取心室肌,洗净残血,剪 成约1mm.大小的碎块,弃去D-Hanks液,加人 0.1胰蛋白酶于37?水浴并在磁力搅拌器上(速 率100r/min)消化细胞,每15分钟收集一次消化悬 液,直至组织块消失.每次收集的消化悬液,加等量 含49/6胎牛血清的DMEM培养液(pH7.2)终止消 2000r/min)后所得的全部细胞用含10 失,离心( 胎牛血清的DMEM培养液(pH7.2)制成细胞悬液, 分种于25玻璃培养瓶中,置37?,5C02培养箱 内培养60min,留下贴壁细胞继续培养,未贴壁的细 胞混悬液分瓶后在同样条件下再培养60min,再收集 贴壁细胞.根据心肌细胞和心肌成纤维细胞贴壁时 2005年3月第31卷第3期JiangsuMedJ,March2005.vol31.No.3 问的不同,成纤维细胞贴壁速度较快,先附于瓶底. 这样采用反复差速贴壁1h,获得成纤维细胞.培养 心肌成纤维细胞2,3d至8o,9o细胞融合,用 0.15oA胰蛋白酶消化传代(1:3).第2,4代细胞 用于实验. 三,心肌成纤维细胞的鉴定 1.病理形态学观察用倒置显微镜观察心肌 成纤维细胞的形态学特征. 2.免疫病理学鉴定用免疫细胞化学染色方 法. 结果 一 ,心肌成纤维细胞的形态特征 倒置显微镜下观察,心肌成纤维细胞生长迅速, 2,3d即呈融合状态,细胞排列紧密,有的交叉重叠 生长,与心肌细胞不同,心肌成纤维细胞呈梭形,胞 体较大,细胞浆透明,细胞核较大,呈椭圆形,通常含 2,3个核,无自发性搏动(见封二图1). 二,SP免疫细胞化学染色结果 心肌成纤维细胞波形蛋白呈强阳性反应,即细 胞浆内围绕细胞核呈棕褐色颗粒状改变,阳性率在 95以上(见封二图2);肌动蛋白呈阴性反应,即细 胞浆内围绕细胞核呈棕褐色颗粒状改变数在5以 下(见封二图3);心肌成纤维细胞波形蛋白免疫细 胞化学染色空白对照呈阴性(见封二图4). 讨论 一 ,心肌成纤维细胞与心肌细胞的分离和纯化 心脏细胞包括心肌细胞和心肌问质细胞,心肌 问质细胞中,心肌成纤维细胞占绝大多数,研究心肌 成纤维细胞和心肌细胞在心脏疾病的发生,发展,心 血管药物作用机制及这两种细胞之间的相互作用, 已越来越受到人们的关注.心肌成纤维细胞与心肌 细胞的分离和纯化是心脏生理学研究中非常重要的 一 个环节,大多采用差速贴壁分离法.经典的差速 贴壁分离法是:用胰蛋白酶消化心肌组织所得的混 合细胞悬液,接种在适当大小的培养瓶中,37?静置 9O分钟,轻轻振摇后倾出尚未贴壁的心肌细胞,可 得纯度大于9O的心肌成纤维细胞.所取贴壁的 时间各有不同.短到2O分钟,长至3小时,通常以 9O分钟多用.此方法具有操作简便,用时短,对细 胞影响小,分离纯度高等优点,国外实验室也大多采 用该方法.该法收集到的纯度较高的心肌成纤维细 胞,可用于多种实验研究l3"].本实验在这基础上 稍作改进,采用每次贴壁6O分钟,两次差速贴壁分 离法收集心肌成纤维细胞,培养的心肌成纤维细胞 的纯度达95以上,为高纯度心肌成纤维细胞的获 得和对其病理生理学的进一步研究打下良好基础. 二,心肌成纤维细胞的鉴定 形态学鉴别倒置显微镜下观察,心肌细胞 1. 胞体较小,胞质颜色较深,有颗粒样物质;细胞核小, 呈圆形,通常为一个核;在生长过程中心肌细胞互相 连接聚集成簇,呈现自发同步化搏动.心肌成纤维 细胞形态学特征如上述,且培养的心肌成纤维细胞 分裂增殖旺盛,但相互不聚集成团.此外,心肌细胞 传代后可逐渐丧失自发性搏动的特点,而传代培养 的成纤维细胞传代后则基本保留了原代培养的特 点,并能进一步提高其纯度及获得大量细胞.本实 验研究中所获心肌成纤维细胞和心肌细胞的形态学 特征均与此相符. 2.SP免疫细胞化学方法即用型SP免疫细 胞化学染色超敏试剂盒是根据链霉菌抗生物素蛋白 一 过氧化酶连接系统设计的用于检测细胞中抗原的 高度敏感试剂盒.由于采用了改良的酶标记术和亲 和纯化技术,使得该试剂盒的染色方法作为免疫学 和免疫病理诊断的一种可靠检测工具,其具有较高 的敏感性,心肌细胞和心肌成纤维细胞的鉴定用免 疫细胞化学方法加以鉴定更为可靠.心肌细胞用肌 动蛋白(肌原节)单克隆抗体,成纤维细胞用波形蛋 白单克隆抗体作一抗,以PBS作阴性对照.本实验 SP免疫细胞化学染色结果进一步证明了我们培养 的心肌成纤维细胞及心肌细胞的可靠性,如此高纯 度的细胞培养模型为对心肌成纤维细胞的分子水平 的生理学研究奠定了基础. 参考文献 1YuH,GallagherAM,GarfinPM,eta1.Prostacyclinreleaseby ratcardiacfibroblasts.Hypertension,1997.30:1047—1053. 2GuoWN,KamiyaK,KadaKJ,eta1.Regulationofcardiackv1.5 K一一channelexpressionbycardiacfibroblastsandmechanica1load inculturednewbornratventricularmyocytes.JMolCellCardio1. 1998,30:157—166. 3AcostaD,LiCP.Injurytoprimaryculturesofratheartendothe— lialcellsbyhypoxiaandglucosedeprivation.InVitrol,l992.15: 929—934. 4洪华山,林岚,王一波,等.胰岛素促进心肌成纤维细胞增殖和心 肌细胞肥大的作用.中国病理生理杂志.2002.18:505—509. (收稿日期:2004—04—19) 乳鼠心肌成纤维细胞培养方法的改进 目I倒显链F叭戒纤维细蛆x4(I 维甲酸的兔视网膜组织学毒性