[doc] 不结球白菜ISSR反应条件的优化

[doc] 不结球白菜ISSR反应条件的优化 不结球白菜ISSR反应条件的优化 分子植物育种,2007年,第5卷,第6(S)期,第207—212页 MolecularPlantBreeding,2007,Vo1.5,No.6(S),207—212 新思路,新技术,新方法 NovelThinking&Technology 不结球白菜ISSR反应条件的优化 马金骏,2冒维维,2朱玉英陈学好z陈锦秀-薄天岳-’ 1农业科学院园艺研究所,上海市设施园艺技术重点实验室,上海,201106;2扬州大学园艺与植物保护学院,扬州,225009 ‘通讯作者,tybo@sans.sh.cn 摘要本文通过单因素试验确定了TaqDNA聚合酶,dNTP,引物和M4种因素在不结球白菜ISSR反 应体系中的适宜浓度范围,并在此基础上利用正交试验设计,从4种因素3个水平对不结球白菜ISSR反应 体系进行了优化,确立了适合不结球白菜的ISSR反应体系,并在l0个不结球白菜品种中进行了验证.在 20反应体系中,含TaqDNA聚合酶lU,dNTP0.25mmol/L,引物0.25)~nol/L,lxPCRbuffer,M 2.5mmol/L,模板DNA30ng.通过梯度PCR测验和总循环次数梯度处理试验,确定了适宜的退火温度和总 循环数.这一体系的建立为今后利用ISSR技术进行不结球白菜种质 资源分类,遗传图谱构建和基因定位奠 定了技术基础. 关键词不结球白菜,ISSIL单因素试验,梯度PCR OptimizationforISSR--PCRSysteminNon--headingChineseCabbage MaJinju1lMaoWeiweiZhuYuyingChenXuehaoChenJinxiuBoTianyue’ 1HorticulturalResearchInstitute,SA_AS,ShanghaiKeyLabofProtectedHorticulturalTechnology,Shanghai,201106;2SchoolHorticultureandPlant ProtectionCollegeofYangzhouUniversity,Yangzhou,225009 ‘Correspondingauthor,tybo@saa$.sh.cn AbstractInthispaper,thesuitableconcentrationoffourfactors,Taqpolymerase,dNTP,primerandM, wereidentifiedbysinglefactortestsintheISSRamplificationsystemonnon--headingChinesecabbage(Bras—— siccampestrisL.ssp.ChinensisMakino).Andthenorthogonalschemeinfourfactorsatthreelevelswasde— signedbasedontheresultofabovesinglefactorteststooptimizeISSRamplificationsystem.AnideallyISSR reactionsystemwasestablishedthatincluded20wLreactionvolumecontainingToqpolymerase1U,dNTP 0.25mmol/L,primer0.25~mol/L,1xPCRbuffer,M2.5mmol/L,andtemplateDNA30ng.Theoptimalan— nealingtemperatureandcyclingnumbersforISSR—PCRreactionwereconfirmedbygradientPCRandthegradi— enttreatmentofcyclingnumbers.Thisworkmightprovideagroundworkforg ermplasmclassification,genetic mapconstructionandimportantgenelocalizationinnon—headingChinesecabbage. KeywordsNon—headingChinesecabbage(BrassiccampestrisL.ssp.Chine nsisMakino),ISSR,Orthogonalde— sign,GradientPCR ISSR(inter.simplesequencerepeat)分子标记是 Zietkiewicz等于1994年创建的一种PCR技术.其原 理是利用基因组中存在的简单重复序列(simplese. quencerepeat,SSR1本身设计引物,在SSR的3’或5’ 端加锚l~4个随机选择性碱基,然后以此为3’和5’ 引物,对两侧具有反向排列的SSR间的基因组片段 进行扩增,扩增产物用聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电 泳.ISSR引物设计比SSR技术简单,无需知道 任何靶标序列的SSR背景信息,又可揭示比RFLP, RAPD,SSR更多的多态性,现已广泛用于植物的品 种鉴定(邱英雄等,2002a;于恒秀等,2006),遗传作图 (易克等,2003),基因定位(曹双河等,2004),分类,进 化及遗传多样性等方面的研究(李海生,2004;马朝 芝等,2003). 不结球白菜(BrassiccampestrisL.ssp.Chinensis Makino),又名青菜,小白菜,原产中国,属十字花科 基金项目:本研究ca~海市科委重大科技攻关项目(o6Dz191O3)和十一五”国家科技支撑子课J~(2006BAD01A7—2一o6)资助 2.8她 芸薹属芸薹种白菜亚种蔬菜,具有适应性强,生长期 短,品质柔嫩,风味独特和营养丰富等特点,在人民 生活中占有重要的地位,特别是在长江中下游及其 以南地区,不结球白菜是人们不可缺少的大众化蔬 菜.目前,ISSR分子标记技术在不结球白菜上的应用 研究虽有报道,但仍处于起步阶段(王彦华等,20o4). 由于ISSR技术是基于PCR的一种标记,所以其反 应条件易受许多因素的干扰,如模板DNA,Taq DNA聚合酶,M,dNTP以及引物浓度等都能影响 ISSR.PCR扩增的结果.本研究通过单因素试验确定 TatlDNA聚合酶,dNTP,引物和M4种因素在不 结球白菜ISSR-PCR反应体系中的适宜浓度范围,并 利用正交试验设计,从4种因素3个水平对不结球 白菜ISSR反应体系进行优化.结合单因素试验和正 交试验的优点,从而更加准确地找到了最优组合,并 对PCR反应程序中的退火温度及循环次数进行梯 度测验,为今后利用ISSR技术进行不结球白菜种质 资源评价,遗传图谱构建和基因定位奠定基础. 1材料与方法 1.1材料 不结球白菜(BrassiccampestrisL.ssp.Chinensis Makino)品种QC328,由上海市农业科学院园艺研究 所提供. 1.2试剂与仪器 实验所用的PCR试剂(MgCl2,PCRBuffer, dNTP,DNA聚合酶和引物)以及CTAB, Tris.HCI,EDTA,琼脂糖,DNAMarker(DGL2000)均 购自上海生工生物有限公司.选用引物 UBC822,其碱基序列为(TC)sA. 实验所用仪器为:Eppcndorf公司生产的Master- cycler5333和Mastercyclergradient两种型号PCR 仪,BIO.RADLaboratories公司生产的PowerPacBa- 1ISSR扩增反应因素的梯度设置 Table1DesignedgradientsofISSRreactionfactors sicEN61010一l电泳仪,GelDocTMEQ170—8060凝 胶成像仪,Varian公司生产的Uv一100紫外可见光 分光光度计等. 1.3DNA的提取及检测 不结球白菜基因组DNA的提取参照经典的SDS 方法(王关林和方宏筠,1998),并略加改进.DNA质量 的检验采用琼脂糖凝胶电泳方法,将DNA溶于100L 灭菌双蒸水中,加入0.5,lLRnase(1Omg/mL)37? 水浴20--30一min,取2L用0.8%的琼脂糖凝胶(含 0.15~g/mLE电泳检测,电泳缓冲液为l×TAE,保持 90v恒压(4~5V/cm)电泳20--30一min,凝胶成像仪成像 . 1.4IssR扩增反应单因素筛选 ISSR扩增反应采用20的反应体系,其中 25mmol/LMgCI22.0,10xPCRBuffer2.0L, 10mmol/LdNTP0.4L,5U/LTaqDNA聚合酶 0.2,10ng/p~L引物3.0,10ng/i.LL模板DNA 3.0,灭菌双蒸水9.4,加盖一滴矿物油进行扩 增.扩增程序为94?预变性5一min;94?变性1一min, 52?退火1一min,72?延伸1.5一min,35个循环;72? 延伸10一min后4”C保存.扩增产物用1.5%琼脂糖凝 胶上进行电泳分析. 实验中,对ISSR扩增反应某一成分设置梯度进 行筛选时,保持其它成分不变,调整双蒸水用量使总 体积保持不变.具体梯度设置见表1. 1.5正交试验优化IsSR.PCR体系 依据单因素试验结果,结合实验效果和经济角 度综合考虑,采用L9正交表设计,由TatlDNA聚合 酶,dNTP,引物和M4种因素各3个水平组成见 表2. 反应体系的总体积为20,包括1xPCR buffer,模板DNA30ng,其它各成分按照表1加样, 不结球白菜ISSR反应条件的优化… OptimiTationforISSR-PCRSysteminNon-headingChineseCabbage… 表2PCR正交设计表 Table2OrthogonaldesignforPCRreaction 序列号~(u/20wL)dNTP引物(MgCh序列号MjECLI/20wL)dNTP引物(MgC1: SerialNo.0.3/20(retool/L)Primcrs((retool/L)SerialNo.0.3/20wL)(retool/ L)Prinlors(~Lmol/L)(retool/L) 最后用ddH~O补足.每个处理进行3次重复. 反应程序为94?预变性5min,94oC变性1min, 5O?退火1min,72?延伸1.5min,循环35次,72? 延伸10min,扩增产物4?保存. 反应结束后,PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶中电 泳1.5h,EB染色,GelDocTMEQ170—8060凝胶成 像仪进行观察并拍照分析. 1.6退火温度及循环次数的确定 根据正交试验结果,选择最优组合,设定退火温 度范围是(52+10~C),形成12个温度梯度,即42”C, 42.2?,43.3?,45.1?,47.4?,50?,52.8”C,55.5?, 58?,60.1?,61.7”C和62.6”C;确定最佳退火温度 后,设定循环次数梯度为25,3O,35,4O,45,5O.反应 程序的设置,除退火温度及循环次数需随试验设计 梯度变化外,其它设置与PCR正交试验设计的反应 程序相同. 2结果与分析 2.1IssR扩增反应单因素筛选 2.1.1M.gCl2浓度对扩增的影响 MgCl2在反应混合物中的作用非常重要,其浓度 对ISSR的特异性及扩增效率影响很大.M是Taq DNA聚合酶活性所必需的(周延清,2005),M不足 时To#DNA聚合酶作用效率降低,M过量则非特 异扩增增多.另外dNTP也竞争M.如图I所示, 设置8个不同浓度的MgCl2进行扩增,结果显示不 同浓度间扩增结果差异很大:0~1.0mmol/L范围内, To#DNA聚合酶的催化作用太弱,无扩增产物. I.5,3.5mmol/L范围内均有扩增产物,且随MgCl2浓 度的增加产物条带逐渐变强,当低于2.0mmol/L时 有谱带缺失现象,而高于3.0mmol/L时,由于非特异 扩增的发生,谱带出现弥散现象.2.0~3.0mmol/L时 扩增条带整齐,清晰,效果较好. 2000 l60o l000 750 500 250 l0o 图1M[gCh浓度对扩增的影响 Figure1InfluenceofMgChconcentrationonamplification 2.1.2dNTP浓度对扩增的影响 dNTP是ISSR扩增的底物,其浓度直接影响扩 增产物的合成.浓度过低则产率下降,浓度过高则 错误率增加,并竞争M,从而影响DNA聚合 酶的作用效率.从图2可看出:没有dNTP的作用, 扩增不能进行.dNTP浓度介于0.I--0.35mmol/L范 围内均有扩增产物,浓度低于0.15mmol/L或高于 0.3mmol/L时,均出现谱带缺失现象,且浓度愈低或 愈高,缺失现象愈严重.0.15~o.3mmol/L范围内扩增 产物条带较一致,清晰. 2.1.3TaqDNA聚合酶用量对扩增的影响 TaqDNA聚合酶是影响扩增反应的关键因素, M00.10.150.20.250.30.350.4 2O0o 160o l0oO 750 500 25O 10o 图2dNTP浓度对扩增的影响 Figure2InfluenceofdNTPconcentrationonamplification 2-.… 其用量直接影响扩增反应的成败,用量过低扩增反应 不完全;而用量过高时,扩增反应也不能正常进行.由 图3可看出:除TaqDNA聚合酶用量为零的泳道外, 0.5,3.5UTo#DNA聚合酶用量的7个泳道均有扩增 产物,当To#DNA聚合酶用量大于1.5U时,虽有扩 增产物,但条带严重缺失,且背景模糊呈弥散状.Taq DNA聚合酶用量在0.5,1.5U的范围内为宜. 2Ooo 16oO lOoo 750 50o 250 l00 M00.51.01.52.02.53.03.5 图3ZDNA聚合酶用量对扩增的影响 Figure3Influence0fenzymeamountonamplification 2.1.4primer用量对扩增的影响 Sobral和Honeycutt等(1993)发现primer浓度对 DNA片段的带型影响很大.本实验设定8个primer 用量处理,结果表明primer用量如同DNA模板可在 一 定范围内变化.图4中,primer用量为零时无扩增 产物,用量介于0.15--O.75i~mol/L范围内均能扩增 出条带,当用量为0.15panol/L时出现条带缺失现 象,用量大于0.55i~mol/L时也出现条带缺失现象, 且随着浓度的增加,缺带越严重,primer用量在 0.25--0.55jjxnol/L范围内为宜. }船8 l000 750 500 250 l00 M00.150.250350.450.550.650.75 图4引物用量对扩增的影响 Figure4Influenceofprimeramountonamplification 2.2PCR正交试验设计的直观分析 依据单因素优化结果,结合实验效果和经济角度 综合考虑,分别选择各因素的三个适宜浓度,通过正 交设计优化ISSR反应体系中各因素的浓度组合.依 据琼脂糖电泳条带的强弱和杂带的多少做直观分析. 从图5中可以看出,在9个处理组合中,由于Taq DNA聚合酶,dNTP,引物及M浓度4种影响因素 组合的不同,扩增效果存在着明显差异,其中6号处 理效果最好.1号,7号和9号处理组合扩增效果较 差,谱带弱且数量少,导致1号和7号处理组合扩增 效果较差的原因可能是由于dNTP用量过低,且1号 处理组合的Mg浓度过低,9号处理组合扩增效果较 差的原因可能是To#DNA聚合酶用量高而M浓 度过底.与6号处理组合比较,2号,3号,4号,5号和 8号处理组合虽然条带较一致,但2号,3号,5号和8 号处理组合条带较暗,特别是8号处理组合最暗,而4 号处理组合条带出现弥散现象,其原因可能是2号和 3号处理组合To#DNA聚合酶用量较底,5号处理组 合Mg2+浓度过低,8号处理组合的To#DNA聚合酶 用量偏高,4号处理组合的M浓度过高.最佳组合 应选择特异性谱带清晰且谱带较稳定的组合.故本试 验选择第6组合为最佳组合.即20L反应体系中, 含To#DNA聚合酶1U,dNTP0.25mmol/L,引物 0.25i~moUL,M矿2.5mmol/L. 000 600 000 750 500 250 l00 Ml23456789 图5ISSR-PCR正交试验设计电泳结果 注:l~9为处理号,见表2 Figure5ElectrophoresisresultsofISSR-PCRorthogonaldesign Note:1-9:TreatmentNo.,treatmentasshowedintable2 2.3退火温度及循环次数的确定 本实验还对扩增程序的退火温度和总循环数设 置处理进行了比较,以优化扩增程序.退火温度比较 结果表明(图6),在42--60.1?范围内均有扩增产物, 温度较低时非特异扩增较多,产物中DNA条带模糊 呈弥散状,随着温度的提高,引物与DNA模板之间 亲和力变小,扩增效果发生变化,非特异扩增逐渐减 少,强带也变细.温度高于55.5?时主带出现缺失现 象,甚至不能扩增.设置6个不同总循环次数的实验 如图7所示,25个循环的处理没有谱带显现;30个 循环的处理的谱带非常弱,并出现缺失现象,多态性降 B地 扩增条带暗淡,缺失,循环次数过多,扩增产物较多, 且过多的循环次数会增加非特异扩增产物的数量和 复杂性,从而导致条带弥散,带间模糊,影响结果观 察.在本实验中,通过对退火温度和总循环次数设置 剃度处理比较,确定引物UBC822的适宜退火温度 为52.8?,总循环次数为35. 另外,在反应体系中加入甘油,白明胶,BSA或 TritonX一100(Naga0kaandOg~hara,1997),2%-~4%_-- 甲基亚砜(Joshieta1.,2000)或2%甲酰胺(邱英雄等, 2002b)等物质可以提高反应的特异性. 参考文献 CaoS.H.,GuoX…LLiuD.C.,~aangX…QandZhangA.M., 2004,Preliminarygene-mappingofphotopedod-tempera- turesensitivegenicmalesterilityinwheatf乃啪?s— t/rumL.),YichuanXuebao(ActaGeneticaS~ca),3l(3): 293—298(曹双河,郭小丽,刘冬成,张相岐,张爱民,2004, 小麦光温敏核雄性不育基因的初步定位,遗传,3l (3):293-298) JoshiS…PGuptaV.S.,AggarwalR.,RanjekarP…KandBrar D.S.,2000,Geneticdiversityandphylogeneticrelationship asrevealedbyintersimplesequencerepeat(ISSR)polymor- phismintheGenusOryzaL.,Thcor.App1.Genet.,100(8): l3l1.1320 LiH…S2004,ISSRmolecularmarkertechniqueanditsapplica- tionsinplantgeneticdiversity,ShengwuxueTongbao(aul— letinofBiology),39(2):19—21(李海生,2004,ISSR分子标 记技术及其在植物遗传多样性分析中的应用,生物学通 报,39(2):19.21) LinP.,ZhangH.G.,andXieY.H.,2005,Studyonoptimization forISSRreactionsystemofiarixusingorthogonaldesign, ShengwuJishu(Biotechnology),l5(5):34—37(林萍,张含 国,谢运海,2005,正交设计优化落叶松ISSR-PCR反应 体系,生物技术,l5(5):34.37) MaC.Z.,FuT…DTuevessonS.,andGeitssonB.,2003,Genetic diversityofChineseandswedishrapeseed(Brassicaita1)ll~ L.)analys~byinter-simplesequencerepeats(ISSRs), ZhonggunNongyeKexue(ScientiaAgriculturaSinica),36 (11):1403.1408(马朝芝,傅廷栋,TuevessonS.,Geitsson B.,2003,用ISSR标记技术分析中国和瑞典甘蓝型油菜 的遗传多样性,中国农业科学,36(11):1403—1408) NagaokaT.,andOgiharaY.,1997,Applicabilityofinter-simple sequencerepeatpolymorphismsinwheatforuseasDNA markersincomparisontoRFLPandRAPDmarkers,Theor. 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