流式荧光法、多肿瘤标志物蛋白芯片和TK1在头颈部肿瘤的临床研究

流式荧光法、多肿瘤标志物蛋白芯片和TK1在头颈部肿瘤的临床研究 中山大学 硕士学位论文流式荧光法、多肿瘤标志物蛋白芯片和TK1在头颈部肿瘤的临床 研究 姓名:廖鑫 学位级别:硕士 专业:口腔临床医学 指导教师:冉炜 20100608流式荧光法、多肿瘤标志物蛋白芯片和,,,在头颈部肿瘤的临床研究中山大学硕士学位论文 流式荧光法、多肿瘤标志物蛋白芯片和,,, 在头颈部鳞癌的临床研究 专业名称: 口腔临床医学 研究生:廖鑫 导 师:冉炜教授 中文摘要 肿瘤标志物(,,,,, ,,,,,, ,,)是指在恶性肿瘤发生和增殖过程中，由肿瘤细胞的基因表达而合成分泌的或是机体对肿瘤反应而异常产生和,或升高的，反映肿瘤存在和生长的一类物质，包括蛋白质、激素酶(同工酶)、胺类及癌基因产物等。,,存在于病人的血液、体液、细胞或组织中，可用免疫学、生物化学及分子生物学等方法测定，且对肿瘤的辅助诊断、鉴别诊断、观察疗效、监测复发及预后评价具有一定的价值。 流式荧光法，是激光激发荧光的发光类技术之一，又称液态芯片、悬浮阵列，是一个高速度、高通量以及多功能生物技术平台，它把激光技术、编码微球(,,,, ,,,,,)和最新的高速数字信号处理器进行了有机的整合，造就了其卓越的检测特异性和灵敏度，广泛应用于免疫分析和核酸研究，得到医学界和权威机构的高度认可，是临床诊断领域和生命科学研究中的热点。而单一的肿瘤标志物检查难以达到理想的灵敏度和特异性，国内外多项研究表明，运用多种肿瘤标志物联合检测，将有助于提高灵敏度和特异性。肿瘤患者血清胸苷激酶(,浓度检测是近年来研究的热点之一，已在多数恶性肿瘤的诊断、疗效、预后等方面显示其独有的优势，我们试图通过用流式荧光法、胸苷激酶(,(,,,)试剂盒与多肿瘤标志物蛋白芯片(,,,,,)检测系统对头颈部恶性肿瘤患者的血清进行检测，探讨头颈部恶性肿瘤患者中,,,及其他相关肿瘤标志物的表达情况。流式荧光法、多肿瘤标志物蛋白芯片和,,,在头颈部肿瘤的临床研究中山大学硕士学位论文目的: 探讨流式荧光法、多肿瘤标志物蛋白芯片技术和,,,在头颈部恶性肿瘤诊断及治疗中的价值方法: 本课题运用了流式荧光法检测了,例头颈恶性肿瘤患者血清中癌胚抗原(,,,)、细胞角质素片段,,(,,,, ,)和癌抗原,,,(,,,,,)等多肿瘤标志物的浓度水平，就该检测技术进行了方法学评价，并与多肿瘤标志物蛋白芯片(,,,,,)检测系统中检测出的相应的三项肿瘤标志物浓度进行了比较分析。 ,(本课题利用抗,,,单克隆抗体建立的免疫印迹增强化学发光法检测,,例初治鼻咽癌患者治疗前及治疗后的血清中,,,浓度和,,例对照组(正常体检健康人)的血清,,,浓度并采用免疫酶标法检测血清中,,,(，,,水平。结果: ,(,,,，,,,,,，,,,,,检测的方法学评价:最低检测限分别是,(,,,,,,,,,、,(,,,,,,,,,和,(,,,,,,,,，远低于极限(;,,,,,)值;干扰试验结果表明，在一份低值血清样本中加入高浓度的血红蛋白、甘油三酯、胆红素三种干扰物质，并不会影响结果的判断;批内变异系数和批间异系数均小于,,,;在测定范围内，流式荧光法测定,,,、,,,, ,和,,,,,三种肿瘤标志物的线性良好;流式荧光法与多肿瘤标志物蛋白芯片(,,,,,)检测系统中检测的三种指标相关性良好。 ,(鼻咽癌组治疗前,,,,浓度,(,,(,(,,(,(,,),,,,,,明显高于健康体检者的,,,,浓度,(,,(,(,,,,(,,),,,,,,;鼻咽癌治疗后组,,,，浓度,(,,(,(,,,,(,,),,,,,,比鼻咽癌组治疗前,,,,浓度,(,,(,(,,,,(,,),, ,,,,明显下降;鼻咽癌患者中血清,,，阳性率,,(,,与,,,(，,,检出阳性率,,(,,相近，鼻咽癌患者治疗后,,，阳性率(,,(,,)，,,,显低于,,,—，,,阳性率(,,(,,)。结论: ,(流式荧光法具有线性范围广、灵敏度高、重复性好、节省时间和样品等优点，具有临床应用潜力。流式荧光法、多肿瘤标志物蛋白芯片和,,,在头颈部肿瘤的临床研究中山大学硕士学位论文 ,(血清,,,检测在鼻咽癌患者的临床诊断中具有一定临床意义;血清,,,检测与,,,,，,,检测在鼻咽癌的诊断上未见明显差异，但在鼻咽癌患者疗效评估方面血清,,,可能比,,,(,,,有更高的应用价值。关键词:胸苷激酶(,;恶性肿瘤;流式荧光法;肿瘤标志物 ,,,流式荧光法、多肿瘤标志物蛋白芯片和,,,在头颈部肿瘤的临床研究中山大学硕士学位论文 ,,, ,,,,,;,, ,,,,, ,, ,,,, ,,,,,,,;,,;, ,,,,,，,,,,,—,,,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,, ,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,(, ,, ,,,,, ,, ,;,, ,,, ,,;, ,,,,,:,,,,,;,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,:,,,,,,, ,,,,,,,,,,:,,,,(,,, ,,, ,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,, ,,;,,,,, ,, ,,, ;,,,?, ,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,,，,,, ,, ,,,,, ,,,,,,,,,，,,,,, ,, ,,,,,,,,, ,,;,,,,,,, ,, ,;;,,,,,, ,, ,,, ,,,, ,, ,,,,,,, ,, ,,,, ;,,;,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,(,,,,, ,,,,,, ,, , ,,,,;,,,, ,, ,,,,,?, ,,,,,,,;, ,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,;, ,,;,,,, ,,,,,,,、,,,,,,,,,(,,,,,,,)、,,,,,,,,,、,,;,,,,,,,,，,, ,,(,,,,, ,,,,,, ,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,?, ,,,,,、,,,, ,,,,,、,,, ;,,, ,,, ,,,,,,,,,，,,,, ,,,,,，,, ,,, ,, ,,,,;,,, ,, ,,,,, ,, ,,,;,,,,,,,,、,,,,,,,,,, ,,,,,,,;,,,, ,,,,,,,(,,,,, ,,,,,, ,, ,,,,, ,,,, ,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,,,,,，,, ,,,, ,,,,, ,,?, ,,,,, ,, ;,,,,,,, ,,,,;,、,,;,,,,,;,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,; 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,,,, ,,,,,,,;,,;, ,,;,,,？,,;,,,,, ,,,,,, 流式荧光法、多肿瘤标志物蛋白芯片和,,,在头颈部肿瘤的临床研究中山大学硕士学位论文 中英文缩写词表缩词 英文全称 中文全称,,,,, ,,,,,—,,,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,, 多肿瘤标志物蛋白芯片,, , ,,,,,,,,, ,,,,,,一, 胸苷激酶一,,,,, ,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,一, 血清胸苷激酶一,,,, ;,,;,,,—,,,,,,,,; ,,,,,,, 癌胚抗原,, , ,—, ;,,,,,,?,,,,, ,,,,,,, , ,—, 糖链抗原,,(,,, , ,, ;,,,,,,,,,,, ,,,,,,, , ,, 糖链抗原,,,,, , ,,, ;,,,,,,,,,,, ,,,,,,, , ,,, 糖链抗原,,,,, ,,,,, ,,,,,, 肿瘤标志物,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,, 胸(腺嘧啶脱氧核)苷,,,, ,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,, 脱氧胸苷一磷酸,,, ,,,,,,, ,,,;,,,; ,,,,,,, 神经元特异性烯醇酶,,,,, ;,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, 糖链抗原,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,, 甲胎蛋白,,, ,,,,,,,, ,,,;,,,; ,,,,,,, 前列腺特异性抗原,,, ,,,,, ;,,,,,,,; ,,,,,,,,,,,,, 人绒毛膜促性腺激素,,, ,,,,, ,,,,,, ,,,,,,, 人生长激素,,,, ,,,,,,,,,,,,, ;,,, ,,;,,,, ,,,,,,, 增殖细胞核抗原,,,,, ,？,,,,,, ;,,, ;,,;,,,,, ,,,,,,, 鳞状细胞癌抗原,,, ,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,, 组织多肽抗原,,,,,, ,,, ;,,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,, , ,?, 细胞角质素片断抗原,,(,,,,, ,,,,, ;,,, ,,,, ;,,;,, 小细胞肺癌,,, ,,,,,,,,,,,?, ,,,,,,,, 非何杰金(氏)淋巴瘤,,, ;,,,,,; ,,,,,,,,; ,,,,,,,, 慢性淋巴性白血病,,,, ;,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,, 顺二氯化二氨亚铂,一,, ,,,,,,,,—,,,,,,,,,,,,,,, ,一氟脲嘧啶 ,,流式荧光法、多肿瘤标志物蛋白芯片和,,,在头颈部肿瘤的临床研究中山大学硕士学位论文 原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确的方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位敝储芋名:励、 日物,,年占月,日 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定，即:学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆、院系室被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印 或其他方法保存学位论文。 吖，?学位论文作者签名:,匀唆、日期勿, ,年,月吝,, 弱搿莎日 日期:三勿,晖七月拶日流式荧光法、多肿瘤标志物蛋白芯片和,,,在头颈部肿瘤的临床研究中山大学硕士学位论文 (?上(—,一 刖 吾 癌症已成为人类死亡的第一位或第二位原因，全球每年约有,,,万人死于癌症【,】。根据世界卫生组织(,,,)估计，现在癌症患者约,,,,万，预计,,,,年新发病例将达到,,,,万左右，癌症患者将达到,,,,万。虽然与一些发达国家如美国、日本等相比，我国恶性肿瘤死亡率相对较低，但全国范围内恶性肿瘤在各类死因中已经排在第二位，就城市而言，则排在首位。在我国卫生部制定的“中国癌症预防与控制规划纲要(,,,,(,,,,)一中曾写到:,,世纪,,年代以来，我国癌症发病率及死亡率一直上升，到,,年代这短短的,,年间(癌症死亡率上升了,,(,,，年龄调整死亡率上升了,,(,,,。显而易见，癌症已成为严重威胁人类健康的高发病率和高死亡率的一类疾病。尽管近几十年来的发展，有了许多治疗手段，如手术、化疗、放疗和生物治疗等，并取得了很大的进步，但远远达不到完美的程度，常常存在复发和转移的可能。因此，“三早??(即早发现、早诊断和早治疗)将是给予患者康复最好的消息。世界卫生组织(,,,)也指出:若能早期发现、早期诊断并及时治疗，,,,以上的肿瘤可以治愈。目前，临床上进行肿瘤诊断的方法主要有:物理学、组织细胞学及生物化学三种方法。一般认为，利用现代生物物理影像技术例如:超声显像(,,,,,,,,,,,,,,, ,超)、计算机,线断层摄影(;,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,)、磁共振成像(,,,,,,,; ,,,,,,,;, ,,,,,,, ,,，)、血管造影术(,,,,,,,,,,,)和正电子发射计算机断层扫描与体层显像技术(,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,,，,,,(,,)等，只有在肿瘤的实体直径达到,,,(, ;,(榛子大小，细胞数,,,，重约,蓟时才能将其发现，但常常却回答不了以下的问题:肿瘤是否还处于“早期”;是否已经有远处转移:手术切除范围是否彻底;是否肿瘤已经复发;影像学上处于“稳定”能否排除肿瘤仍然在继续增长。而组织细胞学检查也常常因为其有创性及假阴性等限制，使得肿块从无症状而渐渐长到被患者所觉察的大小时，部分癌症患者已经处于中晚期，多数癌症患者已经丧失了最好的治疗时期。显而易见，仅利用上述目前已常规运用于临床的检查方法是不够的。而运用肿瘤标志物来进行早期检测，可比常规辅助检查手段(如,,、,尉、,,,—,,)等，更早地发现肿瘤的发生或是复发，为患者的早期治疗流式荧光法、多肿瘤标志物蛋白芯片和,,,在头颈部肿瘤的临床研究中山大学硕士学位论文赢得宝贵的治疗时间。 肿瘤标志物(,,,,, ,,,,,, ,,)是指恶性肿瘤在发生和增殖过程中，由肿瘤细胞的相关基因表达而合成分泌的，或是机体对肿瘤反应而产生和,或升高的，反映了肿瘤存在和生长的一类物质，包括蛋白质、酶、胺类及癌基因产物等。,,存在于患者的体液、血液或细胞中，可用免疫学、生物化学及分子生物学等方法对其进行测定，且对肿瘤的辅助诊断、疗效观察、鉴别诊断、监测复发及评估预后具有一定的价值【,,。上世纪,,年代，“癌胚抗原(,,,)”的发现，使人们,度相信，一种敏感度高并特异性强的抗原被发现了。随着一系列单克隆抗体，如,,,,,，,,,,,等的面世，它们的敏感性和特异性虽然远远没有达到我们的期望值，而且在临床上的应用也存在争议，玉,,，但是通过对, ,,及其它肿瘤抗原的研究却为我们提供了许多有价值的、存在于血液循环中的肿瘤标志物，并揭示了其不同的信息特性。因为这类肿瘤标志物能随血液循环全身，对其进行检测具有无须确定病变部位和方便快捷的特点，尤其适用于区域人群肿瘤的普查和高危人群肿瘤的定期排除。 当正常细胞生长调控失去控制后，导致了细胞无休止的增殖，称为癌细胞。现代的研究表明，癌细胞异常的增殖是由于正常细胞的某个或多个突变的与增殖相关的基因引起的，所以正常细胞中增殖相关基因的突变最终导致相关的癌蛋白的过度表达、阻抑蛋白的缺失或突变蛋白产物表达，并伴随一系列与细胞生长相关的酶和蛋白质调节失控。正是这些信息为我们分析各种异常生长状况提供了帮助，并刮颐悄芄唤徊搅私馕裁凑,赴フ，さ骺兀堑贾轮琢鱿赴裥栽鲋车脑颉荆担薄?肿瘤细胞增殖标志物的理论基础是根据恶性肿瘤细胞的增殖不是按照正常细胞的,倍体分裂方式进行，而形成一种无休止恶性分裂的肿瘤细胞这一特征上建立起来的。早在上世纪,,年代，通过体外培养细胞，观察到胸苷(,,,,,,,,,,,,)参与到,,,合成。放射性同位素标记的胸苷或胸苷的类似物可以检测到肿瘤细胞中,,,合成速度，发现了细胞,,,的复制仅仅限定在细胞周期的某一特定时期，我们称之为,期(,,,,,,,,; ,,,,,)，见图,。 ,流式荧光法、多肿瘤标志物蛋白芯片和,,,在头颈部肿瘤的临床研究中山大学硕士学位论文 图,(胸苷激酶，(,,，)与,,,合成,细胞增殖的关系的模式图:,,,在细胞质中催化胸苷(,,,)为,,磷酸胸苷酸(,,,,)。 这种同位素标记的方式来检测肿瘤细胞中,,,合成并计算细胞周期中,期细胞数增殖比例的方法，对患者肿瘤细胞增殖度的检测和评估患者预后十分有意义【,。„。。 也是在这个过程中，人们认识了胸苷激酶(,，,。胸苷激酶(,,)是一种嘧啶补救途径的激酶，在,,,为供体和镁离子(,,，，)参与的条件下，催化脱氧胸菅(,,,,,,,,,，简,,,)成为一腺胸苷酸(,,,)。这种磷酸化作用是胸腺嘧啶核苷进入,,,代谢的唯一途径。因此，,,也被称为抢救酶。它以,种同工酶德形式存在:细胞质胸普激酶(,,,)和线粒体胸昔激酶(,,,)【,?,,。编码,,,的基因位于,,号染色体？,,(,,的位点上，编码,,,的基因位于,,号染色体上。增殖细胞 ，,中升高的,,其含量中有,,,是,,,，所以通常我们所讲的,,即是,,, ,,。,,,是一种细胞周期依赖的肿瘤标志物，在细胞分裂,,期含量低，到,期后逐渐升高，至,期和,,期交界时达到最高。,,,与细胞,,,合成速度、细胞周期中,期细胞计数成正相关,,,,,,。,,,在非增殖细胞和健康人血清中，含量极微或无法检测到，但在恶性肿瘤患者中伴随着肿瘤细胞的急剧增殖而迅速升高，因而认为,,,可以作为一种好的血清细胞增殖性标记物来检测增殖细胞的增殖活性，适用于恶性肿瘤的细胞增殖速度的检测。 由于单一项肿瘤标志物的检测一直存在着特异性不强和阳性率较低等诸多不足，尤其在早期肿瘤的检测上阳性率不高，但随着肿瘤标志物的血清学标志物 ,流式荧光法、多肿瘤标志物蛋白芯片和,,,在头颈部肿瘤的临床研究中山大学硕士学位论文检测技术的发展，近年来国内外学者多采用动态观察和多种肿瘤标志物联合检测，来达到提高肿瘤早期诊断率的目的【,,?瑚。 随着单克隆抗体技术的不断成熟，肿瘤标志物免疫学测定方法也得到了长足的进步，具有了敏感、特异、快速、稳定性好等优点。目前常用的血清肿瘤标志物检测方法包括放射免疫测定(对,)、酶联免疫测定(,, ，,,)和化学发光免疫测定(,,，,)等，,，,的灵敏度和准确性都好，但存在技术条件高、放射性同位素容易过期而且对接触者有伤害等问题: ,,，,,的优点是操作简便、试剂稳定、自动化强，但操作过程中影响因素多，敏感度、准确度和重复性在不同厂家不同批次的试剂盒间存在很大的差异;,,，,则需要特殊检测设备，试剂多为国外专利产品，需进口，费用昂贵。而且这些方法存在的共同局限性，那就是不仅是每次只能检测一种肿瘤标志物，而且不能够对肿瘤标志物进行定量检测，因此对多项指标进行联合检测时，不仅增加了被检测者的经济负担，也使检测者耗费了更多时间、精力和大量的试剂。而且在临床实际运用中，某一检测指标单纯的阴性或阳性并不能确切说明问题，需超过某一固定阈值才有诊断价值。流式荧光法 (,,,, ,,,,,,,;,,;, ,,;,,,？,,)，又称为液相芯片(,,？,,, ;,,,)，是新一代生物芯片技术，其是在流式细胞技术、酶联免疫吸附试验(,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,，,,，,,)技术和传统芯片技术基础上进行开发，研制出来的新一代生物芯片技术和研究平台。利用这个研究平台，我们可以对同一个微量样本中的多个不同分子同时进行快速的定性和定量。流式荧光法不仅使检测物质从细胞水平深入到分子水平，其检测范围也得到了前所未有的扩展,,,,。在保持高通量检测的同时，将反应体系由液态一固相交替的反应改变为更接近生物系统内部环境的完全液态反应体系，确保了蛋白质相互作用是建立在更加真实和正确的高级结构之上的。所以说流式荧光法是一种非常灵活的多功能技术平台，可进行蛋白、核酸等生物大分子检测、受体和配体识别分析以及酶学分析等研究，被喻为是后基因组时代的芯片技术。 综上所述，我们感兴趣的是运用血清检测，就能够反应这类异常蛋白升降水平，从而能够通过非侵入性方法进行取样，以帮助评估肿瘤患者早期发生和肿瘤治疗后的效果评估，进而对疾病复发情况和预后进行判断。为此，人们一直在探索寻找与肿瘤细胞增殖紧密相关的，可同时用于血清学和免疫学检测的肿瘤标志 ,流式荧光法、多肿瘤标志物蛋白芯片和,,,在头颈部肿瘤的临床研究中山大学硕士学位论文物。而理想的肿瘤标志物应具备以下一些特征:?灵敏度高，特异性好，能对肿瘤进行准确的定位;?与疾病严重.