能量抑制剂CCCP对环丙沙星在阴沟肠杆菌内聚积的影响

能量抑制剂CCCP对环丙沙星在阴沟肠杆菌内聚积的影响 能量抑制剂CCCP对环丙沙星在阴沟肠杆 菌内聚积的影响 天津医药2006年9月第34卷第9期69 能量抑制剂CCCP对环丙沙星在阴沟肠杆菌内聚积的影响 葛庚芝于树云毕玲司进 摘要目的:研究临床分离阴沟肠杆菌对环丙沙星的聚积以及能量抑制剂间苯腙氯 羰氰(CCCP)对细菌摄取环丙 沙星的影响.探讨主动泵出机制在细菌对喹诺酮耐药性产生中的作用.:应用 荧光光度法测定阴沟肠杆菌细胞 内环丙沙星的浓度,并对应用CCCP前后细菌细胞内环丙沙星聚积稳态浓度进行 比较.结果:受试菌对环丙沙星的摄 取均在5min内达到稳态浓度,耐药菌株的稳态浓度低于敏感菌株,应用CCCP后 耐药菌细胞内的环丙沙星聚积浓度 明显增加.结论:细菌细胞内能量依赖的环丙沙星聚积浓度的减少,在阴沟肠杆菌 对环丙沙星产生的耐药性中具有 一 定作用. 关键词肠杆菌.阴沟环丙沙星腙类微生物敏感性试验 EffectsofEnergyInhibitorCarbonylCyanaidem—Ch10r0phenyIhydraz0ne(CCCP)on AccumulationofCiprofloxacininEnterobaterCIoacaeClinicallsolates GEGengzhi,YUShuyun,BILing,SIJin DepartmentofPulmonary,SecondHospito]ofTianjinMedico]University,Tianjin300211, China AbstractObjective:ToinvestigatetheeffectsofclinicalisolatesofEnterobacterCloacaeona ccumulationofciprofloxacin andtheeffectsofcarbonylcyanidem— chlorophenylhydrazone(CCCP)onuptakeofciprofloxacininE.cloacaeisolates.Toexplore theeffectsofinitiativepumpmechanismondrugresistanceofquinolones.Methods:Theaccumulationofciprofloxacinwas determinedbyusingamodificationoffluorometricassay.andtheintracellularconcentrationofciprofloxacinwascompared beforeandaftertheuseofCCCP.Results;TheaccumulationofciprofloxacinforalldetectedisolatesofE.cloacaereachedtoa stableconcentrationwithin5min.andtheintracellularstableconcentrationofciprofloxacinwaslowerinquinolone—resistant isolatesthanthatinquinolone— susceptibleisolates.Theaccumulationofciprofloxacininresistantisolatesincreasedafter incubatedwithCCCP.Conclusion:Energy— dependentactiveeffluxmayplayacertainroleinciprofloxacinresistanceinE. cloacaebydecreasingtheaccumulationofciprofloxacin. Keywordsenterobactercloacaeciprofloxacinhydrazonesmicrobialsensitivitytests 阴沟肠杆菌是医院内下呼吸道感染的重要条 件致病菌.近年来,临床分离耐喹诺酮阴沟肠杆菌 不断增多.已有研究显示,耐喹诺酮阴沟肠杆菌染 色体DNA基因突变导致药物作用靶位改变是其耐 药的主要原因lll.本研究应用荧光光度法对耐喹诺 酮阴沟肠杆菌细胞内环丙沙星聚集动力学进行测 定,并对能量抑制剂间苯腙氯羰氰(CCCP)处理前 后耐喹诺酮菌株细胞内环丙沙星聚集浓度进行比 较,CCCP对临床分离的耐喹诺酮阴沟肠杆菌 细胞内环丙沙星(CIP)聚积浓度的影响,探讨阴沟 肠杆菌对氟喹诺酮类药物耐药的泵出机制. 1材料与方法 1.1材料 1.1.1细菌受试的阴沟肠杆菌均为临床分离株.包括5株 耐药株:CIP药物最低抑菌浓度(MIC)I>4mg/L]和1株敏感 菌,其中3株为多重耐药株.质控株为大肠埃希氏菌 ATCC25922,阴沟肠杆菌ATCC13047 1.1.2药品与试剂药敏试验用抗生素标准品及CCCP均 为Sigma产品.甘氨酸,磷酸盐等均为分析纯. 1.1.3仪器紫外分光光度仪(PERKINELMERJUNICR, spectr叩hotometric),El本岛津RF510Lc荧光分光光度仪, 低温高速离心机,恒温摇床. 1_2方法 1_2.1药物最低抑菌浓度(MIC)测定以微量肉汤稀释法测 定临床分离阴沟肠杆菌对12种抗生素的最低抑菌浓度,结 果根据临床及实验室标准协会(CLSI)r标准进行判定.从中 选出敏感菌株,耐药菌株作为受试菌. 1.2.2环丙沙星药物浓度一荧光强度标准曲线测定按文 献[3]方法,以荧光分光光度仪对制备的环丙沙星一甘氨酸HCL 溶液进行全波长扫描.找出环丙沙星激发波和发射波分别为 280nm和441nm.然后在0.01,10mg/L范围内分别对几个不 同的环丙沙星浓度测定相应的荧光强度,绘制出标准曲线. 1.2I3环丙沙星在阴沟肠杆菌细胞内的聚积测定按文献 l41方法加以改进.取MH琼脂培养18h的阴沟肠杆菌单个 菌落接种于4mLLB肉汤培养基中37C摇床培养8h后,转 移至200mLLB肉汤培养基,37qC摇床中培养至指数生长期 (A~o=0.6-0.8).4qC离心(8000r/min,5min),50mmol/LPBS 作者单位:300211天津医科大学第二医院呼吸科 62D 缓冲液(pH7.0)冲洗一次,重悬于相同的缓冲液中,使终浓度 达A6~o=20.将菌悬液分至两个锥形瓶中.一锥形瓶中加入环 丙沙星至终浓度10mg/L.分别在加药后0.5,l,3,5,l0,l5, 20min各取样0.5mL,立即用0?PBS(pH7.0)稀释至l mL,冰浴.4?离心(12000r/min,5min),lmL冰PBS再洗一 次.同样条件下离心.沉渣中加入0.1mol/L甘氨酸HCI(pH 3.0)1.0mL处理,25?过夜.离心(12000r/min,5min),取上 清液测定荧光强度.通过所绘制的标准曲线得出细菌细胞内 环丙沙星药物浓度,以细菌对环丙沙星摄取量ng]mg细胞干 质量表示. 1.2.4CCCP对环丙沙星在阴沟肠杆菌内聚积的影响在 l_2_3步骤的另一瓶菌悬液中先加入CCCP至终浓度0.25 mmol/L,10min后再加入环丙沙星,使其终浓度为10mg/L.此 后5,l0,l5,20min各取样0.5mL,立即用0?PBS(pH7.0) 稀释至lmL,冰浴.以后操作均同1.2.3步骤处理. 以上试验均设立复管,每个样本测定3次,标准差<l0% 为合格,取其平均值. 1.3统计学方法计量资料数据以?s表示,细菌细胞内 环丙沙星浓度的比较用studentt检验 2结果 2.1环丙沙星曲线环丙沙星荧光强度标准曲线 显示呈线性关系,I~=202.09X一0.1046.R21. 2.2抗生素MIC结果1株敏感菌E25(CIPMIC 0.1mg/L),5株耐药菌(CIPMICI>4mg/L),其中 E24,E37,E39为多重耐药菌. 2.3环丙沙星在阴沟肠杆菌细胞内聚积的测定结 果受试细菌对环丙沙星的摄取均在5min内达稳 态浓度,见图1.5株耐药菌的细胞内环丙沙星稳态 浓度均低于敏感菌(E25)和标准菌(13047),(t分别 为9.10和9.51,P<0.05),差别有统计学意义;敏感 菌与标准菌株细胞内的环丙沙星浓度无明显差别 (t=0.01,P>0.05),见图1. 2.4CCCP对环丙沙星在阴沟肠杆菌细胞内聚积的 影响加入CCCP后与未加CCCP比较.耐药菌细胞 内环丙沙星聚积稳态浓度明显增~13(t=-7.499,P<0.05). 增加范围在12%,46%,其中3株多重耐药菌对环 丙沙星聚积增加28%,46%,另外2株耐药菌则增 加12%,17%;敏感菌及标准菌加入CCCP后与未加 CCCP比较,细菌细胞内环丙沙星浓度变化(2%, 5%)差异无统计学意义(t=2.500,P>0.05),见表1 3讨论 已有研究表明,阴沟肠杆菌gyrA基因Ser83基 因突变是细菌对喹诺酮耐药性产生的主要原[]t61. TianjinMedJ,Sep2006,Vol34No9 +13047 — -一E25 +E1 +E13 +E24 +E37 +E39 <0.O5 本研究对阴沟肠杆菌摄取环丙沙星的聚积动力学 测定结果显示.耐氟喹诺酮阴沟肠杆菌细胞内环丙 沙星聚积稳态浓度明显低于敏感菌.由此可以推 断,细菌对喹诺酮耐药性的产生.除染色体基因突 变这一主要原因外.细菌细胞内环丙沙星聚集浓度 减少在其耐药性产生中具有一定作用.尤其在多重 耐药菌对氟喹诺酮产生耐药性中具有重要作用. 细菌对药物的泵出导致细菌细胞内药物浓度 减低在细菌对喹诺酮类药物耐药机制中具有重要 作用.该泵出机制是依赖能量(质子梯度或ATP)通 过细胞膜上的通道蛋白的过程.CCCP是一种能量 抑制剂,通过抑制膜的电化学质子梯度,使通道蛋 白失活,从而抑制细菌对药物的泵出. CCCP对细菌摄取环丙沙星的影响结果显示. 加入CCCP后阴沟肠杆菌对环丙沙星聚积稳态浓度 均有增加,但耐药菌与敏感菌增加程度不同.推测 临床分离菌中可能普遍存在对环丙沙星的主动泵 出,但其作用程度有不同,而多重耐药菌的泵出更 为明显.分析原因可能与多重耐药基因norA在不 同菌株中多表达程度不同有关.此外,虽然在加入 CCCP后耐药菌细胞内环丙沙星聚积稳态浓度均明 显增加,但均未能达到敏感菌的水平.推测药物在 细胞内的聚积减少还可能与细胞膜改变有关. 研究结果表明.能量依赖的药物泵出机制导致 细菌细胞内环丙沙星聚积减少在临床分离阴沟肠 杆菌对氟喹诺酮产生耐药性中具有一定作用.这种 泵出机制也是细菌对多种结构不相关抗生素产生 一_冉瞧}霉恳警一蛏_宙畦酶匠粗 天津医药2006年9月第34卷第9期 交叉耐药性的重要原因.同时发现,具有gyrA基因 突变的菌株,经过CCCP处理后显示对环丙沙星聚 积明显增加,提示氟喹诺酮的耐药常源于药物作用 靶位改变与泵出机制的联合.本研究仅对环丙沙 星这一种亲水性氟喹诺酮药物进行了初步研究,阴 沟肠杆菌对疏水性氟喹诺酮药物的摄取动力学以 及是否存在泵出机制也需进一步研究. 参考文献 1DeguchiT,YasudaM,NakanoM,eta1.Detectionofmutationsinthe gyrAandtheparCgenesinquinolone—resistantclinicalisolatesof Enterobactercloacae.JAntimicrobChemother,l997,40:543—549 2PerformanceStandardsforAntimicrobialSusceptibilityTesting.Clini- calandLaboratoryStandardsInstitude(CLSI),25(1):M100一S15 62l 3ChapmanJS.GeorgopapadakouNH.Fluorometricassayforfleroxacin uptakebybacterialcells.AntimicrobAgentsChemother,1989,33: 27—29 4MortimerPGS.PiddockLJV.Acomparisonofmethodusedformeasur. ingtheaccumulationofquinolonesforEnterobacteriaceae,Pseu- domonasaernginosaandStaphylococcusaureus.JAntimierob Chemother,1991,28:639—653 5HiraiK,AoyamaH,SuzueS,eta1.Isolationandcharacterizationofnor- floxacin—resistantmutantsofEscherichiacoliK—l2.AntimicrobA. gentsChemother,1986,30:248—253 6于树云,单志英,祁伟,等.临床分离阴沟肠杆菌gyrA基因突变的 研究.天津医科大学,2004,10:240—242 7KernWV,OethingerM,Jellen—RitterAS,eta1.Non—targetgenemuta— tionsinthedevelopmentoffluomquinoloneresistanceinEscherichia coli.AntimicrobAgentsChemother,2000,44:814—820 (200602.08收稿2006.07.06修回) 短篇与病例报告 左膝关节色素沉积绒毛结节性滑膜炎合并股骨髁上骨坏死一例 刘英春张立杰 关键词膝关节滑膜炎,色素绒毛结节性股骨骨坏死病例报告【文献类型】 1病例报告 患者女,62岁.因左膝关节发现肿物2年,扭伤后疼痛 1d,于2005年6月1日入院患者两年前因轻微碰撞致左膝 疼痛,即发现左膝有一鸡蛋大小肿物,压痛,无麻木感,经休 息后疼痛消失,可从事基本劳动,后该肿物渐进性增大,无夜 间痛.ld前因膝部扭伤致疼痛而来就诊.入院查体:全身浅 表淋巴结无肿大.左膝关节轻度屈曲位,肿胀,以后内侧为 着,皮肤不红,浅表静脉稍扩张,皮温不高,压痛,无放射痛, 肿物质硬韧,界清,无活动,听诊无射水音.x线片示左股骨 髁上局限性骨破坏,无骨膜反应,内有高密度影,见图l.CT 扫描示左股骨髁上局限性骨破坏,左膝后内侧有多发囊肿, 囊壁厚.彩超检查示内有血流回声.MRI扫描示左侧股骨远 端可见不规则高,等,低混杂信号影,边界欠清,正常骨髓信 号消失.左膝周围软组织内可见多个结节状混杂信号影,左 膝内侧可见囊状长T,长T2信号影,向胭窝内延伸,内可见 线样分隔,左膝髌上囊可见大量长T,,长T:信号影,见图2. 血白细胞(WBC)6.5x109/L,红细胞(RBC)3.59x102/L,血红蛋 白容积(HCT)30.7%,平均红细胞体积(MCV)86fL,血红蛋白 (Hb)104g/L,血小板计数(Pit)240x109/L,谷丙转氨酶(ALT) 4.1U/L,血浆白蛋白(A)35.2g/L,血浆球蛋白(G)42.1L, G0.84,C反应蛋白(CRP)阳性,血沉(ESR)98mrrl/h,碱性磷 酸酶(AKP)74.6U/L.软组织肿物穿刺为黄褐色略黏稠的液 体,病检为大量白细胞.骨破坏灶穿刺取病检为炎性渗出和 坏死组织,见图3.手术在腰麻下进行,先取膝后侧切口于缝 匠肌腱,半腱肌腱和股二头肌腱之间完整剥离后侧肿物约6 cm×8cm×12cm,表面蔓状爬行血管蒂达后关节囊.并向膝 内前沿肌腱爬行生长至小腿中段.肿物包膜完整,容易与周 围组织剥离,内为黄褐色浑浊液体,断面为黄褐灰色混杂.取 膝内侧切口于股骨髁上钻孔开槽刮出大量坏死骨质.与健康 骨质界较清.内以同种异体骨粒填充.术后患肢长腿石膏托 外固定.软组织病理可见吞噬含铁血红素多核细胞和泡沫细 胞的灶性区及滑膜细胞组成的绒毛结构,病理诊断:左膝部 软组织色素沉积绒毛结节性滑膜炎累及周围骨组织,见图4. 2讨论 色素性绒毛结节性滑囊炎是滑膜的良性增生性病变,可 以表现为关节的局灶性或弥漫性病变.典型病理特点是滑膜 内膜细胞增生,多核巨细胞和载有含铁血黄素的巨噬细胞, 泡沫细胞,纤维母细胞滑膜下浸润.膝关节因关节囊宽大.骨 侵蚀很少见或轻微llI,该病例膝关节滑膜组织侵犯至大腿下 段远达小腿中下段,而且侵及股骨远端形成大的灶性骨坏 死,极少见.临床常易误诊为软组织肿瘤或炎症侵及骨质.该 病最后诊断有赖于术中取组织进行病理检查.血友病患者关 节内反复出血,病理检查也会有含铁血红素沉着.甚至有绒 毛形成,但一般不出现泡沫细胞和多核巨细胞,可资鉴别. (图1~4见封三) 参考文献 1陆裕朴,胥少汀,葛宝丰.实用骨科学.第2版.北京:人民军医出版 社.2002.1351—1355 作者单位:301800 中医院骨科(张立杰) (2005-09-21收稿2006-05-16修回) 天津宝坻医院骨三科(刘英春);天津宝坻