共振光散射法研究rhBMP---2DSSCS纳米微球缓释作用（可编辑）

共振光散射法研究rhBMP---2DSSCS纳米微球缓释作用（可编辑） 共振光散射法研究rhBMP---2DSSCS纳米微球缓释作用 学校代号: 分类号: : 密级: 学号: 广东工业大学硕士学位论文 工学硕士 共振光散射法研究.//纳米微 球缓释作用 蔡诤 易国越教授 指导教师姓名、职称: 专业或领域名称: 应且化堂 轻工化工堂院 学生所属学院: 论文答辩日期: 笙鱼且垒目/ / : :. , ., ,,摘要 摘要 近年来微球控释技术的发展和人工可降解材料及其复合材料的不断涌现,为 活性细胞因子的可控缓释和人工骨成骨提供了前所未有的机遇和条件。针对人工 骨成骨诱导活性缓释微球的研究,国内外很多学者利用高分子合成与结构控制技 取得了良好的成骨效应。共振光散射及其相关技术是 术制备了缓释微球, 二十世纪年代发展起来的一种新兴的分析技术,在研究生物大分子识别、组 装和聚集时出现灵敏而丰富的信号,已成为研究生物大分子的一种十分有用的手 段。 本论文主要以共振光散射光谱,并结合荧光光谱以及紫外吸收光谱 来研究重组人骨形态发生蛋白..,葡聚糖硫酸钠,壳聚糖之 间的的相互作用。因此,本论文主要对重组人骨形态发生蛋白./葡聚糖硫酸钠/ 壳聚糖纳米微球的缓释作用进行研究。主要研究内容如下。 研究了壳聚糖/葡聚糖硫酸钠聚电解质复合过程。结果表明在/质量 比率低时两种高分子的相容性很好,呈现均匀稳定的复合胶体溶液。强度在 外界条件刺激时会发生急剧的变化,其中,当溶液值逐渐增大时,体系的 强度逐渐减弱。离子的加入则不仅会增强体系的强度而且还诱导 /复合物稀溶液出现胶束.聚集转变行为。而且计算得到了复合物在不同温 度下的临界胶束浓度以及胶束形成过程的的热力学参数,热力学性质研究表明复 合物形成胶束主要是焓熵双驱动的结果。 研究了壳聚糖与重组人骨形态发生蛋白.的结合作用。结果表明与 .分子链间的结合能力较弱。荧光光谱结果表明对.的猝灭主 要是分子之间结合形成化合物所引起的静态猝灭。表观结合常数和相应的结 合位 点数表明与.之间的相互作用比较弱。热力学参数表明与. 之间的作用力主要为范德华力和氢键。 研究了葡聚糖硫酸钠与重组人骨形态发生蛋白.的结合作用。表明 .有很强的相互作用,在酸性条件下结合能力更强。荧光光谱结果表 与 明低浓度的对.产生动态猝灭现象;高浓度的与.产 生荧光增强现象。表观结合常数和结合位点数得出与.的相互作用广东工业 大学硕士学位论文 强。吉布斯自由能,焓变以及熵变一系列热力学参数确定了与一在 溶液中主要是疏水作用。 关键词:共振光散射法;骨缺损;重组人骨形态发生蛋白.;葡聚糖硫酸钠;壳 聚 糖;相互作用 , , ? .? . ? . ’., ,. ,,., ../ . , . .,. /. ./. . .广东工业大学硕士学位论文 . , . , . .. ., 一 . ,, .. , . 一 .:;; : ;; 目录 目录 摘要?...?..?.??.??.??.??.?.?..?.??.?..?..?.?.??.? 第一章绪论?. .骨形态发生蛋白..骨形态发生蛋白的结构及功能..骨形态发生蛋白的载体 材料??.. .壳聚糖/硫酸葡聚糖胶体聚电解质..壳聚糖/硫酸葡聚糖聚电解质的影响因 素. ..壳聚糖/葡聚糖硫酸纳米胶体复合物的应用??. .共振光散射法?一 ..共振光散射法的基本原理一 ..生物大分子共振光散射强度的影响因素 ..共振光散射的分析应用? .本论文研究的意义及内容..研究意义? ..研究内容? 第二章壳聚糖/硫酸葡聚糖聚电解质复合过程的研究?. .主要试剂和仪器 ..主要试剂? ..实验仪器? 实验方法 . .共振散射实验原理.结果与讨论..共振光散射光谱? ..质量比率对复合作用的影响.. 对复合过程的影响..金属离子对复合过程的影响..复合溶液胶束性质研究? ..复合物溶液热力学性质? 广东工业大学硕士学位论文 .小结第三章壳聚糖与重组人骨形态发生蛋白一的相互作用研究?.. .主要试剂和仪器 ..主要试剂? ..实验仪器? .实验方法 .结果与讨论..共振光散射光谱? .. 的浓度对/.复合溶液共振光散射光谱的影响? .. 值对/.复合溶液的共振光散射光谱的影响.荧光光谱 . 对.荧光猝灭的分子作用机制? . 和.相互作用的结合常数和位点数??. .复合溶液热力学性质? .小结第四章硫酸葡聚糖与重组人骨形态发生蛋白一的相互作用研究??.. .主要试剂和仪器 ..主要试剂? ..实验仪器? 实验方法 . .结果与讨论..共振光散射光谱? .. 的浓度对/.复合溶液共振光散射光谱的影响 .. 值对/一复合溶液的共振光散射光谱的影响?. .荧光光谱 . 对.荧光猝灭的分子作用机制.. . 和.相互作用的结合常数和位点数?.. .复合溶液热力学性质? .小结??. 结论??.. 参考文献??. 攻读硕士期间发表的论文?. 目录 独创性声明?. 学位论文版权使用授权声明. 致谢. 广东工业大学硕士学位论文??... .....?.??.?.?..??.. ..??.. . /.......................................... .. /.................. .. / .. . .................................................... .. ..................................... ...??.??.?.?..??.?.?.??.?.?.?.?.?.??.?.?.?...?. .. ................... . .............................................. .. ................................................................. ................ .. ............................................................. ............................】; /.?..??..?.?..??.?.?.?.?..?.?.?.. .??.?..??..?..?.?.?.??.??.?...?.. .. ...... . .?..?.?.??.??.?..??.??.?.??.?.?.?.?.?.??.??..??.. . .?..?.??.?.?.?.?.?.?..?.??..??. ..?.?..??..?..?.??.?.?.??.??.?..... / ?.?..?.?.??.?.?.??...?.... ... ...?.?.?.?.?.?.?... ..??. .??...?.. .??.. .??. ...... .?.. .?.. .. /一 ..?一 .. . .?.??..?.?.?.?.?.?..?..?.??.?...??.. ..??一 :;. ............................................................. :;..??.?...?.?.?.?...??.?.?..?.?.。.?...?..?.?.?.?.?..?.?.??.?... .. .. ................................................................. ..................................... .. ..?.??.?.?..?.?.?.?。??.?.?.。.?。?.。??。 ..?.?.?.?.?.??.?.?...?.?.??.?...?.??.??...??.??... .. ........................................................?.... ...................... .. /一??.. .... .. ................................................................. .................... 一..?. .. 广东工业大学硕士学位论文 .??...??../. 第一章绪论 第一章绪论 骨肿瘤、严重的骨创伤都可能引起骨缺损,骨缺损一直是备受世界广泛关注 的难题。随着骨缺损修复研究的不断深入,各种骨修复材料层出不穷。骨修复材 料主要有自体骨、异体骨和人工骨。自体骨移植有良好的骨诱导性,安全性高, 因此被认为是骨缺损修复的标准【。】,但自体骨来源少,而且并发症多;,异体 骨、异种骨植入后容易吸收,并且容易感染,存在免疫排斥反应,并有潜在传染 疾病的危险;人工骨因具备取材广泛,容易加工、生物相容性好,价格低廉,能 消毒以及利于临床操作,成为目前骨修复材料研究的热点【】 虽然人工骨已经应用于临床,但植入的人工骨的成骨效应欠佳【。为此,国 内外研究者对解决骨化活性的方法进行了研究【剖。目前,采用的最广泛的 方法 是用细胞生长因子促进人工骨的成骨化,此方法简便,临床易于推广,成为国内 外研究的热点。 骨折愈合是一个复杂的过程,是由多种细胞生长因子 分子生物学研究表明, 参与并进行调控的。骨形态发生蛋 .,. ,与组织愈合 和碱性成纤维细胞生长因子 密切相关,尤其是在骨折愈合方面。除了对成软骨细胞,成骨细胞的增殖 和分化有明显的刺激作用外,它还是最有效的血管生成因子,因此在骨折愈合过 程中发挥着重要的作用。.是诱导骨折修复的生长因子,通过调控细 胞核内相关基因的表达,诱导细胞分化、促进软骨和骨的形成。由于.应 用广泛,目前对骨诱导细胞生长因子的研究以.为主。 .骨形态发生蛋白? 近年来,骨形态发生蛋白引起了广泛的关注,在组织工程领域, 由于其强大的促进骨和软骨形成‘和能力‘引。在骨形成过程中,骨形态发生蛋白 的信号触发干细胞分化,传达到损伤的骨组织部位形成细胞【。年, 等在脱钙的骨基质中发现,它是一种活性成分并且能够诱导新骨的形成,因此将 其命名为骨形态发生蛋 ,。广东工业大学硕士学位论文 ..骨形态发生蛋白的结构及功能 骨形态发生蛋白是由个单体通过二硫化物键构成的一种二聚体分子【?。骨 形态发生蛋白是一类酸性糖蛋白,是一种具有多功能的蛋白类生长因子,研究表 明,在动物体的生长发育过程中,动物体内所有内脏及体表器官均有及其 相应的受体。因此,的功能已经不止单纯的骨诱导作用,还在、肌键 修复、神经发育、胚胎发育、进化学以及造血基因学等方面起着重要作用。 年,等首次分离得到骨形态发生蛋白,并将其命名为、 .、.和.。,在骨形态发生蛋白家族中,除.属于前胶原 蛋白酶外均隶属于转化生长因子.超家族成员。其中.、、、、 均可异位诱导形成软骨或骨组织,但.在成骨方面应用最广【。 骨形态发生蛋白在年被美国食品和药物管理局批准 使用在脊柱外科手术中。两个的产品在美国批准,用于腰椎融合手术配合。 近年来,.在椎间盘再生、长骨骨折愈合、牙周修复的研究中表现出了成功 的再生潜能【 。作为概念组织工程的角度来看,不同的材料已被提出并研究作 为.的载体【。用于组织工程应用的材料应该完美的模仿组织的自然环境, 在这方面,天然聚合物可以发挥信号指导细胞在其发展的不同阶段,加速愈合, 从而在临床应用上呈现优良的性能【。 ..骨形态发生蛋白的载体材料 单纯的.植入体内后易被蛋白酶分解、易被组织液稀释、易游离,这些 会导致.局部有效浓度不足,体内半衰期短,发挥效用的时间有限,全身和 局部应用很快被稀释代谢,以至于影响其骨诱导活性的充分发挥,达不到所期望 。目前单纯的.无法直接用 的生物效应,尤其不能很好地修复大段骨缺损【 于骨修复治疗。为了解决这个问题,研究人员发现必需有合适的载体与. 结合,使.在人体内可以进行缓释,并且最大程度地发挥.的成骨作 用,达到骨诱导和骨传导的双重效果,因此国内外学者进行了大量生长因子缓释 。 载体的研究【? 理想的载体材料应具备以下特点【 】:能够负载,并控制其缓慢第一章绪论 放;良好的生物相容性;无细胞毒性、无抗原性或低抗原性;可生物降解, 且降解速度与新骨形成速度保持一致,对新骨形成无不良影响;对于承重部位 的骨修复,要求载体具有一定机械强度:具有三维结构和高孔隙率,利于生长 因子的载入、细胞的粘附、增殖等;制备简单,材料对生物活性影响小; 易灭菌处理和贮藏。 微球载体可作为控释给药体系,具有保护药物、延长药用时间、降低给药量 等优点,在药物释放领域受到极大关注,因此用微球负载缓释得到了广泛 的研究。目前制备的微球载体所使用的材料有聚乳酸、聚乙醇酸、葡聚糖、 壳聚糖等。 壳聚糖是自然界中仅次于纤维素的第二大天然生物有机资源,是由 大部分.氨基葡萄糖和少量的.乙酰..氨基葡萄糖组成,以.,糖苷键连接 起来的直链多糖,。壳聚糖是甲壳素在碱性条件下部分或全部脱除乙酰基后得到 的脱乙酰产物,是带有葡萄糖胺或.乙酰葡萄糖胺的阳离子多糖。由于壳聚糖 具有优良的生物降解性、生物组织相容性以及抗菌作用等性能【。近年来,壳 聚糖在生物医学、薄膜制作、药物载体、水合凝胶以及食品包装等领域均有广泛 的应用【,。等【制备了壳聚糖/微球,用来负载.,诱导新 骨生成,成功修复了的兔尺骨缺损。 壳聚糖及其衍生物作为药物载体,在运送药物上能发挥以下几方面的特殊作 用:稳定和保护药物成分;延缓或控制药物释放;帮助药物送达目的器 官。因此,壳聚糖作为药物载体成为研究的热点。壳聚糖作为药物载体之所以具 有以上特殊作用得益于其特殊的物理和化学性质首先,壳聚糖的糖残基上含有丰 富的氨基和羟基,对极性分子药物有一定的结合能力,其脱乙酰度越高对极性药 物分子的结合力越大。其次,壳聚糖特殊的溶解性可实现延缓或控制药物释放。 因此,壳聚糖作为药物有利于靶向给药,提高药物的效力,降低用药量。 早期的壳聚糖的纳米微球主要通过共价键交联制备。其中壳聚糖纳米微球早 期主要使用戊二醛来交联【】,但是由于戊二醛的细胞毒性限制了它在药物载体 方面的应用。后来,人们使用了一些生物相容性的交联剂来制备壳聚糖的纳米微 球。天然多羧基化合物主要包括唬拍酸,酒石酸,苹果酸,柠檬酸等天然的 二羧基或者三羧基化合物。以水溶性的碳化二亚胺作为缩合试剂,利用天然多羧广东工业大学硕士学位论文 基化合物的羧基基团与壳聚糖的氨基基团发生缩合反应来进行壳聚糖纳米微球 的交联。通过这种方法制备的纳米微球可以在酸性,中性和弱碱性溶液中都能够 存在。通过静电作用交联的纳米微球与共价键交联相比,具有温和的反应条件和 简单的操作步骤。对于带电荷的天然高分子,带有相反电荷的低分子量的天然高 应用最广泛的带负电荷的分子就可以作为交联试剂来交联纳米微球。目前, 交联 剂是无毒并且带有多个负电荷的三聚磷酸钠。等是第一个使用 来交联壳聚糖纳米微球的研究者【。自此之后,.及壳聚糖的 衍生物纳米微球体系被广泛应用于载药体系。 壳聚糖纳米微球还可以通过带有相反电荷的高分子来进行制备。等使 用壳聚糖和聚天冬氨酸为原料可以分别制备带有正电荷或者带有负电荷的纳米 。等利用静电凝聚方法制备 微球,并将疏水的.氟尿嚓负载于纳米微球中【 了聚吖.谷氨酸.壳聚糖纳米微球,这种微球的体外单层.细胞仿肠道细胞 间运输实验表明表面包覆有壳聚糖的微球能够减少通透阻力从而使得纳米微球 在细胞间传输【引。该纳米微球还被应用于透皮基因传递,与壳聚糖.体系相 比,壳聚糖.聚..谷氨酸.纳米微球体系增强了老鼠皮肤穿透深度使得基因 得以表达。等在中性溶液中制备了季胺化的壳聚糖.海藻酸纳米微球用于负 载口服蛋白质,这种纳米微球表面带有正电荷并且粒径约为。 等发展了一种硫酸葡聚糖.壳聚糖的纳米微球和海藻酸.壳聚糖的 纳米微球,这些纳米微球用于负载胰岛素,并研究了它们的负载效率和体外 释放 情况。等利用简单的团聚过程,发展了壳聚糖.硫酸葡聚糖纳米微球。探 讨了两种高分子不同的质量比例对微球粒径,表面电荷,载药效率以及药物释放 因为硫酸葡聚糖价格便宜,易于得到,而且它的硫酸基团与壳的影响【到。 聚糖 的氨基基团有很强的静电作用,形成胶体聚电解质,所以目前硫酸葡聚糖是使用 的最广泛的阴离子聚合物。 .壳聚糖/硫酸葡聚糖胶体聚电解质 聚电解质是一类带有阴离子或阳离子,在溶液中能电离成带电荷的大分子聚 离子和带相反电荷小分子反离子的高分子化合物【.聚电解质复合物是 通过带有相反电荷的聚电解质混合而得,也就是说,聚阳离子与聚阴离子通过各 第一章绪论 种键结合形成聚电解质复合物。聚电解质复合物兼有高分子长链和小分子电解质 电离的双重结构特征,因此,拥有普通高分子所不具备的功能特性,有着极为广 泛和重要的应用,如污水、污泥处理剂【 ,气体、液体分离膜,贵金属提萃 取和水中重金属的脱除膜,温敏、湿敏、气敏、敏、电敏以及生物敏感传感 原件材料【】,以及采油、造纸、涂料和食品加工中的工业助剂等刚。此外,聚 电解质在生物医用领域中的药物载体、药物控释膜、组织细胞培养、净化质 粒 。 以及酶固定化中起着独特的作用【 壳聚糖是一种聚阳离子,硫酸葡聚糖是带有硫酸葡萄糖基的 阴离子多糖。硫酸葡聚糖和壳聚糖均有良好的生物相容性和生物可降解性的聚合 ;因此,它们都是可以用来制备多功能纳米粒子。 物 图.壳聚糖和硫酸葡聚糖的化学结构式。 .% .伊 ..壳聚糖/硫酸葡聚糖聚电解质的影响因素 ?聚电解质的胶体性质 聚电解质复合物可以通过静电作用由至少两个带相反电荷的聚电 解质在水溶液中获得。在低离子强度,过程是熵驱动的,因为释放的少量的抗衡 离子附着在聚电解质上。但其他类型的相互作用有利于离子配对过程,如氢键相 互作用和范德华力‘。【和 已经对合成聚合物来形 成进行了广泛的研究。具有明显不同的摩尔质量的聚电解质在非化学计量 比下混合得到水溶性的分子复合物。具有可比性的大/或强离子性基团,导致相 分离的聚合物络合。为了获得一种胶态分散体,需要高稀释和非化学计量配比条广东工业大学硕士学位论文 件‘.。其他因素也影响的形成过程如反应物加入的顺序【】,加入量比率 【,两组分各自的摩尔质量【,它们的相对绝对浓度】,的量和 介质的值【,,可以改变聚合物的电离度。 年, 等首次详细的报道了亚微米颗粒通过将硫酸葡聚糖溶液 , , .’加入到壳聚糖 .’;%乙酸溶液中‘。 加入过量的,颗粒尺寸随着壳聚糖/硫酸葡聚糖的重量比而减 在这些实验中, 少。在年,这些结果关系的/.电荷比有相互关系,当电荷比降低/ ..即增在反应混合物中的量,颗粒的大小和多分散性指数也随之下 降,表明过量的提高胶体的稳定性【。 ?聚电解质的构象 聚电解质粒子的形成是在溶液中进行的。因此,调查溶液中的聚合物的构象 相关参数以便于了解和控制颗粒的形成过程。等已经详细的研究对壳 聚糖溶液的理化性质的影响,并建立了一般的行为规律‘。。聚合物链的刚度 是 通过测量的壳聚糖的持续长度,根据和在.到.间变化。相 比之下,.. /的为.【】。聚电解质溶液中的构象取决于静电 斥力的强度,】研究硫酸葡聚糖时也表明这个观点。他发现,当氯化钠浓 度从增至时,硫酸葡聚糖的特性粘度从 ?‘下降到 ?~。 ?内部参数对聚电解质复合物形成的影响 聚电解质的内部影响因素为壳聚糖的和聚合度以及壳聚糖和硫酸葡 聚糖的。在加入反应物初期,形成的颗粒可以通过丁达尔现象来检测。两 种聚电解质不同的.表明了这是一个动力学控制的形成过程。继续加入反应 物,溶液变得浑浊,表明形成了一个新的颗粒。聚电解质复合物颗粒的大小随 着 壳聚糖的以及的增大而增大‘】。同时,聚电解质复合物颗粒的形成过程 取决于过量的聚合物的性质。所以,当聚阴离子聚合物的摩尔质量增大,得到较 大的颗粒,但低摩尔质量的总是得到聚合材料;反之,高摩尔质量的和低 摩尔质量的,当加入过量的时,则得到稳定的胶体。总之,当所有的实验 条件有利于离子中和过程,导致中性离子对高密度的片段,形成高度中性复合物, 因此,得到的是小颗粒。但是,当中和过程达到最大时,由于缺乏静电斥力作用 而导致颗粒絮凝,此时,电荷比接近于或实验条件使形成的复合物高度中性。 第一章绪论 ?外部参数和反应物的加入方式对胶体的聚电解质复合物形成的影响 硫酸葡聚糖是一种强酸性的盐,总是会进行离解,然而介质的值由壳聚 糖的伯胺质子化静电相互作用决定,因此,值的上限为壳聚糖的。混合 物的离子强度影响胶体的最终粒径,离子强度的增加引起的平均直径的减小,这 可能与链的柔顺性增大有关。最后,对加入的反应物的方式和加入的顺序进行了 研究。反应物逐滴加到起始溶液时,反应物的加入顺序是至关重要的,一种聚合 物加入到另一种过量的聚合物中,以避免聚集体的形成。换句话说,当电荷比达 到时,系统形成不可逆的聚集【。相反的,反应物一次滴加到初始溶液中,反 应物的加入顺序对聚电解质的形成并无太大影响,表明粒子形成过程是动力学控 制的。因此,一个非常简单的生产方法是依靠快速滴加以达到预期的电荷 比】。 另一个方面是胶体聚电解质颗粒的组成对胶体稳定性和载体性能的影响。 等研究了胶体的稳定性,在生理食盐浓度下,不同程度的乙酰化和摩尔质 。壳聚 得到阳离子微粒【 量的壳聚糖与两种不同摩尔质量的硫酸葡聚糖混合, 糖的值小于%的颗粒立即聚集在 溶液中。这可能涉及壳聚糖溶 液的行为,因为它已经表明,%,壳聚糖表现为具有高电荷密度强聚电 解质【。因此,胶体稳定性主要依靠静电斥力。当等于或高于%,胶体 的凝聚动力学的取决于乙酰化程度和两种聚合物的。最佳的胶体稳定 性的通过%,?~和 ?‘形成,类似于加入 过量的高的聚合物为主体,低的聚合物为客体的主.客模式,主体 的与客体的比值为。壳聚糖链通过静电排斥作用稳定胶体,而且 电荷密度显著降低,发生空间位阻斥力。值得注意的是,当%,得到的是 很差的稳定体系,可能是因为如上所述的壳聚糖溶液中的行为,疏水相互作用占 主导地位,导致的聚集颗粒。 ..壳聚糖/葡聚糖硫酸纳米胶体复合物的应用 ?壳聚糖/硫酸葡聚糖复合胶体药物传递系统 等人提出这个概念,他们将阿霉素放入到纳米粒子中作为活性分子的 控制释放体系,并且维持了很长一段时间的释放【。阿霉素需要一个伯胺,经 质子化能产生静电斥力防止药物有效的微胶囊化。为了提高封装效率,他们的想法是使用一个带负电荷的聚合物中和药物的正电荷,即硫酸葡聚糖。这种方法的 设想是通过使用一个因子与没有任何的聚阴离子相比提高药物包封率。但事 实 上,通过对壳聚糖与离子凝胶化得到的颗粒的方法在全世界进行广泛应用, 而则作为次要成分,约%的壳聚糖/。壳聚糖与离子凝胶化得 到壳聚糖微粒也被用来封装氨基糖苷类抗生素如链霉素,庆大霉素等。在壳聚糖 交联是通过加入实现,和控制颗粒的形成和稳定性的主要参数是壳聚糖与 的比。过量导致胶体颗粒的不稳定和聚集。 另一种方法制备壳聚糖/聚电解质复合纳米粒子通过使用过量聚合物和 使用硫酸锌作为链的离子交联剂。这一次,得到了带负电荷的粒子,水溶性 差的两性霉素的封装方法可以使用含有药物的溶液和溶液混合。 纯聚电解质复合物的第一个例子作为药物传递系统是由‰】报道,并研究 了各种工艺参数对微粒的论述。如的摩尔质量和浓度,药物浓度和介质的 值。 ?壳聚糖/硫酸葡聚糖胶体复合物作为肽和蛋白质的载体 肽或蛋白质是脆弱的天然分子,在其制备过程中都可被损坏,存储过程中也 能快速的被酶降解。因此,研究它们的载体材料且能对它们进行控制释放并有效 负载是一个挑战。胶体的聚电解质复合物的形成是非常温和的;它发生在水溶液 中,且不需要任何表面活性剂。因此,提出用和作为聚离子【 。通 过在溶液中加入过量的溶液含有或不肽而形成微粒。等优化罗 丹明的封装,使其作为作为一种新型水溶性药物,并且将牛血清白蛋白 为模型蛋白酬。锄四将胰岛素封装入由和形成的胶体中, 并对和形成的胶体进行一系列的研究以优化胰岛素的包封率和释 放过程。 生长因子,参与多种组织发展的蛋白质。这些生长因子应靶向身体中的特定 位置,以再生所需器官。生长因子是不稳定的,有一个很短的半衰期,所以输送 系统需要保持生长因子的活性。等研究了胶体封装的两个不同生长因 子的活性、包封率以及缓释过程。胶体通过和过量的制各的【羽。 ?成像应用 因为核磁共振成像是通过使用壳第一章绪论 黄敏等制备出负载钆的胶体, 聚糖与钆二胺五乙酸共价接枝得到的【】。将滴加到.衍 生物的水溶液中,制备出聚电解质复合物,颗粒直径约,带负电荷。凝聚 过程也被用来使离子包含在颗粒中,最后,将这两种方法组合进行了测试。 形成胶体聚电解质后,胶体溶液通过硫酸锌硬化。化学结合的颗粒并未未释 放钆,而第二种方法的总负载率达到%。通过胶体得到?增强的 信号的峰值强度和趋势与加都三胺乙五酸一种常用造影剂相似。 .共振光散射法 当一束光穿过介质,可以在入射光方向以外的各个方向上所观察到光的现象 称为光散射现象。它的实质是介质与电磁辐射的相互作用。它源于光电磁波的电 场振动而导致分子中电子产生受迫振动所形成的偶极振子。根据电磁理论,振动 着的偶极子是一个二次波源,它向各个方向发射的电磁波就是散射波,介质中粒 子大小不同,产生不同种类的散射。当介质中粒子直径大于入射波长‰时, 产生反射或折射;当介质中粒子与入射波长‰相近时,便产生了丁达尔 散射;当介质中粒子直径远小于入射波长.九时,便产生以瑞利 散射为主的分子散射。 当产生光散射时,它的强度主要取决于溶液中物质的粒径和浓度。 若散射峰处于吸收峰附近或在吸收带中,则产生更强的散射,使散射 强度急剧的增大。这主要是散射与吸收的共振作用,因而这是一个吸收一再 散射 ,使散射光的强度瞬间提高,此时共振光散射的强度与入射光波长的 的过程 次方成反比的关系。共振瑞利散射或者共振光散射就是吸收一再散射的过程 畔】。 ..共振光散射法的基本原理 共振光散射理论主要从共振瑞利散射的增强角度出发,有时也称共振光散射 为共振瑞利散射。 ?, 七。警仁器掣卜 是光散射强度,是入射光强度,和九分别是入射光和散射光的波长, 是散射物质的浓度,是阿伏加德罗常数,大括号里分别表示的折射率的虚 广东工业大学硕士学位论文 部和实部指数。 式.表明,在非吸收介质,光散射是主要依赖于实部的折射率; 而当激发波长附近的吸收带,实部和虚部的部分指数均对光散射做出贡献。 由式.可知, 当散射物质具有荧光时,此时散射物质的共振光散射可视为共振荧光。 共振光散射强度与分子摩尔吸收系数具有密切的关系,摩尔吸收系数越 高,共振光散射强度越强。 当其它条件一定时,共振光散射强度与散射粒子的浓度成正比,这是 共振光散射法测定物质浓度的定量基础。 共振光射技术是在普通荧光分光光度计上进行测量的光散分析技术。在荧光 分光光度计上选择合适的激发和发射通带,采用相等的激发波长同时扫射激发和 发射单色器所获得的同步光谱即?九 即为散射粒子的共振光散射光谱。 当粒子大小相当于或大于入射波长时,应当注意电子在粒子振荡的不同部位 随着不同阶段的变化。这导致散射光的干涉,由于电子在粒子的不同部位和散射 然后偏离振荡电偶极子【。然而,根据公式.的 光的强度大小和角分布, 理论计算可以在某些方面扩展到散射,金颗粒的光散射由的入射 光激发脚】。此外,通过使用荧光分光光度计测量的,需要使激发狭缝宽度和 发射狭缝宽度大? 。实践证明,?九并不总是零,当采用大狭缝宽度? 可得到最大信号强度【】。没有光学校正,杂散光明显存在于分光光度 计的光学系统中。因此,用普通荧光分光光度计获得的信号,涉及的不仅仅 是单纯的瑞利光散射,但也包括光散射,廷德尔,和布里渊光散射。尽管如 此,还是一个很有价值的技术。 ..生物大分子共振光散射强度的影响因素 ?散射分子浓度的影响 共振光散射可以看作是特定条件下的瑞利散射,瑞利散射是共振光散射的基 础和前提,因此,影响瑞利散射的主要因素同样会对共振光散射产生影响。浓度 增大是产生强的共振瑞利散射的一个重要条件。散射分子浓度会影响的强 弱和所测定的线性范围。在一定范围内,随着散射分子浓度的增大,测定的灵敏度 第一章绪论 随之增大,线性范围也随之变宽。浓度增大可以使大分子表面形成聚集体,导致 其体积增大,以及形成离子缔合物,从而增强。 ?环境因素的影响 溶液中的值对于极为重要,它能影响到体系中分子的反应能力和存 在状态,也影响到分子的电荷状态、电荷分布异构现象、聚集、解聚以及异构现 象等,从而影响体系的强度。生物大分子的散射光强度一般在一个最优的 范围内体系的共振光散射信号达到最强,在最优范围外有不同的变化。这 主要是因为生物大分子之间的结合主要是静电引力和疏水作用力。例如,对于蛋 白质与生色团的相互作用,当值低于相应蛋白质的等电点时,蛋白质带正电 荷,故易与染料阴离子以静电作用结合而形成复合物;随着值的升高至等电 点时,两者的结合达到平衡,此时,染料在蛋白质上结合能力最强。当高于 蛋白质等电点时,染料的质子解离而带有更多的负电荷,蛋白质上的正电荷数目 却不断减小,故不利于两者的相互作用,所以蛋白质与生色团的相互作用,基本 上是在的条件下进行的。 此外,体系的离子强度和溶剂极性均对体系的散射强度有较大的影响【引。 一般体系中加入微量的电解质溶液,以维持蛋白质、核酸的稳定结构。强电解质 的存在一般不会影响大分子自身的散射光谱,但在较高浓度下,由于强电解质的存 在屏蔽了生物大分子所需电荷,从而影响了结合物的形成而使共振光散射信号降 低。 同样,由于溶剂的极性对分子的反应性能、存在状态和溶解度有明显的影响, 从而影响到共振光散射的强度【】。因此,在某些水相体系中,乙醇和丙酮的加 入能导致共振光散射强度降低,有的体系加入非极性溶剂后就几乎消失。除了 上述影响因素之外,温度也是一个重要的影响因素【】。随着温度的升高,分子 的布朗运动也会加强,从而导致更多的动态光散射;同时温度升高也将导致体系 生成的缔合物不稳定以及某些生物大分子的变性,从而导致发生变化。 ?分子结构的影响 不仅反应物的体积和共轭体系会对的强度有影响,反应物的分子形状、 电荷分布、分子结构也会对的强度有影响。静电力是主要的生物大分子与染 料结合的结合力。不同的蛋白质有不同的由于有不同数量的一和基本氨广东工业大学硕士学位论文 基酸而有不同的强度。那些更为基本的氨基酸残基,如鱼精蛋白与染料的结 合能力强,并具有很高的灵敏度。相反,胃蛋白酶由于带负电,所以 它几乎不与染料反应【卜。对罗丹明/核酸检测,强度也随着聚合颗粒的大 小而改变。核酸分子量大、易形成大的聚集体,有较强的。酚酞、亮绿、结 晶紫等三苯甲烷染料的十分微弱,而与它们结构相似的荧光素、罗丹明等 染料则有强烈的。这是因为前者的结构平面性和刚性较差,而后者具有良好 的平面刚性结构【。 ?共存物质的影响 通过对三种表面活性剂和.进行干扰实验‘,我们发现,那些染料离 子电荷相反的生物大分子与染料结合紧密,并对反应试剂空白试验系统有相 同的 结果。由于表面活性剂具有增溶、增敏的作用,在测定体系中往往会加入一定量 的表面活性剂,但不同的表面活性剂对强度的影响也不刚,。在染料与生物 由于具有带电荷的表面活性剂,导致两者不能生成缔合物,大分子的结合中, 并 且与其中一方竞争电荷而阻碍染料与核酸、蛋白质的作用,将导致共振光散射减 弱。这再次证明了静电效应的重要性分析。此外,许多其他共存物质如金属离子 的影响,无机盐、有机物进行测试,表明这些物质干扰小。由于强度是非常 敏感的,在测定之前应稀释样品,将能产生共存干扰的物质降至最小化,甚至可 以忽略。 ?分子吸收在介质中的影响 不同于传统的光散射技术可以避免生色团的吸收波长区域,测量集中在这部 分的电磁频谱。由于分子吸收物种吸收的激发和光散射,可用的信号对应的 吸收峰降低,诱导真正的光谱失真【】。因此,帕斯特纳克和同事提出, 光谱需要对事件的吸收和散射光以提取有用的信息,从光谱实验的发色团修正 】。校正的基本原理是将与测量相同的样品,通过引入修正因子补偿吸收损 耗的光散射信号增强。 ..共振光散射的分析应用 年,等首次用普通的荧光分光光度计以光散射法研究卟啉类 微的衍生物在核酸分子上的堆积【。等人进一步发现,当卟啉第一章绪论 组装在蛋白质或核酸上,共振光散射信号会增强并且可以用于生物大分子的定量 分析‘】。基于上述研究,并不是任何一种聚集状态可以产生共振光散射增强。 只有那些能产生聚集状态,并有大量聚集的颗粒和摩尔吸收系数可以产生共振光 散射增强。这就是为什么二聚体和三聚体的卟啉不能产生散射增强【】。近 年来, 共振光散射光谱在研究分子识别、组装和聚集时有明显的信号增强,能够检测分 子间相互作用的强度以及分子间相互作用随温度、值的变化情况,已经广泛 应用于生物大分子的生化分析【】、纳米粒子和超分子【】等研究领域。 ?.生色团分子的自组装 卟啉自组装突出了超分子化学自从发现单体卟啉可以自发地自组装成二聚 体或更高的聚集体,通过?.冗堆积和.【相互吸引作用,来模拟复杂的物理化学过 程提供的可能性【】,并在纳米电子学中自组装超分子结构的模块构建的合理设 计的应用,合成材料可以尽可能的表现出特定的属性和功能‘。 水溶性卟啉的带电基团,可以通过简单的排斥作用筛选掉带有相同电荷的侧 基以促进聚集体的形成,通过光谱技术,例如也研究不同介质中的卟啉的聚集 聚集状态【矧。带羧基的卟啉的二聚体或更高的聚集体,如四苯基卟啉的阴离子 磺酸卟啉和四苯基羧酸卟啉在水中一般在带和带附近表 现信号增强,聚集体的虚部指数的贡献是非常重要的【,。信号大量增 加是因为在卟啉发色团之间的一个“好”的电子耦合,而相应的信号却没有在单体 中发现】。同样,在有机溶剂中,纳米自组装叶绿素复合物也可以通过研究 瞰 ?带电聚合物模板上生色团的组装 基于卟啉和带相反电荷的聚合物基质的静电作用可以通过测量。聚合物 核酸,蛋白质等】。叶绿素的颜料表面活性剂聚集体能 基质包括表面活性剂, 被指定诱导在胶束溶液中,其中带正电的表面活性剂与单体卟啉的酮 酸酯相互作用形成定域激子态一。 与游离碱性卟啉不同,女,,金属卟啉和原卟啉,在离子或非 离子表面活性剂的诱导下显示了不同的聚集特征。金属卟啉包括和 。,无论是单体或聚集体,都可以与胶束结合,形成的非胶束金属卟啉/ 表面活性剂聚集体,金属卟啉/的结合比和结合常数可以通过紫外,荧光和广东工业大学硕士学位论文 共振光散射进行测量【。铜卟啉,当和基质相互作用时,由于其不 同的外围取代基,结合方式可以是插入,表面结合或形成扩充的电子耦合的阵列, 扩充的电子耦合的阵列特征的光谱与吸收带相对应【矧。同样,阳离子卟啉在 聚.或聚.上组装的结合和自组织诱导的信号表明表明,相邻的卟 啉部分和卟啉的更强疏水部分之间的激子耦合表现出更广泛的自组织‘。 .本论文研究的意义及内容 ..研究意义 近年来,对负载活性生长因子缓释载体的研究正受到越来越广泛的重视和关 注【】,从传统载体到各种载药微球载体,目标是延长生长因子的缓释时间, 精 确控制释放浓度,拓展其适用范围。但是,对于怎样利用缓释微球来使细胞因子 按照临床需要的量和时间进行释放,以最大限度的促进人工骨成骨诱导活性,是 需要解决的主要问题。 这种方式也为外源性生 活性生长因子的缓释可以通过纳米控释系统来达到, 长的发展创立了新的研究方向。目前是组织工程领域内的研究热点【加,特别是 近年来控制释放技术的发展以及对人工可降解材料、复合材料制备的纳米微球的 研究,促进了组织工程化人工骨成骨诱导活性研究的质的飞跃。成骨诱导活性由 生长因子所决定,为了达到更好的成骨诱导活性,必须了解附有生长因子的微球 促进骨化活性的影响因素:微球,微球的结构类型,生长因子和生长因子微球和 生长因子的释放之间的互动机制,过程控制。 为了研究生长因子和载体之间相互作用,本论文拟采用共振光散射光谱和荧 光光谱法来表征。目前,研究生物大分子间相互作用的方法主要有滴定法包括 电位、电导和比浊滴定法】、电泳法【及动态光散射法【】。但这些方 法灵敏度均不高。基于荧光光谱仪的共振散射方法,通过其特有的吸收一 再散射机制,使共振光散射强度急剧增大‘,从而显著提高测试的灵敏度,并 且该方法能够进行实时监测,通过散射光强度变化来研究体系结构的动态变 化过 程,它可以提供生长因子和载体之间的相互作用机理,提供控制生长因子缓释过 程的信息。 第一章绪论 ..研究内容 ?研究壳聚糖/硫酸葡聚糖聚电解质的复合过程。本论文将采用共振光散射方法 研究硫酸葡聚糖钠和壳聚糖复合溶液。首先研究在不同质量比率时复合溶液的性 质。其次研究复合溶液在不同值和金属离子存在下所产生的变化,最后通过 计算复合溶液的热力学参数推断其相互作用机制。 ?研究壳聚糖与重组人骨形态发生蛋白.的相互作用。首先通过共振光散射方法 研究与.的复合溶液在不同浓度和值条件下所产生的变化。其次 通过荧光光谱法研究和.复合溶液的形成过程。最后通过计算与 .的表观结合常数、相应的结合位点数热力学参数推断其相互作用机制。 ?研究硫酸葡聚糖与重组人骨形态发生蛋白.的相互作用。首先通过共振光散射 方法研究与.的复合溶液在不同浓度和值条件下所产生的变化。 其次通过荧光光谱法研究和.复合溶液的形成过程。最后通过计算 与.的表观结合常数、相应的结合位点数热力学参数推断其相互作 用机制。广东工业大学硕士学位论文 第二章壳聚糖肮酸葡聚糖聚电解质复合过程的研究 和在水溶液中可以结合形成各种粒径的聚电解质复合物 】。与形成后,对于具有肝素、或者硫酸肝素以及葡糖氨 基聚糖类的蛋白质均具有极强的亲和力。因此,目前很多细胞因子均采用/ 作为缓释载体【】,并取得了很好的负载率和理想的径粒范围。目前,研究 与两者相互作用的方法主要有滴定法包括电位、电导和比浊滴定法、 电泳法【】及动态光散射法【】。但这些方法灵敏度均不高。基于荧光光谱 仪 通过其特有的吸收一再散射机制,使共振光散射强度急 的共振散射方法, 剧增大【】,从而显著提高测试的灵敏度,并且该方法能够进行实时监测,通 过 散射光强度变化来研究体系结构的动态变化过程。尽管与两者相互作用已 有较详细的报道,但关于两者复合过程中涉及的动力学、热力学问题报道并 不多 见。本章采用研究了/聚电解质复合过程,详细探讨了聚电解质组成, 值、离子强度等外部因素对复合动态过程的影响机制,得到了复合过程中热 力学驱动机制,从而建立一种研究聚电解质复合过程的新方法。 .主要试剂和仪器 ..主要试剂 ,分子量范围,?,,摩尔质量为/,脱乙酰度为%, 公司, ,分子一:,,摩尔质量为/,硫含量为%%,公司 磷酸二氢钠国药集团化学试剂有限公司,用二次蒸馏水配置成./ 的储备液。 一水合柠檬酸天津市百连化工有限公司,用二次蒸馏水配置成./ 的储备液。 天津福晨化学试剂公司,用二次蒸馏水配制成. /的储备液。 章壳聚糖膨酸葡聚糖聚电解质复合过程的研究 溶液广州化学试剂公司,用二次蒸馏水配制成. /的储备液。 天津福晨化学试剂公司,用二次蒸馏水配制成 /的储备液。 所有的化学试剂在使用前没有进一步纯化。 实验仪器 .. 组合式荧光寿命与稳态荧光光谱仪英国爱丁堡仪器有限公司; ?数字计上海雷磁仪器厂;?紫外.可见分光光度计铂金埃尔默 . 仪器有限公司;紧凑型加热制冷循环器优莱博技术有限公司; 有限 电子分析天平德国科恩有限公司:单道手动.移液器 公司。 .实验方法 ?溶液.×’/的制备:准确称取 .于小烧杯中用.%/的 的容量瓶 乙酸溶液溶解后,加入二次蒸馏水,超声波震荡溶解后,转移到. 中,用二次蒸馏水定容。该溶液保存在.冰箱中备用。 ?溶液.×。/的制备:准确称取 .于小烧杯中用二次蒸馏水 溶解,超声波震荡溶解后,转移到.的容量瓶中,用二次蒸馏水定容。该溶液 保存在.冰箱中备用。 ?磷酸盐缓冲溶液./:称取一定量的磷酸氢二钠,用二次蒸馏水溶解后, 转移到.的容量瓶中,用二次蒸馏水定容,配成./的溶液。使用时与不 同体积的./柠檬酸溶液混合,调节至所需的值。 /聚电解质溶液的制备:用移液器计量将溶液与溶液按一定的体 积/混合:;:;:;:;:;:;:;:;:;:; : :干基,将它们搅拌至均匀状态并在室温下存放一段时间,得至/复 合溶液。然后,在容量瓶中,依次加入一定量的/复合溶液及磷酸盐 缓冲液,蒸馏水定容,振荡摇匀,溶液酸度用.数字计来校正,备用。 /聚电解质临界胶束浓度的测定:用移液器计量将溶液与溶液按 ? :/混合,将他们搅拌至均匀状态并在室温下存放一段时间,得至/ 复合溶液,然后用二次蒸馏水按比例稀释母液配制不同浓度的/复合溶液。广 东工业大学硕士学位论文 采用组合式荧光寿命与稳态荧光光度计测量共振散射光谱, 沁沁即?护 。采用组合式荧光寿命与稳态荧光光度计测量共振 散射光谱,沁九即出 。利用?紫外.可见分光光度计在一 勾测定单一溶液及其混合溶液的紫外光谱。溶液酸度用.数字计 来校正。利用电子控制的恒温调节器来改变样品的温度,温度控制误差为.。 利用电子控制的恒温调节器来改变样品的温度,温度控制误差为:.。 .共振散射实验原理 当人射光通过吾笛聚集的向分于浴淑时,敢射光的强度会凼友生及收相冉次 散射而迅速增大。这样在与入射光成角处进行检测, ?, 删,箐降睁。 式中 。/溶液中表示折光指数实 。。常数,害和罢分别是. 部和虚部的增量,是表示光散射增加的因子。聆是介质的折射率 是溶液的摩尔浓度,是入射波长,是吸收系数。因此,当入射波长接近分子 吸收带,警?,即除折光指数的实部对光散射有贡献外,虚部也有很大贡献, 特别是靠近吸收带时贡献更大,将产生共振光散射。 因为欠//,/是入射光强度,玩是共振光散射强度,这样 , 旷一。箐降别。 系统的浊度。可定义为 , 铲篆傺埭 由上面可得溶液的共振散射强度玩与溶液浊度的关系: 旷。警 此外,聚合物溶液的浊度。也和大分子的流体力学半径有关 。 、 . 。:? 。第二章壳聚糖,硫酸葡聚糖聚电解质复合过程的研究 式中,?:/?,为散射横截面的比例系数,综合公式 和可得: ,,、,、 一?. :??~/一 这样从公式可看出,在溶液浓度和环境条件不变时,聚合物溶液共 振散射强度乐与其流体力学半径倒数腿成比例。于是,体系强度的 增加表明其溶液中高分子链的收缩。相反地,体系强度的下降表明溶液中 其高分子链的扩展。这样,通过体系信号的变化可以迅速的表征溶液中高 分子聚合物的链段运动和构象变化。 , 半糕 此外,由共振光散射理论可知,溶液散射强度与溶液中散射粒子的数目 及散射粒子的大小或者说聚集单元的体积有关。因此,也可以用来表征 溶液中聚合物大分子链的聚集行为?。 结果与讨论 . ..共振光散射光谱 、溶液以及圮复合电解质溶液的光谱如图.所示。这三种 溶液具有相同的散射谱图,散射峰位于,但单独的和溶液的信 号较弱,当两者混合后,体系的强度显著增大,且明显超过它们各自散射强 度相加之和,这就清楚地表明和之间存在着某种相互作用,如链上 和链上.之间的静电作用【,从而导致了分子体积更为增大的 /复合物的生成。 广东工业大学硕士学位论文 ‘ ? 套 ? ? 图. 、溶液以及/复合电解质溶液的共振散射光谱,溶液浓度为 .~/,溶液浓度为.‘/,/复合溶液浓度;.~/。 。 / .. . 一/,. /. 一/. 图 、溶液以及/复合电解质溶液的吸收光谱内插图为、溶液的 吸收光谱,溶液浓度为.。/,溶液浓度为.一/,/复合溶