天南星科有毒中药凝集素蛋白与毒性的相关性研究道

天南星科有毒中药凝集素蛋白与毒性的相关性研究道 , ,,,,, ,, ;,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,;,,, ,,,, ,,,;,,, ,,, ,,,,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,, ,,, ,,;,,,,,, , ,,,,,,,,:,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,:,,,,(,, ,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,, ,,,,;,,,，,,,, ,,,，,,,,,学号:,,,,,,,, 博士学位 天南星科有毒中药凝集素蛋白与毒性 的相关性研究作者姓名 刘先琼 申请学位级别 博士指导教师姓名 吴皓 职 称 教授学科专业 中药学 研究方向 中药炮制机理研究学习时间自 ,,,,年,月 ,,日 起至,,,,年,月 ,, 日止论文提交日期,,,,年, 月 , 日 论文答辩日期,,,,年,月,日学位授予单位 南京中医药大学 学位类型 医学科学学位 原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 渺年乡月，阳学位论文作者(需亲笔)虢参降谁 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权南京中医药大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密口，在一年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密?。 (请在以上方框内打“巾)学位论文作者(需亲笔)签名:壶(,蝣 肼乡月阳导师(需亲笔) (尹,晦毛, 南京中医药大学博士学位论文 目 录中英文对照缩略词 表……………………………………………………………………………”，摘 要…………………………………………………………………………………………，，，,,,,,,, , 郑桑傻谝徊糠治南籽芯俊 斓谝徽卵字?赴蜃釉谘字?械难芯拷埂钡诙轮参锬氐挠τ醚芯拷埂ぃ保驳谌卤究翁獾难芯糠桨干杓啤 ぃ保?第一节研究背景……………………………………………………………………………………”, , 第二节研究技术路 线…………………………………………………………………………………,,第二部分实验研究…………………:…………………………………………………………,,，天南星科四种有毒中药毒针晶蛋白的分离鉴定和毒性相关蛋白的分离纯化及性质研究,,第四章天南星科有毒中药毒针晶蛋白成分及共性刺激性蛋白的研究………………?,, 第一节半夏、掌叶半夏、天南星及白附子毒针晶蛋白凝胶电泳分析………………………………,, 第二节半夏、掌叶半夏、天南星及白附子毒针晶蛋白条带液相色谱与串联质谱偶联分析……一,,第五章天南星科有毒中药块 茎中凝集素蛋白的提取分离纯化及性质研究………………?,,第六章天南星科有毒中药毒针晶中凝集素蛋白与块茎中凝集素蛋白比对鉴定…………?,,第七章天南星科四种有毒中药毒针晶中凝集素蛋白的含量测定…………………………?,,，，凝集素蛋白促炎作用及其与毒针晶毒性的相关性研 究……………………………………,,第八章天南星科四种有毒中药凝集素蛋白的促炎作用研究………………………………?,,第九章天南星科四种有毒中药凝集素蛋白与毒针晶的刺激性协同作用研究……………?,,第十章天南星科凝集素蛋白促炎作用与炎症相关细胞的研究……………………………?,, 第一节天南星凝集素蛋白促炎作用与居留细胞等的相关性研究…………………………………一,, 第二节半夏、掌叶半夏、天南星及白附子凝集素蛋白刺激巨噬细胞释放炎症介质的研究………,,结 语………………………………………………………………………………………………………………………一,,,攻读博士学位期间取得的成 果………………………………………………………………„,,,致谢…………………………………………………………………………………………„,,,作者简 介………………………………………………………………………………………?,, , 南京中医药大学博士学位论文 一,,,,,—,—,,?,,,,—?,??,,,,,,,,,,,,—,,,,,,,,,,,,,,,———,,,,,,—,,?,,,,,,,,,,,———,,,,,,,，,,,,,,,,,,,,,,,,,?,?—,,——,,,,,,,,,,,,,,,——,,,,,,,,,,一 中英文对照缩略词表 ,,,,,, ,,,,;,, ,,,,,,, ,,,,,;,,,,,,,, ,,,,,,,,,(?～ 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,,,;,,,,,,,,,,, ,,？,,, ;,,,,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,,,,(,,,,, 液相色谱串联质谱联用 ,,,;,,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,, ,,;,,, 半夏凝集素 ,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,;,, ,,;,,, 掌叶半夏凝集素,,, ,,,,,,,, ,,,,,,;,,, ,,;,,, 天南星凝集素,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,;,,, 白附子凝集素 ,,,,,,,;,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,,;,,,,(,,,, 高效体积排阻色谱 ,,？,,, ;,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,, ,,, ,,,,,;,,,,,,,,,,， 美国国立生物技术信息中心 ，,,,,,,,,,,,, ,,,,,; ,,,,, 一氧化氮,,,, ,,,,,,,,,,,,, ,, 前列腺素,,,,,(, ,,,,, ,,;,,,,, ,,;,,,,,,,,, 肿瘤坏死因子(,，,(, ，,,,,,,,,,,(, 白细胞介素(,，,(, ，,,,,,,,,,,(, 白细胞介素(,,,,,, ,, , ,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,, 四甲基乙二胺,;, ,;,,,,,,,, 丙烯酰胺,,, ,?,?,,,,,,,,,,,,,,?,;,,,,,,,, ,，,(亚甲基双丙烯酰胺,,, ,,,,,, ,,,,;,, ,,,,,,, 十二烷基硫酸钠,,,, 嘶,(,,,,,,,,,,,,,),,,, ,,,,,,,, 三羟甲基氨基甲烷,,, ,,,;,,, 甘氨酸,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,, 过硫酸铵,,, ,,,,,,,,,,,,,, 二硫苏糖醇,,, ,;,,,,,,,,,,, 丙烯腈，,, ,,,,,;,,,,,,, 碘乙酰胺,搦 ,,,,,,,,,,;,,,; ,;,, 三氟醋酸,,, ,,,,,,,,,, 色氨酸 ～墨茎翌墨箜堕塑室 (————————————,, ————?————————————————————————————————————————————————————————————一 一(，,, ，,,,,,, 胰岛素,溺 ,,,,,,,,, 卵清蛋白,,, ,,,,,, ,,,,, ,,,,,,, 牛血清白蛋白,,, ,,;,,;,,,,,,; ,;,, 蛋白浓度定量测试法,,,, ,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,, 聚偏氟乙烯,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,, 磷酸盐缓冲液,, ,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,;,,,, 腹腔注射,, ,,,,,,,;,,,,, 巯基乙酸盐 ,,,,,,,, ,,,,, ,一甲基一对甲氧基苯乙胺和甲醛的,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,, 缩合物 ,,,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 甲酰甲硫氨酰亮氨酰苯丙氨酸 南京中医药大学博士学位论文 摘 要 本学位论文得到两项国家自然科学基金——天南星科有毒中药矾制解毒共性规律研究(,,(,,,,,,,,)、天南星科有毒中药凝集素蛋白与毒性的相关性和炮制的影响(,,(,, ,,,,,,)以及江苏省普通高校研究生科研创新项目(,,(,,,,, , ,,,,)的资助。 ,,,,版《中国药典》?收载的半夏(,,,,,,,, ,,,,,,,(,,,,,(),,,,,()、天南星(,,,,,,,,,,,,,,;,,,(,,,,(),;,,,,)、白附子(,,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,)及在市场上作为天南星的代用品广泛使用的掌叶半夏(,,,,,,,, ,,,,,,,,;,, ,;,,,,()，均属于天南星科，为临床常用有毒中药，这四种有毒中药临床中毒症状极为相似，误服均出现粘膜及皮肤刺激，口舌肿胀，呼吸缓慢甚至窒息死亡，所以中医临床上均使用炮制品。 论文作者所在课组在前期研究中提出并证实天南星科四种有毒中药半夏、掌叶半夏、天南星及白附子的刺激性毒性成分均为其所含有的具有特殊晶形的针晶复合物，具有强烈的刺激性毒性，可产生严重的刺激性炎症反应，故课题组称为“毒针晶”。毒针晶主要由草酸钙、蛋白组成，前期研究发现组成毒针晶的草酸钙没有刺激性作用，而组成毒针晶的蛋白可显著加重豚鼠破损皮肤的炎症反应。对半夏毒针晶蛋白研究的结果显示，半夏毒针晶上带有的半夏凝集素蛋白是半夏毒针晶进一步诱发炎症反应的刺激物，凝集素蛋白可显著诱导中性粒细胞迁移，引起大鼠足趾肿胀，可显著加重毒针晶引起的家兔眼结膜水肿，具有强烈的促炎作用。天南星科的掌叶半夏、天南星及白附子，与半夏同属天南星科，刺激性毒性反应相似，毒性物质基础都是块茎中含有的毒针晶，故本论文提出，掌叶半夏、天南星、白附子的毒针晶上也存在与半夏类似的化学刺激物。对天南星科有毒中药凝集素蛋白与毒针晶毒性的相关性研究，除本课题组外，未见有研究报道。 本学位论文以同属天南星科、毒性表现相似的有毒中药掌叶半夏、天南星及白附子 的毒针晶为研究对象，以半夏为参照，考察半夏、掌叶半夏、天南星及白附子的毒针晶中是否存在同类的与刺激性毒性相关的化学成分，研究表明四种有毒中药的毒针晶中带有共性的凝集素(,,;,,,)蛋白成分。进一步的研究结果表明四种毒针晶中的凝集素蛋白均具有显著促炎作用，毒针晶的刺激性毒性是凝集素蛋白随毒针晶刺入组织后诱导炎症反应产生严重的炎症刺激性毒性。论文基本阐明了天南星科有毒中药半夏、掌叶半夏、天南星及白附子凝集素蛋白与毒性的相关性，主要工作内容和研究结果包括以下几个方面:,天南星科有毒中药毒针晶蛋白类成分分析及共性刺激性相关蛋白研究 采用,,,,,,,,(,,,,,, ,,,,;,, ,,,,,,, ,,,,,;,,,,,,,, ,,, ,,,;,,,,,,,,,,,， ,,， 中英文对照缩略词表,,,(,,,,)分析，考察半夏、掌叶半夏、天南星及白附子毒针晶的条带，是否存在分子量相同的蛋白条带，结果显示分子量约,, ,,,处有相同的蛋白条带。继续将毒针晶中约,, ,,,处的蛋白条带采用混合蛋白胶内酶解后肽段的液相色谱串联质谱联用(,,？,,,;,,,,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,, ,,,;,,,,,,,，,,,,,(,,)技术分析，结果显示四种毒针晶约,, ,,,的条带存在共性的凝集素蛋白，分别为半夏凝集素(,,,,,,,, ,,,,,,, ,,;,,,，,,,)，掌叶半夏凝集素(,,,,,,,, ,,,,,,,,;,, ,,;,,,，,,,)，天南星凝集素(,,,,,,,, ,,,,,,;,,,,,;,,,，,,,)及白附子凝集素(,,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,;,,,，,,,)。,天南星科有毒中药凝集素的提取分离纯化及性质研究 从半夏、掌叶半夏、天南星及白附子新鲜块茎中分离纯化相应的植物凝集素蛋白,,,、,,,、,,,及,,,。提取分离的流程为:半夏、掌叶半夏、天南星及白附子新鲜块茎粗提液经硫酸铵分级沉淀、苯基琼脂糖凝胶(,,,,,, ,,)疏水柱层析、,,,,(,,，(,,,,(,)缓冲体系，收集主峰通过强阴离子(, ,,)交换柱层析，脱盐，冷冻干燥分别得,,,、,,,、,,,及,,,。高效体积排阻色谱(,,,,(,,;,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,,;, ,,？,,,;,,,,,,,,,,,,,，,,,(,,,,)及,,,(,,,,电泳分析显示分离所得的,,,、,,,、,,,及,,,均达到色谱纯及电泳纯，测得其分子量约为,, ,,,。通过不同来源红细胞、温度、,,及糖或糖蛋白考察凝集素蛋白的凝集活性，结果显示:四种凝集素蛋白均能凝集兔、鼠、狗的红细胞，。不能凝集鸡及人的红细胞;,,?以下具有凝集活性，,,。,以下凝集活性最强，,,?以上凝集活性全部丧失;,, ,(,,,,(,范围内具有凝集活性，,, ,(,(,一,(,范围内凝集活性保持稳定，,,达到,,(,，凝集活性完全丧失;凝集活性不被,(木糖、,(核糖、,(阿拉伯糖、无水葡萄糖、,(半乳糖、,(甘露糖、,(鼠李糖、甲基(,;(,(甘露糖苷所抑制，仅被去唾液酸胎球蛋白所抑制。,天南星科四种有毒中药毒针晶中凝集素蛋白与块茎中凝集素蛋白比对鉴定 为进一步确定毒针晶上带有的凝集素蛋白是否与相应植物块茎中的凝集素蛋白为同一蛋白，采用,,,(,,,,分析，研究表明从植物块茎中分离获得的半夏、掌叶半夏、天南星及白附子的凝集素蛋白与其毒针晶蛋白具有相同的分子量。进一步对块茎中分离的凝集素蛋白进行,,(,,(,,分析鉴定，与美国国立生物技术信息中心(,,,,,,,, ,,,,, , ,,,,,,,,;,,,,,,, ，,,,,,,,,,,，,,,，)数据库进行比对，发现从块茎中提取的凝集素蛋白为对应植物的凝集素蛋白。蛋白免疫印迹,,,,,,, ,,,,,,,,结果进一步证实四种毒针晶中含有相应的,,,、,,,、,,,及,,,，即从块茎中提取分离的半夏、掌叶半夏、天南星及 白附子凝集素蛋白与相应毒针晶上带有的凝集素蛋白为同一蛋白。 ,, 南京中医药大学博士学位论文,天南星科有毒中药毒针晶中凝集素蛋白的含量研究 前面的研究结果表明毒针晶上含有凝集素蛋白，采用,,,,,,, ,,,,,,,,对毒针晶上的凝集素蛋白含量进行半定量分析，结果半夏、掌叶半夏、天南星及白附子毒针晶中的凝集素蛋白占毒针晶蛋白上的含量,,,为,,(,,,，,,,为,,(,,,，,,,为,,(,,,，,,,为,,(,,,，四种有毒中药凝集素蛋白含量大小顺序为掌叶半夏,半夏,天南星,白附子，该结果与前期课题组研究的四种有毒中药的毒针晶毒性与其蛋白的含量呈相关性的结果一致，表明四种毒针晶的毒性与毒针晶中带有的凝集素蛋白含量呈正相关。,天南星科四种有毒中药凝集素蛋白的促炎作用研究 采用大鼠腹腔中性粒细胞迁移模型研究,,,、,,,、,,,及,,,的促炎作用。结果显示腹腔注射,,,、,,,、,,,及,,,后，四种有毒中药的凝集素蛋白出现明显的中性粒细胞向腹腔迁移的现象并呈剂量依赖性，腹腔液中炎症介质一氧化氮(,,,,,; ,,,,,，,,)、前列腺素,,(,,,,,,,,【,,,,, ,,，,,,,)及肿瘤坏死因子仅(,,,,, ,,;,,,,,,,;,,,,,,,,,，,,,(,【)的含量与空白组相比较均显著升高，表明,,,、,,,、,,,及,,,均可诱导炎症介质释放。进一步考察加热对凝集素蛋白致大鼠腹腔中性粒细胞迁移的影响，结果显示加热组与空白组比较无显著性差异，表明加热可导致凝集素蛋白失活，使其促炎作用显著下降。,天南星科四种有毒中药凝集素蛋白与毒针晶的刺激性协同作用研究 采用家兔眼结膜刺激性模型，家兔破损皮肤刺激性模型和大鼠足趾肿胀模型，考察,,,、,,,、,,,及,,,对毒针晶所致家兔眼刺激性，家兔破损皮肤刺激性及大鼠足趾肿胀的影响以.