抑菌试验方法总结

抑菌试验 用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称为抑菌试验。通过抑菌实验，可以测定一个药物的最低抑菌浓度，用以评价该药物的抑菌性能，这是抗菌药物的最基本的药效学数据。主要方法有进行定性测定的扩散法(如抑菌斑试验)和进行定量测定的稀释法(如最低抑菌浓度实验)。 1、定性测定 (1)纸片扩散法(disk diffusion test)，K-B法: WHO推荐的全球统一的方法。 原理:含有定量抗菌货物的纸睡帖在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。 质控:标准菌株的抑菌圈直径应落在预期范围内，如果超出该范围，应视为失控而予以纠正。 影响因素:培养基的质量、药敏纸片的质量、接种菌量、试验操作质量、孵育条件、抑菌圈测量工具的精度和质控菌株本身的药敏特性等均能影响试验结果的准确性。 操作方法: 按每1000 ml蒸馏水称取Muller-hinton Agar 38 g配备M—H琼脂，按每个平皿(直径9 mm)25 ml进行分装。 将孵育16—24 h的菌种分别接种生理盐水试管中，校正浓度至0.5麦氏标准(相当于1.0 8×10 CFU,m1)。 用无菌棉签拭蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液后在M—H琼脂表面，均匀涂布接种3次，每次旋转平板60度，最后沿平板内缘涂抹1周。 平板在室温下干燥3—5 min后用无菌镊子将药物纸片紧贴于琼脂表面(置35?孵育16 18 h。记录抑菌圈的直径，实验。重复10次。 主要用于比较不同抗菌物质，或者通过不同方法提取的同一种物质的效果。 (2)打孔法药敏实验: 8待M—H平板干后，用无菌棉签蘸取菌液(相当于1.0×10 CFU,m1)，在培养基平板上密集划线接种。盖好平皿。放置5 min，待平板表面水分吸收后，用直径6 mm无菌金属打孔器在平皿内打孔。除去洞内琼脂，用微量移液器吸取50μl第二次浓缩液加入洞内，37?培养16~18 h，记录抑菌圈的直径。实验重复10次。 主要用作重复试验 2、定量测定的稀释法(dilution test)，主要测定细菌对某药的最低抑菌浓度，包括肉汤稀释法和琼脂稀释法。 (1)肉汤稀释法 培养基使用Mueller-Hinton(MH)肉汤，pH7.2~7.4。 稀释抗菌药物的制备及菌液接种 取无菌试管(13×100mm)13支，排成一排，除第1管加入1.6mlMH肉汤外，其余每管加入MH肉汤1ml，在第1管加入抗菌药物原液(如1280μg/ml) 0.4ml混匀，然后吸取1ml至第2管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比稀释至第11管，并从第11管中吸取1ml弃去，第12管为不含药物的生长对照。此时各管药物浓度依次为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml。然后在每管内加入上述制备好的接种物各1ml，使每管最终菌液浓度约为5×105CFU/ml。第1管至第11管药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、05、0.25、0.125μg/ml。 将接种好的稀释管塞好塞子，置35?普通空气孵箱中孵育16~20h 结果判断与解释 在读取和报告所测试菌株的MIC前，应检查生长对照管的细菌生长情况是否良好，同时还应检查接种物的传代培养情况以确定其是否污染，质控菌株的MIC值是否处于质控范围。以肉眼观察，药物最低浓度管无细菌生长者，即为受试菌的MIC。 用于测定MIC (2)琼脂稀释法: 原理:琼脂稀释法是将不同剂量的抗菌药物，加入融化并冷至50?左右的定量MH琼脂中，制成含不同递减浓度抗菌药物的平板，接种受试菌，孵育后观察细菌生长情况，以抑制细菌生长的琼脂平板所含最低药物浓度为MIC。本法优点是可在一个平板上同时作多株菌MIC测定，结果可靠，易发现污染菌;缺点是制备含药琼脂平板费时费力。 培养基使用MH琼脂，pH7.2~7.4。 含药琼脂平板制备 根据实验设计，将已倍比稀释的不同浓度的抗菌药物分别加入已加热溶解，并在45~50?水浴中平衡的MH琼脂中，充分混匀倾倒灭菌平皿，琼脂厚度3~4mm。通常按1?9比例配制药物琼脂平板，根据需要来选择药物浓度范围。配制好的含药琼脂平板应装入密封塑料袋中，置2~8?冰箱可贮存5天。 接种物制备与接种 制备浓度相当于0.5麦氏标准比浊管的菌悬液，再1?10稀释，以多点接种器吸取制备好菌液(约1~2μl)接种于琼脂平板表面，每点菌数约为104CFU，形成直径为5~8mm的菌斑。接种好后置35?孵育16~20h 结果判断 将平板置于暗色、无反光物体表面上判断试验终点，以抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。 如果出现有2个以上菌落生长于含药浓度高于终点水平的琼脂平板上，或低浓度药物琼脂平板上不长而高浓度药物琼脂平板上生长现象，则应检查培养物纯度或重复试验。 本试验特点是可同时做多株菌株的MIC测定，结果的重复性优于肉汤稀释法，且易于发现污染或耐药突变菌，是新药证时常用的外药敏试验经典参照标准。 3、3.E试验(E-test) E试验是指浓度梯度琼脂扩散试验，其原理基本同扩散法，即浓度呈连续梯度的抗菌药物从塑料试条中向琼脂中扩散，在试条周围抑菌浓度范围内受试菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。E试验综合了稀释法和扩散法的原理和特点，同时还弥补了二者的一些不足，可以像稀释法一样直接定量测出抗菌药物对受试菌的MIC。 3.1.培养基、菌液制备和接种 同纸片扩散法。 3.2.贴E试验条 同纸片扩散法，E试验条的刻度面朝上，不得贴反，一旦接触琼脂后不得再移动。直径150mm的平皿内可放置6根E试验试条，90mm者一般只能放置1根。 3.3.孵育时间和温度 同纸片扩散法。 3.4.结果阅读 孵育后围绕试条可形成一个椭圆形的抑菌圈，在抑菌圈和试条的横切相交处试条上的读数刻度即是测定抗菌药物对受试菌的MIC。阅读时应注意的问题见供应商的产品说明书。