雷洛昔芬通过促进一氧化氮释放诱导脂肪干细胞向成骨细胞分化（可编辑）

雷洛昔芬通过促进一氧化氮释放诱导脂肪干细胞向成骨细胞分化（可编辑） 雷洛昔芬通过促进一氧化氮释放诱导脂肪干细胞向成 骨细胞分化 ?? 24?? 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBulletin 2011Jan;27 1 :24,8 雷洛昔芬通过促进一氧化氮释放 诱导脂肪干细胞向成骨细胞分化 卢 翔，陈江宁，张峻峰 南京大学生命科学院生物医药国家重点实验室，江苏 南京 210093 中国图书分类号:R一332;R329(21;R329(24;R977(12 力及其机制。 文献标识码:A 文章编号:1001―1978 2011 O1―0024―05 1 与 摘要:目的 探讨雷洛昔芬诱导脂肪干细胞向成骨细胞分化 1(1 材料 作用及其机制。方法 从大鼠体内提取分离脂肪干细胞，并 1(1(1 实验动物 sD大鼠，早，体质量 200?20 进行多向分化能力鉴定。在成骨诱导培养液中加入不同浓 g 维通利华动物试验中心，合格证编号:SCXKI1― 度雷洛昔芬 0、0(01、0(1、1Ixmol??L 、非选择性一氧化氮 00―0009 。 合成酶抑制剂 一硝基精氨酸甲酯 L―NAME 1mmol?? 1(1(2 试剂与药品 雷洛昔芬 raloxifene，Ra1 由 L 、雷洛昔芬 1txmol??L +L―NAME 1mmol??L ， 山东银飞达药业有限公司提供。DMEM Dulbecco，S 在共同条件培养14―28d，测定各项成骨细胞形成指标。结 modifiedEagle， fetalbo― Smedium 培养基、胎牛血清 果 雷洛昔芬 0(01―1l~mol??L 能明显提高脂肪干细胞 胞质一氧化氮的释放和成骨细胞分化标志基因 碱性磷酸 vinesertlm，FBS 、青 一链霉素溶液、十二烷基磺酸 酶、骨形态发生蛋白2和I型胶原 的达以及矿化结节的 钠 SDS 购自美国 Gibco公司;维生素 C vitamin 生成，一NAME可以拮抗雷洛昔芬引起的胞质一氧化氮的释 C 、3-磷酸甘油 3-glycerophosphate 、地塞米松 放，并同时抑制雷洛昔芬诱导脂肪干细胞向成骨分化的作 dexamethasone 、II型胶原酶 typeIIcollagenase 、 用。结论 雷洛昔芬可以促进胞质一氧化氮释放，从而诱导 胰蛋白酶 trypsin 、溴 ― 化甲基噻唑基四唑 methythi 脂肪干细胞向成骨细胞分化。 azolyltetrazoliumbromide，MTT 、茜素红 alizarin 购 自美国Sigma公司;BMP2、Col―I抗体购自武汉博士 关键词:雷洛昔芬;脂肪干细胞;多向诱导分化;成骨分化;一 德生物技术有限公司。TRIzol购自美国 Invitrogen 氧化氮;细胞增殖 公司。碱性磷酸酶 alkalinephosphatase，ALP 试剂 盒购自南京建成生物技术研究所;PCR引物由In( 长期的雌激素补充治疗可以改善妇女更年期骨 质流失以及降低骨折发生的几率，但同时可增加乳 vitrogen公司合成。用于逆转录和PCR的分子生物 腺癌的风险?J。选择性雌激素受体调节剂 selec( 学试剂全部购自Et本 TaKaRa公司。一氧化氮 ni( tricoxide，NO 试剂盒购自碧云天生物技术研究所。 tiveestrogenreceptormodulator，SERM 雷洛昔芬 raloxifene，Ra1 为一种非类固醇类、苯噻酚化合物， 其他相关试剂均购买自南京生兴生物有限公司，均 为国产或者进口 纯。 由于其对骨骼具有保护作用，对乳腺和子宫内膜无 1(1(3 主要实验仪器 和设备 电子天平 德国 刺激作用，已被批准用于绝经后妇女骨质疏松的预 防和治疗。雷洛昔芬除了可以预防和治疗绝经后妇 ;离心机 美国Eppendorf公司 ;紫 Sartorius公司 女的骨质疏松症，增加骨密度，还能降低乳腺癌和子 外分光光度计 深圳爱克分析仪器有限公司 ;CO。 宫内膜肿瘤的风险、动脉粥样硬化形成指标以及心 恒温培养箱 上海华明医化器械厂 ;2934型倒置相 血管疾病发生的可能 。J。但此种化合物调节成骨 差显微镜 COIC公司 ; ModeB50酶联免疫检测仪 分化作用、机制目前仍不甚明了 J。本实验通过雷 日本 BIO―RAD公司 ;PCR仪 日本 BIO―RAD公 洛昔芬介导的大鼠脂肪来源的间充质干细胞体外培 司 ，HNZ一1(1F垂直流形超净工作台 南通沪南科 养，探讨雷洛昔芬诱导脂肪干细胞向成骨分化的能 学仪器有限公司 ;培养板 Coming―Costar，NY，美 国 收稿日期:2010,10―08，修回日期:2010―11―23 1(2 方法 基金项 目:国家 自然科学基金资助项目 No30771036 1(2(1 细胞培养 断颈处死大鼠，提取腹股沟脂肪 作者简介:卢 翔 1980一 ，男，博士生，研究方向:药理学 ，Tel:025- 组织。按文献l6一中的方法，提取脂肪干细胞，将5 83596594，E―mail:kakabb@ 163(eom; ― ml的细胞以2×10cells??L 的密度接种于培养瓶 张峻峰 1968一 ，男，博士，教授，研究方向:药物靶向性 治疗与药理学，通讯作者 ，E-mail:j~hang@nju(edu(cn 中，48h后换液，待细 ,汇合时，用0(25,胰 胞达80 国药理学通报 ChineSePharmacologicalBulletin 2011Jan;27 1 ??25?? 蛋白酶 含0(02, EDTA 传代，传至第3代备用。 GACAATCTTGAGGGA(3。PCR程J字如 下:95cIC5 1(2(2 脂肪干细胞多向分化能力的鉴定 取第3 min;95oC变性30S，55oC退火30S，72?延伸30 S，30个循环;72cc10min。 代脂肪干细胞以10cells??L 的密度接种于6孔 板，每孔2ml培养液，待细胞达80,汇合时，进行诱 1(2(5 细胞内碱性磷酸酶 ALP 活性测定 将脂 导分化。脂肪诱导分化步骤:加人 10, FBS的高糖 肪干细胞以10cells??L 的密度接种于6孔板中， DMEM培养基 含1p~mol??L 地塞米松、0(5mmol 每孔2ml完全培养基，待细胞达80,汇合时，换成 ?? L,IBMX、1mg??L 胰岛素、0(2mmol??L 吲哚 成骨诱导培养基，进行成骨诱导。实验分组同 美辛 ，培养2d;2d后换成只含 10mg??L 胰岛素 “1(2(3”。诱导 14d后，弃培养液，PBS洗3次，用 的10,FBS的高糖DMEM培养基继续培养2d;之 试剂盒对 ALP进行定量分析。用考马斯亮蓝测定 后换成完全培养基 高糖 DMEM+10, FBS 继续 细胞裂解液中蛋白质含量。ALP活性表示为:mmol ??rain, ??g,Protein。 培养 1周。油红染色鉴定脂肪分化。 1(2(6 免疫细胞化学检测 Ra1对脂肪干细胞 BMP2 成骨诱导分化步骤:用成骨分化诱导培养基含: 10mmol??L―B(甘油磷酸钠、50p~mol??L 的维生 和 Col―I的合成 将脂肪干 s??L 的 细胞以 10 cell 素C、0(1p,mol??L 的地塞米松培养28d，Vonkos- 密度接种于6孔板中，每孔 2ml完全培养基，待细 sa染色鉴定成骨分化。 胞达80,汇合时，换成成骨诱导培养基，进行成骨 软骨诱导分化步骤:用软骨分化诱导培养基含: 诱导。实验分组:Ral组 0(1p~mol??L。 、Ral 0(1 10 g??L_。TGF―B1、6(25mg??L 胰岛素、0(1 mol p,mol??L +L―NAME 1mmol??L 组、1mmol?? ?? L,L(NAME组、对照组 Con，加入相应浓度的DM( L 地塞米松和50nmol??L 维生素C培养21d， SO 。诱导14d后，弃培养液，PBS洗3次，对BMP2 甲苯胺蓝染色鉴定软骨分化。 和Co1(I蛋白进行免疫细胞化学染色。 1(2(3 细胞内一氧化氮的测定 将脂肪干细胞以 1(2(7 钙化结节的测定 将脂肪干细胞 以 1O 5×10cells??L 的密度接种于48孔板中，每孔 1 cells??L 的密度接种于24 1ml完全 孑L板中，每孔 ml完全培养基，待细胞贴壁后，加入Ral及相应的 培养基，待细胞达80,汇合时，换成成骨诱导培养 抑制剂。实验分组:Ral组 0(O1、0(1和 1 mol?? L 、Ral 0(1Ixmo]??L + 一NAME 1mmol?? 基，进行成骨诱导。实验分组同“1(2(6”。诱导28 d后，弃培养液，PBS洗3次，茜素红染色。 L 组、1mmol??L,L-NAME组、对照组 control， 1(2(8 MTF检测雷洛昔芬对脂肪干细胞增殖的影 Con，加入相应浓度的DMSO 。待细胞达80,汇合 响 将脂肪干细胞以10cells??L 密度接种于96 时，弃上清，PBS洗3次，胰蛋白酶消化细胞，超声裂 解。用一氧化氮检测试剂盒 Griess法检测细胞胞质 孔板 中，每孔200 l完全培养基。实验分组:Ral 组 0(01、0(1和 1p,mol??L 、对照组 Con，加入 中硝酸盐亚硝酸盐浓度，间接反映一氧化氮释放量。 相应浓度的DMSO 。分别在加 、3、5、 药处理后 d1 用考马斯亮蓝测定细胞裂解液中蛋白质含量。一氧 7、9进行 MTF实验。 化氮释放量表示为:tool??L,??g,Protein。 1(2(9 统计学处理 数据以 ?s表示，组间比较 1(2(4 PCR检测成骨标志蛋白mRNA水平表达 用方差分析。统计分析用方差分析，统计分析用 将脂肪干细胞以 10cells??L 的密度接种于6孔 板中，每孔2ml完全培养基，待细胞达80,汇合时， SPSS12(0软件完成。 2 结果 换成成骨诱导培养基，进行成骨诱导。实验分组同 2(1 脂肪干细胞多向分化能 力的鉴定 由于脂肪 “1(2(3”。诱导14d后，弃培养液，PBS洗3次，Tr― izol法提取总 RNA、逆转录PCR鉴定 BMP2、ALP、 干细胞是一种具有多向分化能力的成体干细 胞_8J。所以本文中首先我们对提取的细胞分化能 Col―ImRNA水平 的表达。引物序列如下:ALP sense 5-TCGGACCCTGCCrrI’ACCA一3， antisense 力进行鉴定，以确定其是否是脂肪干细胞:经成脂诱 5一TGTCTCCTCGCCCGTGTT一3;BMP2 sense 5一 导，油红染色发现诱导后细胞胞质中出现亮红色的 AACCCAGGTGTCTCCAAG(3， antisense 5一 脂滴 Fig1 。经成骨诱导28d后，VonKossa染色 AAGTCCACATACAAAGGGTG一3;Col―I sense 5一 发现细胞中有多个大块黑色团块着色，说明诱导后 CGAGTATGGAAGCGAAGGT一3， antisense 5一 的细胞有钙结节形成 Fig2 。经软骨诱导21d后， CCACAAGCGTGCTGTAGGT一3;GAPDH sense 5一 甲苯胺蓝染色显示细胞胞质呈紫蓝色，表明细胞有 TATCGGACGCCTGGTTAC(3， antisense 5(TGCT( 蛋白多糖的表达。而各未经诱导的对照组不显色或 ?? 28?? 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBulletin 2011Jan;27 1 AcadSci，1997，94 25 :14105―10( [13]武密山，赵素芝，李 恩，白 霞(地黄活性成分梓醇对小鼠成 [4] MatsumoriH，HattoriK，OhgushiH，eta1(Raloxifene:itsossifica― 骨细胞 Me3T3(E1增殖、分化和矿化的影响[J](中国药理学 tion-promotingeffectonfemalemesenchymalstemcells[J](JOr- 通报，2010，26 4 :509―13( WuM S，ZhaoSZ，LiE，BaiX(Effectsofcatalpolfrom Radixreh― thopSci，2009，14 5 :640―5( [13] manniaeonproliferation，differentiation andmatrixmineralization [5] ZhouS，TurgemanG，HarrisSE，eta1(Estrogensactivatebone morphogeneticprotein-2genetranscriptioninmousemesenehymal ChinPharmacolBull，2010，26 4 :509 ofMC3T3-E1cells[J]( ― 13( stemcells[J](MolEndocrinol，2009，17 1 :56―66( [6] RadaT，ReisRL，GomesME(Adiposetissue-derivedstemcells 红，h淑敏(1713(雌二醇和运动对去卵巢大鼠后 [14]陈永杰，沈 andtheirapplicationinboneandcartilagetissueengineering[J]( 肢骨组织 PPARC蛋白表达的影响[J](中国药理学通报， T~sueEngPartBRev，2009，15 2 :113― 25( 2010，z6 5 :580,4( ChenYJ，ShenH，BuSM(Effectsof17B―estradiolandexercise [7] ZhuY，LiuT，SongK，eta1(Adipose-derivedstemcell:abetter [14] onbonePPAR~,expressionofhinderlimb inovarieetomized rats stemcellthanBMSC[J](CellBiochemFunct，2009，26 6 :664 ― 75( [J](ChinPharmacolBull，2010，26 5 :580―4( HisamotoK，OhmichiM，KandaY，eta1(Inductionofendothelial [8] De―UgarteDA，AlfonsoZ，ZukPA，eta1(Differentialexpressionof [15] stem cellmobilization-associatedmoleculeson muhilineage ceHs nitric-oxide synthase phosphorylation by the raloxifene analog LYI17018isdifferentiallymediatedbyAktand extracellularsig― fromadiposetissueandbonemarrow【J](ImmunolLett，2003，89 5 :267― 70( hal―regulatedproteinkinaseinvascularendothelialcells[J](JBiol [9] LeeJ，HanDJ，KimSC，eta1(Invitrodifferentiationofhumanad Chem，2001，276 50 :47642―9( iposetissue―derivedstem cellsintocellswithpancreaticpbenotype SamuelsA， PerryMJ，GibsonRL，eta1(Roleofendothelial nitric [16] byregeneratingpancreasextract[J](BiochemBiophysResCom― oxidesyntbaseinestrogen-inducedosteogenesis[J](Bone，2001， 29 1 :24―9( mlzn，2008，375 4 :547―51( KanazawaI，YamaguehiT，YanoS，eta1(Metforminenhancesthe [1O] De-UgarteDA，MorizonoK，ElbarbaryA，eta1(Comparisonof [17] multi―lineagecellsfrom humanadiposetissueandbone marrow differentiationand mineralizationofosteoblastie，MC3T3一E1cells viaAMPkinaseactivationaswellaseNOSandBMP-2expression [J](CellsTissuesOrgans，2003，174 3 :101―9( [11]De―UgarteDA，AshjjanPH，ElbarbaIyA，eta1(Futureoffatas [J](BiochemBiophysResCommun，2008，375 3 :414―9( [18]FranceschiRT，XiaoG，JiangD，eta1(Multiplesignalingpathways rawmaterialfortissueregeneration[J](AnnPlastSurg，2003，50 2 :215― 9( convergeontheCbfal,Runx2transcriptionfactortoregulateosteo― [12]ZukPA，ZhuM，AshjianP，eta1(Humanadiposetissueisasource blastdifferentiation[J](ConnectTissueRes，2003，44 suppl1 : 】09一】6( ofmultipotentstemcells[J](MolBiolCell，2002，13 12 :4279― 95( Raloxifeneenhancesosteoblasticdifferentiationinadipose derived stem cellsvianitricoxidepathway LUXiang， CHENJiang-ning，ZHANG Jun―feng StateKeyLaboratoryofPharmaceuticalBiotechnology， SchoolofLifeSciences，NanjingUniversity，Nanfing 210093，China Abstract:Aim Toexploretheeffectsofraloxifeneon theexpressionofosteoblasticgene alkalinephospha― osteoblasticdifferentiation(M ethods adipose derived tase，ALP;bonemorphogenetieprotein2，BMP2;typeI collagen，Col―I aswellasenhancedcalcium deposi― stemcells ADSCs wereobtainedfromratsandidenti― fledfortheirmuhilineagedifferentiationpotentia1(Dif- tion(Meanwhile，supplementationofL-NAME 1mmol ?? L 1significantly reversed the raloxifene―induced ferentconcentrationsofraloxifene 0，0(01，0(1，1 txmol??L 1wereaddedintoculturemedium withor NOformationandosteogenicmarkergenesexpression( Conclusions Raloxifenemayinducetheosteoblastic withoutN-nitro―L―argininemethylester -NAME，1 mmol??L (whichisusedasanon―selectiveinhibitor differentiationofADSCsthroughNOpathway( Key words:raloxifene;adiposederivedstem cell;mul― ofnitricoxidesynthase NOS (After14,28dofculti( vation，the expression of osteoblast―specific markers tilineage differentiation;osteogenesis;nitric oxide;cell proliferation weremeasured(Results RaloxifeBe 0(01，0(1，1 ixmol??L increased NO productionandenhanced