膀胱逼尿肌细胞的培养及鉴定

膀胱逼尿肌细胞的培养及鉴定 膀胱逼尿肌细胞的培养及鉴定 西北国防医学杂志(MedJNDFNC)2006Feb.;27(1)5 膀胱逼尿肌细胞的培养及鉴定 周逢海,王养民,宋波,金锡御,乔够梅,董永超,常德辉 (1.兰州军区兰州总医院泌尿外科,甘肃兰州730050;2.第三军医大学西南医院泌尿外科) ? 论着? 培养,扩增的常规方法.方法:采用胶原酶消摘要:目的:建立膀胱逼尿肌细胞的分离, 化法分离大鼠膀胱逼尿肌细胞,在含 15%胎牛血清DMEM中培养,观察细胞形态及扩增情况,用特异性抗—SM—Actin 结果: 抗体进行免疫组化鉴定细胞类型. 膀胱逼尿肌细胞生长照好,培养12h后细胞开始贴附瓶底,3—4d后可观察到细胞融合现象,7d可覆盖培养瓶底部75%一 80%以上.—Actin免疫组化染色鉴定,光镜下观察梭形细胞胞浆内见纵行排列的棕黄色丝状物.结论:该培养方法简单, 可靠,短期内可获得大量较纯的膀胱逼尿肌细胞. 关键词:膀胱逼尿肌;细胞培养;细胞鉴定 中图分类号:Q813.11文献标识码:A文章编号:1007—8622(2006)O1—0005一O3 CllltIlreandidentificationofbladderdetrusorcells ZHOUFeng—hai,WANGYang—rain,SONGBo,eta1.(DepartmentofUrology,LanzhouGeneralHospital, LanzhouCommand,PLA,730050,China) Abstract:Objective:T0establishamethodofisolating,culturing,proliferatingbladderdetru sorcells.Methods: Pfima~detrusorcellculturesweresetupinthree—montIlWismrrats.Thefreshbladdertissueswereexcised understerileconditionandrinsedwithsterilesaline.Afterremovs~[oftheserosaandmucosa, smalltissuefragments weredigestedwitIlcollagenase1Vat4? forl2h.ThecellswereculturedinDMEMsupplementedwith15%fetal bovineserumat37? and5%CO.MorphologyandexpansionoftIlecellswereobserved.SmootIlmuscleeel (SMC)specificprotein(q— actin)wasidentifiedbyimmunohistochemicalmethods.Results:Thecellsgrewwell andpresentedatypicalmorphologicalfeatureofSMC.Immunohistochemiealstainingshowedthat—actinwas positive,Conclusion:Thisculturalmethodforbladderdetrusorcellswassimple.reliableandf ruitfu1. Keywords:Bladderdetrusor;Cellcuhurc;Cellidentification 1材料与方法 1.1实验对象:健康Wistar大鼠23只,雌性,3月 龄,体重180—210g,购自第三军医大学动物中心. 1.2主要试荆,试剂盒:DMEM—Hyclone公司;胎 牛血清一华美生物公司;DMSO—Sigma公司; 台盼蓝一华美生物工程公司;胰酶一华美生物工程 公司;IV型胶原酶一美国Sigma公司;HEPES一美 国Sigma公司;特异性抗q—SM—Actin抗体(工作 浓度为1:400,购自sigma公司). 1.3主要溶液配制:DMEM细胞培养液:DMEM粉 l3.4g溶于900ml去离子水中,加入碳酸氢钠3.0 基金项目:国家自然科学基金资助项目(3027l304) 收稿日期:2005—1l—l3 作者简介:周逢海(1964一),男,医学博士.副主任医师,Tel:0931— 8975267.Email:zhoufengh@163.corn g,谷氨酰胺0.5g,HEPES1.5g,加入青霉素,链霉 素使其终浓度为100U/ml,补足容积l000ml,抽滤 除菌,分装成100ml/瓶,使用时每瓶加入20Illl胎 牛血清.0.1%胶原酶液:将100mgIV型胶原酶溶 于100ml无血清DMEM细胞培养液中,抽滤除菌, 分装成10ml/瓶,一20cc保存. 1.4方法 1.4.1原代大鼠膀胱逼尿肌细胞的分离:颈断法 处死大鼠,在无菌条件下切取新鲜膀胱组织标本,置 于无Ca?的HEPES溶液中,用眼科剪镊剔除膀胱 逼尿肌黏膜及浆膜层,室温下.无菌操作台上在无 Ca?的HEPES溶液中将膀胱切成0.5mmx0.5 mmx0.5mm小块,漂洗后,置于胶原酶?消化溶液 中4?过夜,次日晨36?温浴15—30rain,去除上清 液,用于细胞培养…. 6西北国防医学杂志(MedJNDFNC)2006Feb.;27(1) 1.4.2原代大鼠膀胱逼尿肌细胞的培养:将消化好 的絮状肌条液转移至消毒离心管中,110—250g离 心1min,去除上清液,重复3次,去除残余的酶及可 能污染的细菌.轻轻吹打分散组织细胞片,转入35 mm培养瓶中.瓶内加入适量DMEM培养液,于 37?,5%CO,下培养;4d后更换培养基,然后每3d 更换一次.1周后待细胞融合后消化传代. 1.5培养膀胱逼尿肌细胞的鉴定 1.5.1细胞形态学鉴定:?根据平滑肌细胞的形态 特点,相差显微镜常规观察细胞生长形态及生长规 律;?获取逼尿肌细胞后,用DMEM培养基制成单 细胞悬液,稀释成1X10细胞/ml,取9滴细胞悬液 移人小试管中,加l滴0.4%台盼蓝溶液,混匀.在 3rain内用血球计数板分别计数活细胞和死细胞. 实验重复2次,超过85%的用于实验. 活细胞率(%)=(活细胞数/活细胞数+死细 胞数)Xl0o% 1.5.2免疫组织化学鉴定:用特异性抗Ot—SM— Actin抗体(工作浓度为1:400,购自sigma公司)进 行免疫组织化学鉴定.主要步骤如下:6孔培养板 孔中放人盖玻片,传代细胞接种于其上,当细胞爬片 生长至80%一90%融合时,按试剂盒使用进行 免疫组化染色. 2结果 2.1原代培养逼尿肌细胞生长形态:培养细胞置于 倒置显微镜下观察,培养12h后细胞已开始贴附在 瓶底,呈条梭状或短棒状,3—4d后可观察到肌细 胞融合现象,大约7d时间可覆盖培养瓶底部75% 一 80%以上.此时可以进行细胞传代,传代后8— 10h细胞开始贴壁生长.当细胞较少时,大部分细 胞呈不规则形状,有较多树枝状突起;当细胞密集 时,细胞呈梭形或长条形(图1). 图1培养的膀胱逼尿肌细胞.x100 2.2培养膀胱逼尿肌细胞免疫组化鉴定:0【一Actin 免疫组化染色鉴定,显色后光镜下观察梭形细胞胞 浆内见纵行排列的棕黄色丝状物(图2,见封3). 3讨论 膀胱逼尿肌细胞的原代培养有酶消化法和组织 块贴壁培养法两种.酶消化主要有胰蛋白酶法和胶 原酶法两种.胰蛋白酶是目前应用最多的消化试 剂.适用于消化细胞间质较少的软组织,对细胞及间 质均有破坏作用,而胶原酶对胶原的消化作用很强. 它仅对细胞间质有消化作用,可使细胞成分分离出 来而不受损害,原代培养出细胞效率较高,方便于实 验需要….因而胶原酶被广泛应用于胃肠道平滑 肌,心肌,血管平滑肌等细胞的新鲜分离以及原代培 养中J.Sui等研究认为膀胱逼尿肌细胞经培 养,传代仍基本保持了原有电生理特性,体外培养的 逼尿肌细胞可较好地反映体内情况. 本实验采用胶原酶消化法成功分离培养大鼠逼 尿肌细胞,胶原酶的剂量为O.1mg/ml,约8h即可 使膀胱组织充分消化,免疫组化方法显示梭形细胞 胞浆内布满了纵行排列的棕黄色丝状物,没有发现 有阴性细胞,证实培养细胞为纯的大鼠膀胱逼尿肌 细胞'.至培养l2h左右见细胞开始贴壁并伸 展,与培养细胞传代的规律相似,显示出细胞具有良 好的活力.另外,逼尿肌细胞是一种平滑肌细胞,影 响膀胱逼尿肌细胞培养成功的因素很多,总结我们 的经验,以下几点是关键:?取材方法:取材时应平 双侧输尿管进入膀胱壁处将膀胱横断,以避免同时 取到膀胱底部较多的血管,外膜等组织,于解剖显微 镜镜下将外膜和黏膜仔细剔除,尽量仅剩下肌层组 织;?细胞接种量:接种量一般为20X10细胞/ml, 接种密度以3X10/cm最为适宜,如细胞接种过 少,细胞生长难于铺满瓶壁,直接影响细胞传代;? 掌握好组织快的消化程度也是成功的关键,应选择 针对膀胱逼尿肌的?型胶原酶,组织块应尽量剪碎 以利消化,严格控制胶原酶浓度和消化时间,见消化 液混浊,组织块呈絮状,或在显微镜下见消化液有较 多单个细胞或细胞小团块时应终止消化,传代培养 时也应掌握好消化时间,即当均匀,透亮,没有间隙 的薄层变成不透亮,并有间隙出现时,终止消化;? 由于逼尿肌细胞属于平滑肌细胞,贴壁能力相对弱 于其他类型的细胞,因此在培养开始的3d以内,应 当绝对静止,避免振动和移动,以免细胞漂浮死亡; ?原代膀胱逼尿肌培养中,胎牛血清较小牛血清效 果好,可能是因为胎牛血清中所含的生长因子和有 西北国防医学杂志(MedJNDFNC)2006Feb.;27(I)7 丝分裂原等更有利于原代细胞的增殖,分化.且以 15%胎牛血清为佳. 平滑肌细胞的鉴定主要依靠细胞形态及0【一 Actin检测?,抗平滑肌d—actin抗体免疫组化染 色是证实平滑肌细胞的可靠方法J,Ot—Actin在泌 尿系组织中仅表达于平滑肌细胞,而成纤维细胞,移 行上皮细胞均无表达.本实验中,培养的膀胱逼尿 肌细胞形态典型,分离细胞抗d—actin抗体免疫组 化染色,可见细胞分布有大量的平行或斜行交叉棕 黄色肌丝,表明分离获得的细胞主要为膀胱逼尿肌 细胞.因此,该培养方法可为研究分析膀胱逼尿肌 细胞离子通道及电生理特性提供细胞保障. 参考文献: [I]司徒镇强,吴军正.细胞培养[M].北京:世界图书出版 公司.2001.63—38. 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