定点突变技术在转氨酶改造中的应用_cropped

定点突变技术在转氨酶改造中的应用_cropped ()第 17 卷 第 4 期 Vol . 17 No . 4 盐城工学院学报 自然科学版 2004 年 12 月 ()Journal of Yancheng Institute of TechnologyNatural Science Dec . 2004 Ξ 定点突变技术在转氨酶改造中的应用 1 ,2 1 1 许 伟,李艳,严明 ()1. 南京工业大学 制药与生命科学学院 ,江苏 南京 210009 ;2. 盐城工学院 化学工程系 ,江苏 盐城 224003 摘 要 :对定点突变技术进行简要介绍 ,并对此技术在改造转氨酶的活性 、稳定性及底物特异 性等方面的最新进展进行了综述 。同时 ,也对定点突变技术的发展趋势进行了展望 。以期能 为该领域的研究人员提供有价值的参考 。 关键词 :定点突变 ; 转氨酶 ; 改造 中图分类号 :Q81文献标识码 :A() 文章编号 :1671 - 5322 200404 - 0055 - 04 转氨酶催化氨基酸与 2 - 酮酸之间的氨基转 目前常用的定点突变主要有寡核苷酸引 PCR 介导的定点突变及盒式 物介导的定点突变 、移反应 ,对包括从细菌到哺乳动物的生物体的氨 突变 。根据突变残基在酶结构中所处的位置 ,定 基酸代谢起着关键作用 。在工业上 ,转氨酶在氨 点突变又可分为活性位点残基突变和非活性位点 基酸的生物合成中具有巨大的应用潜力 。同其他 残基突变 。定点突变靶目标的选择的依据主要是 2 天然生物催化剂一样 ,转氨酶在实际应用时尚存 酶序列的同源性以及其高级 结 构 的 特 点。因 此 ,在空间结构信息指导下进行定点突变 ,往往会 在诸多限制 。转氨酶的实际应用活性 、稳定性及 取得事半功倍的效果 。 底物专一性是其实现工业化的关键 。蛋白质工程 技术为和研究新型的生物催化剂提供了一个 ( 有效的技术平台 。定点突变 site - directed muta2 2 转氨酶的结构与作用机理 ) genesis是 蛋 白 质 工 程 中 采 用 的 重 要 技 术 之 一 。 在转氨酶研究中采用定点突变技术 ,不仅推动了 ( 转氨 酶 以 磷 酸 吡 哆 醛 Pyridoxal Phosphate , 转氨酶的结构和功能 、作用机制的阐明 ,也为改造 ) ( ) PLP或磷酸吡哆胺 Pyridoxamine Phosphate , PMP转氨酶在工业应用中的实际性能提供了强有力的 作为辅酶 。其催化机理可以用乒乓机理来描述 : 工具 。 αα2 氨基酸+ E P?L P 2 酮酸+ E P?MP 1 1 1 定点突变技术αα + E P?MP 2 氨基酸+ E P?L P 2 酮酸2 2 E 表示转氨酶的活性位点 ; PMP 是 PL P 转氨后的形式 酶工程的研究已经发展到分子水平 ,通过基 因操作 ,已实现了许多酶的克隆和表达 。定点突 活性中心的赖氨酸残基以 Schiff 碱的形式共价结 变已经成为研究酶结构与功能的常规手段 ,并被 合到辅酶上 。辅酶作为氨基的载体 ,通过辅酶在广泛用于改善酶的性能 。定点突变技术可以有目 PLP 与 PMP 两种形式之间的转变来完成氨基的 的地在已知 DNA 序列中取代 、插入或删除特定的 核苷酸 。由于突变的定向性 、取代残基的可选择 转移 。通过对转氨酶的多序列比对 ,在共同的结 () 性 、对高级结构的无 少干扰性 、检验手段的可靠 构相关性基础上 ,这类酶又可分为四个家族 。家性 ,与其他技术相比 ,定点突变技术显得准确而有 族 ?包括天冬氨酸 、丙氨酸 、酪氨酸 、组氨酸磷酸 酯及苯丙氨酸转氨酶 ;家族 ?包括乙酰鸟氨酸 、鸟 1 ω 。 效氨酸 、- 氨基酸 、4 - 氨基丁酸和二氨基壬酸转 Ξ 收稿日期 :2004 - 05 - 21 () 作者简介 :许 伟 1976 - ,女 ,山东德州人 ,盐城工学院助教 ,南京工业大学硕士研究生 ,主要研究方向为酶工 程 。 氨酶 ;家族 ?包括 D - 丙氨酸和支链氨基酸转氨 450 和 15 倍 。Gloss 等对 AspATs 值却分别降低了 酶 ;家族 ?包括丝氨酸和磷酰丝氨酸转氨酶 。其 活性中心以外的 C191 分别进行了 C191F ,C191 Y , ( 中 ,家 族 ?的 天 冬 氨 酸 转 氨 酶 Aspartate Amino2 C191W 和 C191S 突变 ,这些突变导致了在 PLP 辅 ) transferas ,AspAT是目前研 究 得 最 深 入 的 一 类 有 酶和 Lys258 之间形成的内部醛亚胺 p Ka 值向碱 代表性的转氨酶 。 性移动了 0 . 6 - 0 . 8p H 单位 。在生理 p H 条件下 , 3 1986 年 ,Smith等通过 X 射线衍射的方法得 C191S 与野生型酶对底物 Asp 的 kcat/ Km 值很接 到 E. col 中的 AspAT 的三维结构 。这是一个同型 近 ,而对于 C191F ,C191 Y ,和 C191W 来说 ,此值比 二聚体酶 ,每个亚基由大小两个结构域组成 。活 野生型低了 2 . 2 - 4 倍 。 7 性中心位于亚基的界面上 。活性中心的残基在不 Hayashi H 等对 E. coli AspAT 的 V39F 突变 同的同功酶中具有高度的保守性 。每个亚基上都 酶在结构上和动力学上进行了分析 。Val39 位于 有与底 物 和 辅 酶 的 结 合 位 点 。Arg386 和 Arg292 两个结构域的界面上 ,并且处于活性中心入口处 。 被认为是 E. coli AspAT 活性中心中直接参与二羧 用较大的残基 Phe 代替 Val 以后 ,发现同野生型 基底物识别的主要残基 。Kamitori 和 Smith 对 E. 酶相比 V39F 突变酶显示出更“开放”的构象 , 并 coli AspAT 的 x - 射线晶体学 rx 究进一步表明 E. 且醛 亚 胺 的 p Ka 下 降 了 0 . 7 个 单 位 。然 而 , 当 coli 的 AspAT 活性中心的残基与动物的 AspAT 的 Asn194 先突变为 Ala 后 ,V39F 突变没有降低醛亚 几乎完全相同 。Asp222 是多 种 来 源 的 AspAT 的 胺 p Ka 值 , 表 明 结 构 域 旋 转 时 , 通 过 Arg386 - 所有 已 知 序 列 的 不 变 残 基 , 在 空 间 上 处 与 辅 酶 Asn194 - PLP 连接体系控制了醛亚胺 p Ka 值 。 () PLP 或 PMP 的 N 1形成强离子相互作用的位置 。 3 . 2 定点突变用于改造酶的热稳定性 () Asp222 侧链的负电荷能够稳定辅酶 N 1的正电 通过定点突变获得的突变酶的稳定性一般提 4 荷 ,增强了辅酶的得电子能力。此外 ,实验证明 高不大 , 因为酶的稳定性与活性是密切相关的 。 酶稳定性与温度和其他的变性条件之间的普遍相 在 E. coli 的 AspAT 中不存在二硫键 。 关性指出 :蛋白质变性的共同起始因子或途径是 3 定点突变在转氨酶改造中的应用 由高温 、极端 p H 、有机溶剂或去污剂的存在诱导 定点突变对酶的改造是在已知酶的结构与功 而产生的 。基于这些理论 ,有利于指导我们如何 能的基础上 ,有目的地改变酶的某一活性基团或 选择稳定性的突变体 。 8 模块 , 从而产生新性状的酶 , 故又称理性分子设 J effery 等将 E. coli 中的 5 个 Cys 残基突变 5 计。自从得到 E. coli AspAT 的晶体结构以来 , 为 Ala ,结果发现突变体对于底物 Asp 其 Km 提高 越来越多的研究人员通过突变残基对其三维结构 了 1 . 5 倍 , 但 Kcat 却降低了 50 %左右 。特别是 , 的影响来探索酶与辅酶 ,以及底物与酶的作用机 与野生型相比 ,其热稳定性有所降低 ,最适温度降 理 。并且 ,在不断阐明其结构与功能关系的基础 低了 4 ?左右 。 上 ,用已知的理论来指导对酶的合理设计 。到目 3 . 3 定点突变用于改造酶的底物特异性前为止 ,PDB 数据库中转氨酶晶体结构的数目已 许多研究结果表明 ,定点突变在改变转氨酶 ( ) 经达到 176 ,其中 AspATEC 2 . 6 . 1 . 1的晶体结构 的底物特异性方面取得了很好的效果 。天冬氨酸 就有 83 个 ,这些数据也为 AspAT 的定点突变提供 转氨酶所催化的转氨反应的最适底物为二羧基氨 了充分的理论依据 。 基酸 L - Asp 和 L - Glu 。定 点 突 变 能 将 E. coli AATase 的底物特异性由带负电的 L - 天冬氨酸和 3 . 1 定点突变对转氨反应中辅酶 p Ka 的影响 在转氨酶催化的转氨反应中 ,辅酶起到了氨 L - 谷氨酸转换为带正电的 L - 赖氨酸和 L - 精氨 9 基载体的重要作用 ,并与活性中心的 Lys258 以醛 酸 。Ciaran 等用 Asp 取代 Arg292 构建的 R292D 亚胺的形式结合 。因此 ,醛亚胺的 p Ka 的变化对 突变体 ,对精氨酸和赖氨酸的 kcat/ Km 值分别增 酶的活性也起到了很大的影响 。 加为野生型的 16 倍和 9 倍 ,而使对天冬氨酸转氨 反应 的 速 率 下 降 超 过 5 个 数 量 级 。J ames J . Jonathan M. 对 E. coli 的 AspAT 进行 Y225F 突 10 变 ,结 果 p Ka 值 从 7 . 1 提 高 到 8 . 4 。而 Antoni Onuffer 等通 过 将 AspATs 的 Val39 、Lys41 、 6 Planas 等对 E. coli AspATs 的进行 K258C 突变 , Thr47 、Asn69 、Thr109 和 Asn297 突 变 为 TyrATs 所 p Ka 值从 7 . 3 降低到 6 . 0 。尽管如此 ,两者的 Kcat 对应的 Leu 、Tyr 、Ile 、Leu 、Ser 和 Ser ,增加活性位点 第 3 期 许 伟等 :定点突变技术在转氨酶改造中的应用 ?57 ? 口袋的疏水性 ,突变酶对 Phe 的活性增加了 3 个 中心的 Arg 残基可通过调整位置与带电荷底物进 数量级 ,而对 Asp 的活性未受到影响 。Wendy A. 行静电相互作用 ,或者让芳香类配体进入活性中 心 。 Shaffer 则反其道而行 ,通过将 TyrATs 中的上述位 点的残基突变为 AspATs 中对应的残基 ,使得突变 4 展望 酶增加了对 Asp 的活性 。J ansonius 等通过对 As2 pAT 的 Y225R/ R386A 共同突变 ,发现突变酶的辅 定点突变技术可以有效地用于对转氨酶进行 酶 - 底物复合物的电子分布发生了变化 。使它对 改造 。它不仅加深人们对转氨酶的机理及结构与 酸性氨基酸的转氨活性下降了 3 个数量级 。对突 功能关系的认识 ,而且也为进一步研究该酶的稳 变酶晶体结构的分子动力学模拟表明 ,有一个新 定性及底物特异性等方面提供支持 。然而 ,并非 的氢结合到 PLP - 底物复合物的亚胺 N 原子上 , 所有的定点突变都能取得预期的结果 。究其原 ββ并且改变了底物- 羧基周围的静电势 ,使得- 因 ,可能是对酶的结构 、功能和作用机制不完全了 脱羧基酶活/ 转氨酶活的比例增加了 105 个数量 解 ,仅仅把氨基酸序列的同源性作为氨基酸残基 级 。 取代的 ,往往导致保守氨基酸刚性取代 ,因而 得不到所希望的酶 ; 或者使被改造的转氨酶抗突 3 . 4 定点突变用于改造酶的催化活性 突变转氨酶的某些非活性位点残基会对其活 变能力较差 。由于残基的取代伴随着酶构象的改 性位点产生间接效应 ,有利于与底物结合 ,从而提 变 ,故致使酶失活 。 11 因此 ,定点突变技术对转氨酶的进一步改造 高酶 的 催 化 活 性。J effery CJ 等 测 定 了 E. coli AspAT 五种突变酶的晶体结构 ,发现突变酶的侧 还要依赖于各种转氨酶结构数据的完善及其空间 α β 链绕 C- C有一定的旋转 ,导致氢与突变残基 结构预测与结构和功能关系的深入研究 。目前 , 以及辅酶质子化的 Schiff 碱连接模式发生变化 。 在已有的结构与功能相互关系的信息仍较有限的 这说明活性中心以外的残基对活性中心残基的空 情况下 ,将体外分子定向进化与定点突变相结合 间结构以及相互作用有非常重要的影响 。 Eleonore Kohler 等 通 过 将 E. coli AspATs 中 来改造转氨酶是一种较理想的方法 。定点突变需 Val39 突变为 TyrATs 中对应位点 Leu ,结果发现突 要了解酶蛋白的一级结构及编码序列 ,并根据蛋 变酶 对 Tyr 、Asp 和 Glu 的 催 化 活 性 显 著 提 高 。 白质空间结构特点来设计突变位点 。而体外定向 12 Shinya Oue 等突变了 AATase 非活性位点的 17 进化可以在尚不知道蛋白质的空间结构 ,或者根 个残基 ,该突变酶对非天然底物 Val 的催化效率 据现有的结构知识尚不能进行有效的定点突变 6 ( ) kcat/ Km 提 高 了 2 . 1 ×10倍 。Malashkevich时 ,借鉴实验室手段在体外模拟自然进化的过程 () 随机突变 、重组和选择,使基因发生大量变异 , 13 突变 E. coli AspAT 的 6 个残基 ,大大提高了 并定向选择出所需性质或功能 ,使几百万年的自 等 突变酶对 Tyr 的转氨活性 , 但仍具有对 Asp 的转 然进化过程在短期内得以实现 。将定点突变和随 氨活性 。X 射线成像分析了突变酶和抑制剂的复 机突变结合起来 ,可以用定位限制随机 ,以减少筛 合物 ,并揭示出底物选择性的结构基础 。酪氨酸 选的库容 ;也可以用随机扩大定位以增加突变位 点 ,从而实现两种方法的优势互补 。 转氨酶可能通过一种特殊的构象开关 ,对一个较 宽范围内的氨基酸都有基本相同的亲和性 。活性 参考文献 : 1 张今. 分子酶学工程导论 M . 北京 :科学出版社 ,2003. 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Department of Chemical Engineering , Yancheng Institute of Technology ,Jiagsu Yancheng 224003 ; Chian Abstract :This paper briefly introduces site - mutagenesis technology and the applications of this technology in enhancing the activity , comprehensively reviews changing the specificity and altering the stability of aminotransferase and discusses the trends in site - directed mutagenesis technology , which provides valuable information to the researchers in this field. Key words :site - directed mutagenesis aminotransferase 来 稿 须 知 一 、向本刊所投之稿 ,必须为原创之作 。凡涉及抄袭、剽窃 的 ,其违反著作权法等 一切后果由署名者自负 ,本刊有通报 、曝光及追究其违反法律法规和学术道德的权利。 二 、作者不得一稿多发 ,但可同意他刊转载 、转摘 ,转载 、转摘时当注明出处 。 () 三 、本刊已入编《中国学术期刊 光盘版》、“中国期刊网”和“万方数据 ———数字化 ( 期刊群”《、中国科技期刊数据库》,作者著作权使用费在本刊稿酬中一并给付 另有约 ) 定者除外。对此不同意者 ,请在来稿时说明。