染色体重组对大麦转基因gfp遗传表达的作用

染色体重组对大麦转基因gfp遗传表达的作用 扬州大学 硕士学位染色体重组对大麦转基因gfp遗传表达的作用 姓名:苏琰 申请学位级别:硕士 专业:细胞生物学 指导教师:陈建民 20090501 苏琰: 染色体重组对人麦转基因,,,遗传表达的作用 染色体重组对大麦转基因咖遗传表达的作用 硕士生:苏琰 导师:陈建民教授 (扬州大学生物科学与技术学院，江苏扬’)’，’,,,,,,,) 捅要 转基因技术为植物分子生物学基础研究和作物遗传改良等提供了新途径，已成为植物生物技术的核心工具之一。然而利用转基因技术在实验室中获得的新种质材料不一定都能够直接用于大规模的生产种植，因为外源基因在宿主内能否稳定遗传和表达是影响转基因植物应用前景的重要因素之一。 本试验利用已获得的,种转绿色荧光蛋白基因(加)大麦:荧光表达量分别由高表达到不表达的,株系、,株系、,株系、,株系、,株系(转基因沉默株系)，以及非转基因系 (，,,,)为材料，对不同转基因植株间以及转基因与非转基因植株进行常规有性杂交，分别对不同世代杂交植株的花粉、叶片、根中转基因咖的表达量进行测定分析，得出以下结论:,(通过对根尖、叶片、花粉的分别测量发现，,,,基因在表达量上存在组织差异。,(通过对不同世代杂交植株进行荧光测量发现，施基因在杂交后代中以一个显性基因稳定传递，转基因可通过常规的有性杂交进行传递。,(通过测交和自交等试验发现，咖基因在杂交后代中表达时存在明显的剂量效应。 为了探讨,株系的沉默机制，本实验以大麦,;,,,基因作为内参，通过扩增大麦,;,,,基因并对其进行定量，达到保证扩增,,,基因的量一致的目的，这样在,,,条件、模板量均一致且同批次反应的条件下，扩增各株系的妨基因，通过凝胶电泳检测各株系的加基因的转录水平。半定量,,,,,,结果显示，转咖基因,系大麦以及未转基因大麦均未扩增出咖条带，而,、,、,、,均扩增出妨条带，且,系扩增条带较其他的株系扩增条带亮，这与荧光检测结果相吻合，同时证实了,株系的咖基因沉默是由于其?基因在转录水平上失活引起的。关键词:大麦;绿色荧光蛋白基因;半定量逆转录多聚酶链式反应 扬州大学硕士学位 ,,, ,,,;,,,, ,, ;,,,,,,,,, ,,;,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,; ,,,,,,,,,, ,, ,,,,, ,,,,,,,;,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,; ,,,,,,(,,,,,,,, ,,,,,,, ,() ,,,,,,,,,,,,:,,, ,, ,,,,,,,:,,,,(,,,,,,, ,,,, (,,,,,,, ,, ,,,,;,,,;, ,,, ,,,,,;,,,,,,,，,,,,,,,, ,,,,,,,,,,， ,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,) ,,,,,,;, ,,,,,,,,,; ,,;,,,,,,, ,,, ,,,,; ,,,,,,;, ,, ,,,,, ,,,,;,,,, ,,,,,,, ,,, ,,,,,,;,,,,,,,,,,, ,, ;,,,, ,,, ,,;,,, ,,, ,, ,,, ;,,, ,,,,, ,, ,,,,, ,,,,,;,,,,,,, , ,,,,, ,;,,,;,(,,,,,,,，,,, ,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,; ,,;,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,, ,, ,,,, ,, ,,, ,,,,,;,,,,,,, ,,, ,,,,,—,;,,, ;,,,,,,,,,, ,,,,;,,,，,,;,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,, ,, ,,, ,,,, , ,, ,,,,,,, ,,, ,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,, ,,, ,, ,,, ,,,,,,,,, ,,;,,, ,,,,,,,;,,,,, ,, ,,,,,,,,,; ,,,,,, ,, ,,, ,,,,,;,,,,, ,, ,,, ,, ,,, ,,,,,,,,, ,,;,,,( ,,,, ,,,,,,,,,; ,,,,,, ,,,,,(,、,、,、,、,),,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,,咖,,, , ,,,,,,,,,,,,,; ,,,,,,(，,,,),,,, ,,,, ,, ;,,,, ,,,, ,,;, ,,,,, ,, ,,,, ,,,,,(,,,, ,,,,,,,,,, ,,,舴,,,, ,,,,,,,,,, ,, ,,,,，,,,, ,,,, ,,, ,,,,,, ,, ,,,,, ,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,;,,,,,, ,,,,,(,,, 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,,,,,,,,, ,,,, ,,,, , ,,, ,,,—,,,,,,,,,; ,,,,,, ,,,,( 苏琰: 染色体重组对大麦转基冈,,,遗传表达的作用,,,,,,,，,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,, ,, ,，,，,，, ,,,,, ,,,, ,,,,,,,(,,, ,,,,, ,,,, ,,,,, ,, ,,,, ,,,,, ,,,,,,, ,,,, ,,,, ,, ,,,,, ,,,,,,,,,; ,,,,,(,,,, ,,,,,, ;,,,;,,,, ,,,, ,,, ,,,,,,, ,, ,,,,;,,,,,,,,,,,;,,;, ,, ,,, ,,,,,,,,,; ,,,,,(，, ,,,, ;,,,,,,, ,,,, ,,, ,,,,,;, ,,加,,,, ,, ,,,, , ,, ,,,,, ,,,;,,,,,,,, ,, ,,,咖,,,, ,, ,,,,,;,,,,,,, ,,,,,(,,, ,,,,,:,,,,,,;,,,,, ,,,,,,,;,,, ,,,,,,,;,,,, ？,,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,;,,,,,,, ,,,,,,,—,,,,,, ;,,,, ,,,;,,,, 扬州大学硕士学位符号及缩略说明 扬州大学硕士学位论文 扬州大学学位论文原创性声明和版权使用授权 学位论文原创性声明 本人声明:所呈交的学位论文是在导师指导下独立进行研究工作所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名:荔次 签字日期(砷年厶,々日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即:学校有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅。本人授权扬州大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。 导师签名: 脖数 签字魄唧年参月矽日 (本页为学位论文末页。如论文为密件可不授权，但论文原创必须声明。) 苏琰: 染色体重组对大麦转基因,,,遗传表达的作用 第一章文献综述,植物转基因的遗传表达,(,植物转基因技术 ,,,,年首次利用农杆菌,,质粒将外源基因导入烟草获得转基因烟草(,,,,,,, ,, ,,(，,,,,)。从此转基因技术为植物分子生物学基础研究和作物的遗传改良等提供新途径，已成为植物生物技术的核心工具之一。与传统育种手段相比，转基因技术具有的优点:缩短育种年限，加快育种进程，打破种间基因交流的界限，广泛利用植物、微生物、甚至动物的基因来使植物获得抗病性、抗虫性、抗逆性、提高产量、改善品质等(王关林，,,,,)。,,,,”,,’,,,,年间已有,,个国家在,,多种作物上进行了近,,,,,例转基因植物的田间试验。中国于,,,,年设立了植物转基因及应用专项基金。到,,,,年底，全球已有,,种作物的,,种转基因作物产品获准进行商品化生产，预计全球范围内转基因产品的市场销售额将由,,,,年的不足,亿美元增加到,,,,年的,,,,,亿美元，,,,,年将增加到,,,亿美元(,,,,,(，,,,,)。 目前发展较为成熟的转基因技术有农杆菌介导法、基因枪法、电击法、激光法、,,,法、微注射法、花粉管通道法等。 电击法(,,,;, ,,,,,,,,,,)主要原理是通过高压脉冲使细胞膜上出现瞬时可逆性开放小孔，借此导入,,,等遗传物质，达到转化的目的。激光法是利用聚焦后直径达,(,”,’,(,微米时的一定波长的激光束引起细胞膜的可逆性穿孔，借此将外源,,,导入到细胞中。傅荣昭成功利用该技术转化小麦(,,,,)。激光法和电击法的优点是转化受体材料广泛。但这种 效率低，使用范围小。,,,法是一种通过化学物质,,,(聚乙二醇)处理去壁的原生质体作为转化受体，改变细胞膜的通透性而使原生质体获得转化。,,,法的优点是成本低廉、结果较稳定、重复性好、无需特殊的仪器设备。缺点是原生质体培养再生难度较大;受基因型限制;易产生白化苗;转化率低等。显微注射法(,,;,,,,,,;,,,,)是用显微注射器将遗传物质注射到培养细胞中，通过组织培养最终获得转化植株。具有,,,注射的准确性、预见性、克服远缘杂交的困难等优点，但缺点是工作效率低、表达不稳定等。自基因枪法诞生以来，这种转化方法在植物上的应用就比较少了(王关林，,,,,)。花粉管通道法(,,,,,,(,,,,,,,,,,,),,称子房注射法(,,,,, ,,,,;,,,,)，是将外源,,,注入到子房中轴的胎座位置，经形成的花粉管胚囊，转化受精卵或胚细胞。 基因枪法和农杆菌介导法是目前最为有效且应用最广泛的两种方法。 扬州大学硕士学位论文 , 一 基因枪法(,,,,,;,, ,,, ,,,,,,,,,,;,,;,,,,,,,;,,,, ,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,;,)是指借高速运动的金属粒将附着于其表面的核酸分子引入受体细胞，再通过组织培养再生出完整植株。这是,,,,年由美国康奈尔大学的,,,,,,,提出的一种直接基因导入法。基因枪法在单子叶禾本科植物中得到了较为广泛的应用。具有不用原生质体再生培养、受体材料来源广泛、不受基因型限制、缩短了获得转基因植株的周期、获得的转基因植株变异率低、通常具有正常的育性等优点(安韩冰等，,,,,)。但是基因枪法也存在诸如转化效率不高，外源基因序列常是多拷贝插入导致基因沉默，转入的基因有时是呈非孟德尔遗传，费用较高等缺点(傅荣昭等，,,,,)。 农杆菌介导的遗传转化(,,,,,,;,,,,,,(,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,)。农杆菌中存在一种环状的、大小约,,,”,’,,,,,的质粒(,,,,,,,,,,;,,, ,,,,,,,)，即,,质粒。,,质粒上的一段,,,通过特定的机制复制、切割、转移、整合到植物基因组中并表达，从而引起植物肿瘤，这段,,,称为,(,,,(,,,,,,,,,,, ,,,)，是一种天然存在的遗传转化体系。农杆菌介导的遗传转化就是利用这种遗传转化体系将外源基因导入植物细胞，并利用植物细胞的全能性，通过组织培养，由一个细胞或一块组织再生成完整的转基因植株(,,,, ,,,,(，,,,,)。农杆菌介导法应用广泛，,,,,年首次利用农杆菌,,质粒将外源基因导入烟草获得转基因烟草 (,,,,,,, ,, ,,(，,,,,)，,,,,年紫仍谒旧先〉昧酥匾黄埔岳矗ǎ龋椋澹槎幔保保梗梗矗谛?蟆?衩椎鹊プ右吨参锪甘匙魑镏邢嗉倘〉昧顺晒允玖死么朔ǜ牧贾饕?魑锲分值木薮笄绷Α,?司牟僮鞣椒ㄓ兄苯痈腥局参锷丝诜ā?杜谭ā?侍骞才嘌?俗橹才嘌?婵杖萜髦薪就暾仓辏ǎ蹋椋?,, ,,(，,,,,)等。农杆菌介导法与其它方法相比较具有许多优点:操作简便不需特殊仪器，培养周期短;技术最成熟，转化效率高;外源基因多以单拷贝插入，稳定性好;可以利用不同的启动子控制目的基因在特定的器官进行特异表达;较少出现基因沉默现象(,,,, ,, ,,(，,,,,);可将较大片段,,,完整地转移到植物基因组中等(,,,,,,,,(，,,,,)。不过由于,—,,,可以在植物染色体的任何区域内插入，就有可能导致有益基因的插入失活，因此外源基因插入问尚有待于基因转移技术的进一步完善。 据统计至今获得的转基因植株中,,,以上是农杆菌介导转化法获得的(傅荣昭等，,,,,)。,(,外源基因在转基因植物中的遗传特性,(,(,转基因的遗传表达规律 外源基因在受体植物内的整合、遗传和稳定性是非常复杂的，其遗传规律主要是由外源基因插入的拷贝数及其插入位置等决定的。外源基因在转基因植物中的遗传传递规律与 苏琰: 染色体重组对大麦转基因曲遗传表达的作用 曼外源,,,插入植物基因组位点有:单位点插入，同一染色体的多位点插入或不同染色体的多位点插入等几种情况;插入的拷贝数也有单拷贝与多拷贝之分。单位点插入外源基因的遗传一般遵循孟德尔单基因遗传分离规律，而多位点插入的外源基因的遗传规律则比较复杂，转基因的遗传表达表现不稳定性。外源基因的遗传规律有三种方式:单基因位点的孟德尔遗传方式、多基因位点的孟德尔遗传方式、非孟德尔的遗传方式(王念等，,,,,)。外源基因一般作为一个显性基因传递给后代，遵循孟德尔遗传分离规律，自交后代表现,:,分离规律。因此，可能在多拷贝转基因中，只有一个拷贝具有表达功能或者所有表达的拷贝整合在后代染色体基因组中的一个位点，但也有表现出两个不连锁的显性基因，在自交后代中表现出,,:,的分离规律。 (,)单位点孟德尔遗传:是指一条染色体上单位点插入外源基因(单拷贝或多拷贝串联)，且插入位置对植株生长、发育、繁殖不会产生较大影响，则外源基因以单位点的孟德尔方式遗传。 王忠华等(,,,,)对,,水稻“克螟稻”杂交后代进行转基因遗传分离规律分析，发现籼粳杂交,,出现抗性株与非抗性株的,:,分离，籼粳杂交的,,,出现,:,分离，表明转基因在杂交后代的传递属单基因显性遗传。张晓东等(,,,,)利用,,,基因作为选择基因，构建了含有高分子量麦谷蛋白亚基,,,,和,,,,,亚基基因的质粒,,,,,,，然后用基因枪导入到我国小麦品种的幼穗和幼胚中，获得了一系列稳定遗传的转基因小麦植株及其后代。,,,,等(,,,,)研究基因枪转化获得的转绿色荧光蛋白((咖)基因大麦时发现，株系,、,自交后代的荧光:未发荧光分离比为,:,，荧光原位杂交检测外源基因为单位点插入。这种遗传规律在很多转基因植物中都发现。 (,)多位点孟德尔遗传:多基因位点的孟德尔遗传是多条染色体的多位点独立插入，其后代分离比为自交(,:,),，测交为(,:,),(,为转基因数)。指在外源基因(多位点插入外源基因的每个位点既可以是单拷贝，也可以是多拷贝串联插入)，插入位置对植株生长、发育和繁殖不会产生较大影响的条件下，转基因植物多条染色体的多个位点独立插入，外源基因以多位点的孟德尔方式遗传。 ,,,,等(,,,,)研究基因枪转化获得的转绿色荧光蛋白基因?)大麦时发现:株系,自交后代的荧光:未发荧光分离比为,,:,，荧光原位杂交检测为两位点插入，且位于不同染色体上。,,,,,,,,(,,,,)使用施为标记基因，发现一个株系中,(,,,插入到两个位点的后代中荧光:未发荧光的植株比率为,,:,。夏兰芹等(,,,,)对转基因双价抗虫棉,,、,,、及,,代材料进行遗传分离分析，结果双价转基因抗虫棉,,，,,及,,材料均出现 扬州大学硕士学位论文 , 一了分别为约,,(,，,(,，,(,和,(,,,的,条阳性带，初步认为，外源历杀虫基因在双价抗虫棉,,材料基因组中至少有,个拷贝，这,个拷贝中很可能有一个以上能够稳定遗传和表达，该研究结果为以后的双价抗虫棉品种培育及商品化生产提供了依据。 (,)非孟德尔式遗传:在转基因植株后代的分离中，普遍存在显性个体明显低于孟德尔比例的现象，其原因 可能是某些显性个体携带的转基因丢失或不表达所致。另外随着世代的增加，植物转基因遗传的稳定性有升高的趋势。王守才等(,,,,)研究了转基因玉米在,代以后的遗传规律，发现转基因分离虽然在早代有偏离孟德尔比例的现象，但是到了,代以后，却趋于正常，并且在群体中稳定表达。造成非孟德尔遗传方式的原因有:转基因的重排或缺失、转基因导入诱发的隐性致死突变或转基因纯合致死、含转基因的雄配子致死等。,(,(,转基因的遗传表达特性 外源基因整合进受体植物的基因组后，其遗传表达特性与外源基因的整合情况、转化方法、外界环境条件以及植物的生长发育状况等有关。 不同的转化方法对外源基因的遗传表达特性也有影响。农杆菌介导的转基因得到单拷贝或低拷贝整合的外源，但受到宿主的限制，尤其是在许多重要的禾谷类作物中的应用 (,,,,,,,,,(，,,,,)。农杆菌转化的特点是:外源基因大多数是单位点整合且整合位点较稳定;整合的外源,,,基本保持其结构的完整性;整合外源基因的拷贝数常以单或低拷贝,(,,,为主，也有少量多拷贝,(,,,以首尾串联形式在单位点整合;整合的外源基因在转基因植株的显性表达率很高，即多数外源基因能有效表达，共抑制现象相对较少。因此农杆菌介导的遗传转化后代多呈简单的孟德尔遗传，遗传表达具有稳定性。 与农杆菌载体转化相比，基因枪法一般为随机整合，整合方式和整合位置以及整合的拷贝数往往不确定，它是以完整细胞、组织为受体，直接转化整合的外源基因重组率高，往往导致转基因复杂的多拷贝整合方式，引起基因丢失或基因沉默，在有性繁殖过程中转基因传递的遗传规律比较复杂，稳定性也相对较差(,,,,,,,, ,, ,,(，,,,,)。基因枪转化法的特点:外源基因的整合位点较多，可以在一条染色体上或不同染色体上进行位点整合;整合的外源基因,,,易发生结构变化和修饰，如,,,片断分离、丢失、环化、甲基化等;外源,,,的拷贝数也较多，多拷贝的比例相对较高。因此，基因枪转化产生的转基因植株后代遗传方式较复杂，整合外源基因的遗传特性多，转基因植株的表型丰富，与农杆菌转化相比，遗传表达表现不稳定性。 苏琰: 染色体重组对大麦转基因,,,遗传表达的作用 曼,(,传统杂交和转基因对植物遗传改良,(,(,转基因和传统育种技术之间的关系 在人类发展农业过程中，一直通过基因的交流和基因的重组而创造新的生物品种(林忠平等，,,,,)。转基因技术是通过导入外源基因实现物种的遗传改良。而传统作物改良方式主要是对自然突变产生的优良基因和重组体的选择和利用，通过随机和自然方式来积累优良基因;遗传学创立之后近百年的动植物育种则是采用人工杂交的方法，进行优良基因的重组而实现遗传改良(张启发，,,,,)。依靠传统的杂交育种技术，农业生产已经取得了巨大成就。然而，随着人口的不断增长，农业的发展又面临严峻的挑战。除此以外，农作物病虫害导致大量喷施农药，严重破坏了人类赖以生存的生态环境。转基因可以在较短时间定向培育具有抗逆性强、产量高、品质好、耐储藏等优点的作物品种，除此以外，转基因技术开发的抗病虫、抗除草剂作物大大减轻病虫及杂草对作物的危害，减少化学农药的使用，对生态环境保护长远利益来说意义重大。所以，转基因技术与传统育种技术既是一脉相承的又是相互补充的。两者相互结合可相得益彰，促进农业向着更快更好的方向发展。,(,(,利用传统杂交方法改良转基因植物 利用转基因技术在实验室中获得的新种质材料不一定都能够直接用于大规模的生产种植。由于转基因植物中的外源基因在同种植物材料间比较容易杂交转育。所以将传统的杂交育 种方法与转基因技术相结合，将有用的外源基因转入相应受体中或对转基因材料进行改良，不失为一种好方法。李燕娥等(,,,,)利用转基因抗虫棉纯系和常规普通棉花品种杂交，,,代均表现为抗性。,,,,,,等(,,,,)以转,,,基因的油菜和非转基因材料为试材，研究外源基因的转育，发现单拷贝插入的外源基因在非转基因材料中有,,,活性的表达，说明外源基因能够稳定遗传和转育。,植物转基因沉默机制 转基因沉默(,,,,,,,,, ,,,,,;,,,)是指导入并整合进受体基因组中的外源基因在转化体的当代或其后代中表达受到抑制的现象。转基因沉默的最早报道是在诱发冠瘿瘤的根癌农杆菌,(,,,转移中，多拷贝,(,,,引起了甲基化和基因沉默(,,,,,,,,, ,, ,,(，,,,,)产生基因沉默的原因既可能是转基因植株体内,,,(,,,、,,,(,,,、,,,(,,,的非正常相互作用而导致基因核营酸的甲基化作用和,,,,的降解，也可能是植物防御机制的一种自然现象。这一现象给转基因工作者提出了新的难题，它已经成为转基因技术的严重障碍。深入 扬州大学硕士学位论文 ,研究转基因沉默无论在理论上还是在实践上都具有重大意义。,(,转录水平基因沉默(,,,) 转录水平基因沉默是,,,(,,,之间的相互作用所产生，主要包括: (,)甲基化作用:人们在研究基因的表达调控时发现甲基化修饰是一个非常重要的调控因素，在基因表达、植物细胞分化以及系统发育中起着重要的调节作用。,,,甲基化一般是从启动子区域开始的，主要发生在基因,’端启动子区域(,,, ,, ,,(，,,,,)。但也有人发现外源基因的甲基化可延伸至,’端(,,, ,, ,,(，,,,,)。甲基化通常发生在,,,的,,和,,,序列的,碱基上(,,,,(，,,,,)。李旭刚等(,,,,)发现导入外源,,,,基因的植物发生基因失活现象，,,,,,,,杂交实验证实，基因失活的植物体内检测不到外源,,,,基因的转录产物，同时伴随着基因上游启动子区域的,,,甲基化。,,,甲基化引起的外源基因失活可以逆转，去甲基化试剂可以恢复外源基因的表达(,,, ,,,,(，,,,,)，有性杂交也可消除甲基化现象(,;,,,, ,, ,,(，,,,,)。甲基化发生的具体原因包括以下几种:一是外源基因与植物染色体组中的基因间的同源性造成基因沉默。主要是由于拥有同源序列的沉默位点和其他位点的,,,的相互作用而引起的转基因沉默。二是外源基因多拷贝插入，多拷贝重复转基因序列之间以及转基因与转录产物之间的配对，使,,,从头甲基化，从空间上阻碍了转录因子与转基因的接触，造成转录受抑，引起转录水平基因沉默。三是,,含量的差异，外源基因单拷贝整合到转录活性高的常染色质上，由于打乱了两侧序,,,,含量的一致性，可引起甲基化。四是，矾,引起甲基化，在转基因烟草中发现，特定的,,,诱导的甲基化造成了转录水平的转基因沉默。与靶,,,,〔),,,,,的,,,序列就可以引起,,,的甲基化，而,,,既可以是单链也可以是双链，这与小片段,,,可引起转录后水平的沉默是一致的这种说法越来越流行，然而还缺乏证据:以上述的杂链为识别位点的甲基化酶还有待发现(,,,,,,,,,,,(，,,,,)。 (,)位置效应.