不同产地熊胆粉中熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸的含量变化规律及其影响因素的研究(可编辑)

不同产地熊胆粉中熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸的含量变化规律及其影响因素的研究(可编辑) 不同产地熊胆粉中熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸的含量变 化规律及其影响因素的研究 黑龙江中医药大学 硕士学位论文 不同产地熊胆粉中熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸的含量变化规律及 其影响因素的研究 姓名:滕毅 申请学位级别:硕士 专业:生药学 指导教师:王喜军 20080501黑龙江中医药大学硕士学位论文 ~原创性声明 本人郑重声明:所呈交硕士学位论文,是本人在指导教师的指导下, 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文 不包含任何其他个人或集体已经发或撰写过的作品成果。对本文的研究 做出重要贡献的个人和集体,均己在文中以明确方式标明。本人完全意识 到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名: 日期: 关于论文使用授权的说明 本人同意学校有权保留并向国家有关部门送交学位论文的复印件,允 许论文被查阅和借阅。同意学校及国家有关机构有权公布论文的全部或部 分内容,并采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 本论文内容以任何形式公开发表或成果转让时须经导师同意。 论文作者签名: 指导老师签名: 圄 日期: 日期:黑龙江中医药大学硕士学位论文 中文摘要 本文对熊胆及引流熊胆的化学成分、药理作用、临床应用及我国野生 黑熊的资源状况、人工养熊产业的发展情况进行了综述。 对熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸的性质及其色谱行为进行了研究,改进了 色谱条件,从而解决了以往的研究中所体现出的胆汁酸类成分易解 离、紫外吸收弱而导致的色谱峰形不好、拖尾严重,致使对熊胆的成分及 含量分析不准确的难题。 通过对黑龙江黑宝养熊场、黑龙江野宝养熊场、辽宁延边森野养熊场、 四川都江堰动植物研究所养熊场以及云南大理瑞鹤药业养熊场等五个较 大规模养熊企业年内的引流熊胆样品中的熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸的含 量进行分析,探讨出了这些养熊场所产引流熊胆中的熊去氧胆酸和鹅去氧 胆酸含量的年变化规律。其中,四川都江堰动植物药研究所养熊场以及云 南大理瑞鹤药业养熊场所产熊胆粉中的两种成分含量较高,分别为.% ?.%、.%?.%和.%?.%、.%?.%,且全年保持稳 %?.%和 定;其它三家养熊场产品中两种成分含量较低,分别为. .%?.%、.%?.%和.%?.%、.%?.%和.% ?.%,而且全年波动较大,总体呈现夏秋季高、冬春季低的规律。调查 研究表明,这种变化与养熊场的气候环境、日粮配方、采胆方式、 胆汁加 工以及引流手术技术等因素有着密切关系。此研究对养熊企 业提高产 品的质量和产量,提高经济效益具有重要的指导意义。 关键词:熊胆粉 高效液相法 引流熊胆 熊去氧胆酸 鹅去氧胆酸黑龙江中医药大学硕士学位论文’ , , , , / , . , , , ’. , .%?.% .% .%?.% .%,.%?.% ‘.%?.% , .%?.% .%? .%?.% .%?.% ,.%?.% 。% , ,,, ; , , ,, , , . 黑龙江中医药大学硕士学位论文 、 . : , , ,黑龙江中医药大学硕士学位论文 萱 前 言 熊胆为脊索动物门哺乳纲熊科动物黑熊 或棕熊 .的干燥胆汁,具有清热解毒、? 心平肝、利胆名目等功效,在中医治疗肝胆疾病方面发挥了不可 替代的作 用,又因为一熊一胆,资源比较少,且不易得,因此被历代中医药 学家奉 为名贵珍稀药材。随着人们保健养生意识的不断增强,熊胆的市场需求量 也日益扩大。然而,传统获取熊胆的方式为杀熊取胆,因此人们在大量攫 取熊胆的同时,也极大程度地破坏了熊类资源,致使我国野生黑熊的数量 急剧下降,再加上森林砍伐、公路建设、环境污染等因素,导致我国野生. 黑熊资源一度濒临灭绝严重威胁到熊胆的药材资源。二十世纪八十年代, 我国政府加强了对野生黑熊资源的保护,在《国家重点保护野生动物名录》 和《中华人民共和国野生动物保护法》中,将熊类列为国家重点保护野生 动物?,黑熊 和棕熊昌,被列为了国家二级重点保护野生动物,马来熊, 被列为国家一级重点保护野生动物,严禁从野外猎捕,从而熊 类的数量得以保护。但这就与熊胆作为中药使用和开发的需求形成了尖锐 的矛盾。 ‘人工养熊及引流取胆技术的出现极大地缓解了这一矛盾,人工 养殖黑 熊是保护和合理利用野生资源的最佳途径‘】人工养殖黑熊其目的是为了 通过引流的方式从活熊身上持续不断地获得胆汁,从而改变以往杀熊取胆 的方式。这样,在维持黑熊种群数量的同时,最大化地开发了黑熊的经济 价值。据统计,养殖一头黑熊取胆可使头黑熊免于猎杀。在目前国内符 合规定要求和达到的养熊场中,黑熊的数量大约在头左右,圈养 熊平均每年每头可产熊胆粉千克,全年可生产 千克熊胆粉,这一产量 足可以满足国内药用市场对熊胆的需求?。因此,人工养熊业及引流取胆 技术的发展较好地解决了在熊类物种保护与开发利用之间的矛盾,实现了 保护和利用野生资源上的双赢。 ’在中国养熊业发展初期,由于缺乏相关法律法规的制约,政府各有关 黑龙江中医药大学硕士学位论文 部门管理不协调及市场需求与政策导向不一致等因素,致使人工 养熊场的 数量急剧增长。这些养熊场规模不一,管理水平相差悬殊,许多小型养熊 场根本不具备养殖条件,缺乏资金和技术,管理不,尤其在胆囊手术 技术、熊的饲养及采胆技术等方面不完善,导致熊类在采胆汁时受到极大 的痛苦,甚至死亡,同时生产技术的不规范也导致我国各地所产的引流熊 胆粉的质量也相差悬殊。年 月底,国家林业局和其它四个部门进行 了严格整顿,关闭不合格的养熊场,养熊场的数量大大的减少,’由原来的 多家下降至目前的较规范化的家。’ 尽管我国的养熊企业都已经不同程度地实现了规范化管理,但由于各 熊胆粉生产企业的具体情况存在差异以及影响熊胆粉的产量和质量的因 素较多,所以目前市场上的引流熊胆粉质量差异仍然很大,尤其是其中所 含有的熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸含量相差悬殊。目前,对有关引流熊胆粉 中熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸含量测定的研究都是对一个样品或者对几个 产地的个别样品进行分析,所得的分析结果具有片面性,不能准确地反映 该企业所产熊胆粉质量的真实情况。为此,我们有必要在大范围,多产地、 全年度的水平上,对一些熊胆粉生产企业所生产的熊胆粉的质量动态情况 进行深入研究,找出引流熊胆中熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸的含量变化规 律,并对这些企业的养殖规模等具体情况进行调查,找出影响熊胆粉质量 及产量的因素,从而为指导生产,提高熊胆粉的产量和质量,提高经济效 益提供指导。 黑龙江中医药大学硕士学位论文 第一章 文献综述 熊胆为脊索动物门哺乳纲熊科动物黑熊 或棕熊 的干燥胆汁九,性寒,味苦,无毒‘们, 具有清热解毒,息风止痉,清肝明目等功效?。主要用于治疗肝胆疾病?、 心脑血管疾病?、消化道疾病九、眼科疾病?、妇、儿科疾病等。 第一节 本草中对熊胆的记载 本草中关于熊胆的药性、药效的记载很多,各家应用的说法也不尽相 同,多用于治疗黄疸、恶疮痔漏、惊痫、疳疾、眼疾等疾病,也有用熊胆 清热、除肝火、止痛和治疗小儿疾病等。熊胆最早载于《药性论》,日:“熊 胆恶防己、地黄。主小儿五疳,杀虫,治恶疮’’?。《新修本草》日:“疗 时气盛热变为黄疸,暑月久痢;心痛,昧苦寒,无毒’’【引。《医学入门》 日:“点眼去翳开盲、除恶疮、痔瘘引。《本草纲目》日:“熊胆苦入心, 寒胜热,手少阴,厥阴,足阳明药也。故以?心,平肝,‘杀虫,为惊痫, 痊忤,翳障,疳痔,虫牙,蛔痛之剂焉?。《本草求真》日:“熊胆入心 肝,兼入脾、大肠。味苦,性寒,无毒。功在?心平肝。惟其?心,所以 能治目赤翳障,恶疮,痔瘘等症。且能入脾而治黄疸,湿邪。入大肠而治 久痢,湿热,并治小儿风痰雍寒,发作惊痫。要皆除热?血,而并自 愈可。 凡此只可作丸,勿煎汤’’盯。从一些本草典籍中还可以看到古代本草学家 对熊胆的使用方法,如《外台秘要》日:“疗蛔心痛,熊胆如大豆,合水 服,大效;又方十年痔不差,涂熊胆,取乃止,神效,一切方不及也。《’圣 惠方》:“治小儿疳疮,虫蚀鼻,用熊胆半分,汤化,调涂于鼻。《小儿卫 生总微论方》:“熊胆麝香丸治小儿一切疳疾,心腹虚胀,爱食泥土,四肢 壮热。《寿域方》:“肠风痔瘘,熊胆半两,入片脑少许,研和猪胆汁涂之。 这些本草典籍中所叙述的熊胆的功能及应用目前仍然在临床上被广泛使 ‘ 用。 ; 熊胆在中医药文化历史中占有重要地位,为中国人民从古至今的医黑龙江中医药大学硕士学位论文 . 葺 宣叠一????? 疗保健发挥了重要作用。在古代方剂中,有许多将熊胆作为主要药物治疗 疾病的良方,如在四胆丸、胡黄连煎点眼方、芦荟丸方、车前子丸等方剂 中熊胆都是治疗眼病不可缺少的一味药,.在五胆丸方、夜明沙丸方、抵圣 丸方使君子丸方、龙胆散方等方剂中熊胆都是治疗小儿疳症的重要组成 . 部分。 . 《本草图 此外,许多古代的本草典籍中还记载了对熊胆的鉴别方法。 “胆阴干用,然亦多伪,欲试之,取粟颗许滴水中, 经》在熊脂项下称: 一道若线不散者为真。《本草蒙筌》又提出了水试分尘鉴别法,日:“遇 卖者真伪难别,研试水,优劣便知。取尘先封水皮,将末继投尘上,尘竞 《纲目》则进一步转 两边分裂,末则一线迅行,如线不散。此品极优。’’ 引钱乙的鉴别经验: “熊胆佳者通明,每以米粒点水中,运转如飞 者良, “熊胆善辟尘,.试之以 余胆亦转,但缓尔。秒又引周密《齐东野语》云: 净水一器,尘幕其上,投胆米许,则凝尘豁然而开也。”这些本草所记载 的对熊胆的鉴别方法,是古代医药学家对熊胆真伪的简捷有效的传统经验 鉴别方法,有些方法沿用至今。如对熊胆鉴别的驱尘试验后来进一步演化 出推墨试验法,即将墨汁涂于玻璃片上,再将胆仁粉置于墨汁上,则墨汁 立即被胆粉推向四周,其方法和原理与驱尘试验相同。, 第二节 熊胆的化学成分研究 熊胆的化学成分比较复杂,各组成成分含量差异较大,归纳起来可分为 、胆色素类、氨基酸类、胆固醇类盯及微量元素类等。 胆汁酸类? .胆汁酸类 胆汁酸类是熊胆的主要成分,含量为?%,主要包括胆酸、鹅 去氧胆酸、熊去氧胆酸、去氧胆酸。牛磺熊去氧胆酸 、牛磺鹅去氧胆酸等钆圳。其中,熊去氧胆酸是熊胆的特 有成分,与鹅去氧胆酸互为差向异构体,是熊胆的重要成分之一, 在熊胆 汁中是以与牛磺酸形成结合型的牛磺熊去氧胆酸的形式存在。二者含量的 高低是评价熊胆品质的主要依据。 黑龙江中医药大学硕士学位论文 .胆固醇类 胆固醇是合成熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸的前体物质,是熊胆汁中不可 缺少的部分引,但胆固醇本身与熊胆的治疗作用无必然联系?。 .胆色素类 胆色素类包括胆红素、胆黄素、胆褐素及胆绿素等,具有清热降压, 促进红细胞增生等作用,是熊胆发挥治疗作用的重要组成部分‘】。 .氨基酸类 氨基酸是以肽键相结合的蛋白形式存在于熊胆汁中的,经检测分析, 在熊胆汁中存在种以上的氨基酸,其中以谷氨酸和天冬氨酸的含量最高 【南 ? .微量元素 熊胆中包含大约 种微量元素, 其中钠、钾、钙、镁、磷等元素含量 较高,镉、铜、锰、锌、锑等次之, 其他元素含量较低心 第三节 熊胆的药理作用研究 .利胆、保肝作用 。熊胆经十二指肠给药,可明显增加胆汁排出量,使胆汁中胆酸含量增 加,呈现出显著的利胆作用。离体及在体实验均证明熊胆对四氯化碳、一 氨基半乳糖等化学物质造成的急慢性肝损伤均有明显的保护作用心引。 。溶解胆结石作用 熊胆中所含的多种胆汁酸,如鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、去氧胆酸等 均具有抑制胆结石形成和溶解胆结石的作用乜引。 .镇静、抗惊厥作用 熊胆能够降低小鼠在内的自主活动次数,与水合氯醛有协同作 用,能对抗去氧麻黄碱的兴奋作用;熊胆溶液能显著延长过量回苏灵引起 的惊厥潜伏期和惊厥持续时间,并呈现量效关系;对戊四氮所致的小鼠惊 厥亦有明显的抑制作用乜刀。 .解痊作用 离体肠管实验证明熊胆对肠管平滑肌有松弛作用,可缓解乙酰胆碱所黑龙江中医药大学硕士学位论文 /致的强直性收缩,对抗组胺对肠肌的兴奋作用。 .抗炎作用 , 熊胆对醋酸引起的小鼠腹膜毛细血管通透性增加、组胺引起小鼠皮肤 毛细血管通透性增加及巴豆油引起小鼠耳肿胀等均有抑制作用。另外,对 角叉菜胶所致大鼠足肿胀、弗氏完全佐剂所致大鼠关节炎、小鼠棉球肉芽 组织增生、小鼠单核巨噬细胞的吞噬功能等也有较强的抑制作用心引。 .抑菌作用 熊胆对金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌、蜡样芽抱杆菌、短小芽胞杆 菌、绿脓杆菌等均有明显的抑制作用。熊胆: 的溶液对流感嗜血杆菌、 卡塔奈瑟氏菌、肺炎双球菌也有较强的抑制作用。胆酸、牛磺胆酸、甘氨 胆酸、去氧胆酸对革兰氏阳性菌亦有较强的抑制作用乜射。 .解热作用 熊胆灌胃给药,对 %啤酒酵母羧甲基纤维素致热大鼠有明显的解热 作用,同时对,:硝基苯酚导致的大鼠体温升高也有一定的抑制作用, 对小鼠腹腔注射大肠杆菌内毒素所致的发热也有明显的退热作用凹们。 .对心血管系统的作用乜叫 .对心脏作用 左 熊胆能增加冠脉流量,用熊胆的氏灌流大鼠心脏标本, 右心脏冠脉流量增加.%,心肌收缩振幅加大 %。熊胆水溶液可使离体 蛙心或蟾蛛心肌紧张性增大,振幅略增大。有实验表明,熊胆可降低心肌 收缩力,缩短动作电位时程。 .舒张血管作用 用大鼠胸主动脉制成血管条标本,以液灌流,以或高钾致显 著收缩,后,依次加入. 、.、.、./熊胆,每次间 隔 ,均可观察到相似幅度的舒张,且强度随熊胆浓度增加而增加。 .降血压作用 熊胆所含的胆酸钙、去氧胆酸钠、鹅去氧胆酸和胆红素等有不同 程度 降压作用;胆酸钠、去氧胆酸钙对肾上腺素所致血压升高有一定 的对抗作 用,对自发性高血压大鼠的症状有较好的治疗作用,且作用持久 黑龙江中医药大学硕士学位论文 .降血脂作用 给大鼠连续口服熊胆 天,能明显降低血清总胆固醇和甘油三酷 ,增加血清高密度脂蛋白胆固醇和降低血清低密度脂蛋白胆 固醇,使血清高密度脂蛋白胆固醇与血清总胆固醇及 血清低密度脂蛋白胆固醇的比值增大,还能使主动脉脂质量减 少。 .抗血栓形成作用 熊胆可明显降低大鼠全血粘度,使红细胞聚集指数降低:熊胆、 ?。对家兔颈动脉旁路中形成的血栓有抑制作用,且在 ?。 时亦可抑法形成的体外血栓,使湿血栓长度缩短,湿重、干重减 ? 轻。 .降血糖作用 熊胆中的熊去氧胆量酸有明显降低血糖作用,用熊去氧胆酸 .//,连续,能明显降低四氧嘧啶所升高的家兔的血糖水平托引。 ’ .抗癌作用 亚硝酸类是强致癌帮,熊胆可以有效地清除亚硝胺前体物一亚硝酸钠, 并能阻断二甲基亚硝胺在体外的合成,其清除率与阻断率和剂量呈量效关 系,表明熊胆能起到预防某些癌症的作用心钉。 .其他作用 . 熊胆有镇咳作用,对氨雾引咳法所致咳嗽有治疗作用,可使咳嗽潜伏 期延长、咳嗽次数减少;增强胰脂肪酶活性;抗缺氧作用,可明显延长常 压下小鼠在缺氧环境下的存活时间;对小鼠因东蓖若碱、氯霉素、乙醇所 致记忆获得、记忆巩固及记忆再现三个阶段障碍,有明显对抗作用。胆汁 酸有强烈表面活性作用,因而对脂酶有很强的促进作用,还可以抑制胰蛋 白酶活性。牛磺熊去氧胆酸可抑制胰蛋白酶,且随剂量增加抑制作用增强。 此外,熊胆还有健胃、镇痛作用:熊去氧胆酸能促进体内疲劳物质的分解 与排泄及解毒作用心钉。 .毒性及不良反应。 /的剂量灌服对小鼠无毒 熊胆毒性小。用天然熊胆、引流熊胆以 性反应,。。分别为:熊胆灌服为./,腹腔注射为./,引流 熊胆皮下注射为./;鹅去氧胆酸小鼠皮下注射为. /,熊去 黑龙江中医药大学硕士学位论文氧胆酸为./。用熊去氧胆酸或鹅去氧胆酸灌服大鼠的。。大于 /。因此,熊胆的临床应用不良反应少,毒副作用轻微。但其味腥苦 可致少数患者呕吐‘拍。 第四节 熊胆的临床应用研究 ? 基于多方面的药理作用和较小的毒副作用,熊胆已被广泛的应用于临 床治疗,主要用于治疗以下几个方面的疾病。 .肝胆疾病 熊胆口服或制成注射剂对慢性迁延性肝炎、病毒性肝炎及肝硬化治愈 率很高。经临床验证,熊胆有明显的退黄、降酶、调节肝脏蛋白代谢等作 用,是治疗胆固醇胆石症的有效药物。石丽霞等用熊胆注射液对例黄 疸型肝炎进行治疗,取得较好疗效阳们。 .心脑血管疾病 以熊胆为主组方制成的熊胆救心丹对冠心病、心绞痛具有明显的疗 效,并且可以降低血脂,?天内可使肾型高血压恢复正常,对脑溢血也 有较好的疗效拍?。 .消化道疾病 熊胆可用于治疗胃热所致消化不良、胃炎、胃及十二指肠溃疡。熊胆 盐水与珍珠粉合用还能治疗经久不愈的开裂伤口?们。 .眼科疾病 ,用熊胆生理盐水溶液滴眼治疗溃疡型病毒性角膜炎,有较好的治愈 率。若以熊胆溶液结合膜下注射对晶体混浊、眼底出血、球后视神经炎等 均有明显的疗效。与其他药物组方还可治疗老年性白内障,总有效率 .%。熊胆粉制成的滴眼剂,对急慢性结膜炎也有较好的疗效他们。 .妇、儿科疾病 熊胆与其他中药合用,口服对滴虫性阴道炎、霉菌性阴道炎、非特异 性阴道炎等妇科疾病均显示出很好的治疗效果,总有效率达.%。对小 儿轻度抽风,因高热而引起的抽风症,因风寒而引起的喘息症等疗效也较 ,, 好‘圳。黑龙江中医药大学硕士学位论文 .其他 熊胆及其组方对糖尿病、肾炎、百日咳、痔疮、癫痛等均有较好的疗 效,同时兼有镇痉、镇痛、抗疲劳之功效乜引。 第五节 我国的熊类资源状况 我国地域辽阔,森林覆盖面积大,自然环境好,黑熊作为依赖森林生 存的动物在我国有广阔的生存空间,因此我国历史上熊类资源丰富??,这 也为天然熊胆作为中药被广泛应用奠定了基础。据范志勇等人?上世纪九 十年代初的调查统计,中国当时约有熊类只左右,主要分为种熊, 其中黑熊约只,有个亚种,广泛分布于中国的东北、西北。西南和 华南的 个省级行政区域;棕熊约只,在中国有个亚种,分布于东 北、西北和西南的个省级行政区域;马来熊只左右,仅有一个亚 种, 零星分布于中国云南西南和西藏东南的局部地区。目前,黑熊分布区已发 生重大变化。原来连续的分布区域已被分隔为东北部和西南部两个孤立的 大区域,在中国南部和东南部又分隔成几十个碎片。甘肃的岷山、四川和 西藏的大雪山是黑熊种群密度较高的地区。黑熊种群丰富度最高的地区是 在甘肃的岷山,有 只。四川和西藏的大雪山具有亚洲黑熊的良好生 存环境,因此在这里约有黑熊只。其中四川的黑熊数量估计有 只,云南、陕西和黑龙江的黑熊不多,估计三省各地分别仅只。但据 鲁庆彬等在年月至月间对岷山山系黑熊资源的调查结果表明, 年到 年对湖 岷山山系黑熊低密度的地区已占多数。据邓学建等? 南黑熊资源的调查结果,湖南的黑熊分布更为零散,在繁殖期雌雄黑熊相 遇率低,使得湖南黑熊的数量星减少趋势。据杨旭煜等?钉年对四川野 生黑熊资源的调查结果表明,四川黑熊数量急剧下降。据赵文双 等?? 年到年对辽宁省黑熊资源的调查结果,截止年以前辽宁省黑熊资 源呈下降趋势。据冯江等。们年对吉林省黑熊资源的调查显示,吉林省 黑熊资源呈下降趋势。据侯万儒等口刀年对卧龙自然保护区黑熊状况的 调查及刘务林。们在西藏进行的黑熊资源调查,野生黑熊数量也皇下降趋 势。这些调查结果充分表明近些年我国野生黑熊数量总体呈下降趋势。 ‘ 黑龙江中医药大学硕士学位论文 造成这种趋势的原因主要有: 一环境因素:随着现代人口数量不断增加,人类活动范周不断扩 大,与野生物种争夺生存空间。森林面积锐减,野生动物赖以生存的资源 环境遭到严重破坏,比如修建高速公路、铁路和新的工业区等,这使原来 连在一起的栖息地被分割为几片,阻断了物种基因的自由交换,加快了物 种的退化速度,使其适应环境的能力降低。工业文明带来的环境污染、气 候变迁和生态系统的破坏,也严重破坏了熊类的生存环境阳引。 二熊类自身因素:熊类的生殖系统脆弱。在黑熊硕大母体中,幼 仔仅?克,其延缓着床发育的特殊生理特性,使其在母体内发育时 间甚短,其出生后正值隆冬,全靠冬眠期的母熊体能支撑喂养。野生母熊 需?年乃至更长时间才能繁殖一胎,这在很大程度上制约着熊类种群数 量的增长们。 : 三人为因素:熊胆及黑熊的其他部位如熊掌、熊脂、熊皮、熊脑 等都有很高的经济价值,因此很多人为了追求利益两设法捕杀黑熊。另外, 在中国的许多山区,黑熊因毁坏庄稼或伤人等被当地人视为害兽而被捕杀 【口】 面对野生熊种群数量急剧下降的情况,采用杀熊取胆方式来满足日益 增长的市场需求将使黑熊的种群数量在极短的时间内急剧下降。这既是对 熊胆来源的严重破坏,又是对地球生物多样性的破坏。例如黑龙江省中医 药公司年收购了公斤熊胆,这相当于只熊的产量,而同年该省 对熊胆的实际需要是公斤,相当于 只熊,这几乎等于黑龙江省分布 熊的%。目前中国熊胆粉的需求量是公斤,要满足这种需求对我国 的黑熊资源可以说是灭项之灾。因此,我们必须在保护野生熊类资源和满 足对熊胆日益增长的市场需求的矛盾之间找到平衡点?。 第六节 人工养熊业的兴起及发展概况 人工养殖黑熊是保护和合理利用野生资源的最佳途径?。人工养殖黑 熊其目的是扩大种群量,并通过引流的方式从活熊身上得到胆汁,从而改 变了以往杀熊的取胆方式。这样,我们可以在持续不断地获取胆汁、维持黑龙江中医药大学硕士学位论文 ?? 宣宣 黑熊种群数量的同时,还最大化地开发了黑熊的经济价值,以满足国内药 用市场对熊胆粉的需求?。因此,人工养熊业的发展较好地解决了在保护 熊类物种、维持生物多样性与开发、利用熊类资源之间的矛盾,实现了我 们在保护和利用野生资源上的双赢。 .我国人工养熊取胆的兴起及发展状况 从年《中华人民共和国野生动物保护法》的实施开始,各地开始 年月,全国家大小不等的养熊场共有黑熊 了熊类繁育工作。截至 只、棕熊 只、马来熊只。其中,圈养熊的数量基本稳定,繁殖 的.% 用熊增加较多,圈养条件下繁殖熊的数量占总数的比例已从 增到 年的.%,在繁殖的种群中不但有了子一代和子二代,而且 还有子三代。圈养黑熊的雄、雌性别比例是:.,大多数都在 岁以下。 适宜的性别比例和年龄结构使我们能够在不捕捉野生黑熊的情况下,能够 只仔熊, 保证养熊场种群数量满足生产需要。截至年全国共出生 成活率达.%,年均淘汰率为.%,被淘汰或多余的黑熊被转移到 动物园或野生动物保护区。用于胆汁采集的圈养熊只占.%,每只熊平 均年产熊胆粉从年的.公斤提高到目前的公斤,相当于保护了只 野生熊。如按一只熊可引流取胆的期限为年计算,则相当于有只熊 得到了保护。按目前圈养熊的繁殖率和繁殖种群,能够维持一个自我繁殖 发展的圈养种群。中国养熊业的发展实现了熊类资源的合理化开 发,并有 效地保护熊类野生资源,维护生物多样性?。实践证明,黑熊养殖业在中 , 国是成功的。 . 在中国养熊业初期,由于缺乏相关法律法规的制约,政府各有关部门 管理不协调及受利益驱使与政策导向不一致等因素心,致使人工养熊场的 数量急剧增长,一度发展到近家。这些养熊场的规模不一,最大的养 殖数超过只,最小的只有只,其管理水平相差悬殊。许多小型养 熊场根本不具备养殖能力,缺乏资金和技术,管理不规范,尤其在胆囊手 术技术、黑熊的饲养及采胆等技术方面不完善,因此导致黑熊受到极大的 痛苦,甚至导致死亡,这也引起了国际上一些动物保护组织及人士指责我 们材虐待动物。 黑龙江中医药大学硕士学位论文 。 原林业部在年的《关于加强养熊业管理工作的通知》中规定?, 必须使用无管造瘘引流技术,对设施和技术不合格养熊场限期改进,以减 少对熊的伤害。年 月底,国家林业局和其它四个部门发布了一项联 合声明,禁止捕杀野生熊类和虐待养熊场的熊。由此,不合格的养熊场被 关闭,养熊场的数量大大的减少。据国家林业局野生动植物保护司有关人 士在年月 日国新办举行新闻发布会上的讲话,“中国现阶段“养熊 取胆”技术和条件与上世纪八、九十年代相比,已发生根本性改进,将从 前用“铁背心、 “小铁笼对待取胆熊的做法,基本改进为“自体造管 引流、 “无痛操作”和“保障养殖熊活动空间刀的新型方式, “养熊取 胆场已由上世纪九十年代初的多家下降至目前的较规范化的家’’ “】 .引流采胆技术的发展 引流采胆技术是人工养熊业产生和发展的核心,它的发展经历了两个 阶段‘引: 年至 年间,是通过手术在熊胆 第一阶段,为有管引流阶段 囊上安装引流管,又称为“造瘘’’。其手术操作是:采用与氯胺酮对熊 进行麻醉,开腹后找准胆囊基底部,抽出胆汁,切开胆囊,接入引流管导 尿管、钦质管、银质管、东方红八号管等,缝合固定,闭合腹腔,然后 逐层缝合好,一月后拆线。待术后熊行动、食欲恢复正常后,即可取胆。 有管引流的缺点是:熊有异物感,常去抓挠,因此容易引发熊体的多种疾 病,如胆囊萎缩或结缔组织化,造成引流中止,严重的甚至造成胆囊报废, 。为防止熊抓挠引流管,也有个别 影响胆汁产量、质量,甚至导致死亡 养殖人员给熊套上铁背心,这种野蛮的方式给熊的身体带来更大的痛苦, 为此也引起国际动物保护组织的抗议。 第二阶段,为无管引流阶段年至年间。这是在熊腹膜之间 利用熊自身盲管,造成人工瘘管,连接胆囊至腹腔外部,取胆时往 术部插 %,且无任何 入引流管,取完后抽出引流管即可。这种手术的成功率为 后遗症。采胆汁可在熊进食或卧休时进行,整个过程中熊呈自然状态,无 任何不适感。无管引流技术的成功推广使得养熊取胆进入了崭新的阶段。黑龙江中医药大学硕士学位论文 .目前我国养熊业的发展概况 随着我国对养熊业的监管力度不断加强和熊胆市场的发展,那些养殖 规模小、管理不规范的养熊场逐渐退出了市场。从总体上看,我国的养熊 业正向规范化、科学化、集约化方向发展,养熊企业在繁育技术、管理水 平、胆汁的采集及加工等方面都不同程度地提高。但我国的养熊业发展还 不平衡,还存在很多的问题,这也导致各企业所生产的熊胆粉质量差异比 较大。 第七节 引流熊胆与天然熊胆的对比研究 目前引流熊胆粉常用于代替天然熊胆药物使用,但是二者究竟有多大 的相似性,为此许多学者对二者所含的化学成分及药理作用进行了比较研 究。 .化学成分的比较研究 人们针对熊胆的主要成分,如胆汁酸、胆固醇、胆红素、氨基酸、微 量元素等进行了比较测定。 .对胆汁酸的比较测定 梁风锡等采用薄层扫描法对天然熊胆和引流熊胆中熊去氧胆酸和鹅去 . 士 氧胆酸的含量进行了比较测定。天然熊胆中熊去氧胆酸均值为 . .士, 士.%,引流熊胆各均值分别为 .%,鹅去氧胆酸均值为 .%及.%,两类熊胆的熊去氧胆酸含量或熊去氧胆酸与鹅去氧胆酸之 和较为相近?钉。但这种方法须将样品水解后再进行薄层扫描测定,操作繁 琐,难以保证结合胆汁酸水解完全。目前广泛采用高效液相色谱法,直接 测定熊胆中牛磺熊去氧胆酸和牛磺鹅去氧胆酸的含量,这 种方法无需复杂的样品前处理,操作简单,方法准确.张启明等用高效液 相色谱法直接测定了胆汁酸含量,结果表明,引流熊胆中总胆汁酸含量与 天然熊胆接近,但牛磺熊去氧胆酸含量比天然熊胆低,而牛磺鹅去氧胆酸 高于天然熊胆,这与薄层扫描法的测定结果基本~致弛?。 . 黑龙江中医药大学硕士学位论文 .对胆固醇的比较测定 用薄层扫描法测定了天然熊胆和引流熊胆中胆固醇的含量,天然熊胆 胆固醇含量一般为.?.%,平均为.%,而引流熊胆一般为 .%.%,平均为.%,较天然熊胆略高“们。 .对胆红素的比较测定 用重氮化分光光度法比较分析了天然熊胆和引流熊胆中胆红素的含 量.天然熊胆胆红素含量一般为.%.%,平均为.%,引流熊胆一 般为. %一.%,平均为.%,表明天然熊胆含胆红素较引流熊胆 . 高‘钉。 .氨基酸的比较测定 用氨基酸自动分析仪,分析测定了天然熊胆和引流熊胆的氨基酸,结 果两类熊胆样品的氨基酸种类近乎相同天然熊胆中未测得蛋氨酸,但含 量差异较大,天然熊胆以天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸含量较高, 其中丝氨酸含量最高,为./ ;引流熊胆则以谷氨酸、’天门冬氨 鲥。 酸、亮氨酸、赖氨酸含量较高,其中谷氨酸含量最高,为./ . .微量元素的比较测定 用电感耦合氩等离子体发射光谱仪测定了天然熊胆和引流熊胆中微 量元素,结果在天然熊胆中测得 种微量元素,引流熊胆中可测得 种微 量元素,各种微量元素含量差异较大,天然熊胆中以磷、钙、镁含量最高, 硼、铜、镨较高,钡、钴、铬、锶、铍含量较低,。引流熊胆以磷、钙、镁 含量最高,铁、铝、铜、镨含量较高,钡、锰、钴、硼、‘锶、铬含量较低, 两种熊胆中均未发现有害元素他们。 .药理作用的比较研究 .利胆、保肝、溶解胆石作用比较 梁凤锡等通过胆道插管法测定大鼠给予天然熊胆和引流熊胆后胆汁 分泌量的变化差异来比较两种熊胆的利胆作用,结果表明二者均能增加大 鼠胆汁的流出量,且胆汁中胆酸含量增加朝。离体及在体实验均证明熊胆 对四氯化碳、一氨基半乳糖等化学物质所造成的急慢性肝损伤均有明显的 黑龙江中医药大学硕士学位论文 保护作用。金香子等通过细胞化学观察法比较了天然熊胆和引流熊胆对四 氯化碳所致肝细胞损伤的保护作用的区别,二者的作用强度较为相近“盯。 熊胆所含的多种胆汁酸,如熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸,去氧胆酸等具有抑 制胆石形成和溶解胆石的作用,姜皓等研究证明天然熊胆和引流熊胆对豚 鼠胆囊胆固醇结石有预防作用,二者对结石呈现较为相似的抑制率“。 、、 .镇惊、解痉、镇静作用比较 李君实等比较了天然熊胆和引流熊胆对抗戊四氮所致惊厥的作用,两 种熊胆比较均有一定的抗惊厥作用,但引流熊胆的低剂量组作用不显著。 同时通过离体肠管试验法观察了相同剂量的两种熊胆对乙酰胆碱所致的 强直性收缩的作用,结果表明二者均有缓解强直性收缩。通过比较两种熊 胆对小鼠自主活动的影响,以及与水合氯醛的协同作用对抗去氧麻黄碱的 兴奋作用来评价二者镇静作用的区别,结果表明相同剂量的天然熊胆和引 流熊胆对小鼠自主活动均有抑制作用,与水合氯醛有明显的协同作用,对 去氧麻黄碱有一定程度的对抗作用乜。 .抗炎作用比较 ‘李武军等比较了天然熊胆和引流熊胆粉对二甲苯所致小鼠耳部炎症 的作用,实验结果表明二者均有明显的抗炎作用,且对炎症的抑制率也比 较接近盯。 .抑菌作用比较 天然熊胆和引流熊胆抑菌作用范围均较广。对金黄色葡萄球菌的抑菌 强度,天然熊胆值为.,引流熊胆为.,说明天然熊胆的抑菌能 力强于引流熊胆;而对枯草芽抱杆菌的抑菌强度,天然熊胆值为., 引流熊胆为.,天然熊胆的抑菌能力弱于引流熊胆,对其它菌也呈现类 似情况,故认为二者抑菌力近似盯。 .解热作用比较 吴明寿等通过测定和计算注射内毒素后小鼠的肛温变化来比较两种熊 胆的降温作用,结果二者均有显著的降温作用,作用十分相似陌引。 以上对天然熊胆和引流熊胆在化学成分和药理作用两个方茴进行比 较,二者虽在某些方面具有一定的相似性,但是从更广泛意义及某些独特 方面,引流熊胆与天然熊胆的差别有待于进一步深入研究。 黑龙江中医药大学硕士学位论文 第八节 影响引流熊胆产量和质量的因素 .熊的种类 用于引流采取胆汁的熊主要是黑熊和棕熊。在同等条件下,棕熊日采 胆汁量为~,黑熊日采胆汁量为.差异极为显著 ..尽管棕熊胆汁浓度低于黑熊,但干燥后胆粉的产量棕熊的显著 高于黑熊。从胆粉的理化性状和疗效看,则是黑熊优于棕熊,并且黑熊要 比棕熊容易驯服得多。因此,人工采胆以黑熊为主??。 .性别对熊的产胆汁量的影响 同龄公熊体型大,胆囊大,机体代谢比较旺盛,肝脏分泌功能强,故 公熊胆汁产量高于母熊??。 .日粮对胆汁产量的影响 饲料的种类与营养搭配是否合理对熊的产胆汁量有显著的影响,且对 熊胆粉质量也有很大的影响。饲料中粗蛋白质和脂肪含量不同将直接影响 胆液分泌的数量和胆液内固形成分的含量阳羽。 .胆囊大小对熊胆汁产量有一定的影响 胆囊越大,胆汁产量越高,同时可以说明胆囊越大,熊的体型越大, 肝脏分泌功能旺盛,胆汁产量也越高陆?。 .季节对胆汁产量的影响 因为不同季节的温度、湿度、光照等因素不同,使得熊体的代谢水平 ? 不同,导致对胆汁产量有很大的影响,一般?月份产胆汁量最高, 月份产胆汁量次之,?月份产胆汁量较低,?月份产胆汁量最低?二 ’ .取胆方式对胆汁产量的影响 正确的取胆方式,不仅保证了不失时机地取胆汁,还可以减少工作量, 更重要的是可减少熊应激频率和体力耗损,使熊能在取胆的间歇期能充分 地调节生理平衡,避免由此造成的代谢紊乱,既提高产胆汁量,又保护了 熊的健康. 黑龙江中医药大学硕士学位论文 第九节讨论与思考 随着野生资源日益减少和人工养熊业的快速发展,引流熊胆己经基本 取代了天然熊胆,占据主导地位。由于各熊胆粉生产企业的具体情况、规 范化管理水平存在差异以及影响熊胆粉的产量和质量的因素较 多,所以目 前市场上的熊胆粉质量差异很大,主要表现在熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸含 量相差悬殊。目前,对有关引流熊胆粉中熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸含量测 定的研究都是对一个样品或者对几个产地的个别样品进行分析,所得数据 具有片面性,不能真实地反映一个或几个产地熊胆粉质量的真正情况,并 且前人对熊胆粉的质量影响因素研究较少,缺乏系统性。为此,我们有必 要对一些熊胆粉生产企业所生产的熊胆粉的质量动态情况进行深入研究, 以便能发现造成各企业所生产的熊胆粉中熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸含量 不同的影响因素,从而指导生产企业有针对性地改进生产方式,.提高熊胆 粉的产量和质量,提高经济效益。黑龙江中医药大学硕士学位论文 第二章不同产地引流熊胆粉中熊去氧胆酸和鹅去氧胆 酸的含量变化规律及其影响因素的研究 第一节熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸含量测定方法的建立 熊胆中的主要成分为胆汁酸类,熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸占绝大部 分,二者的含量是评价熊胆质量的主要依据。熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸互 为差向异构体,二者的极性差别极小,因此高强度的流动相无法实现对二 者色谱峰进行分离。熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸又是弱酸性样品,在中性条 件下极易发生解离而导致其疏水性下降,导致其在反相高效液相色谱柱上 的保留能力下降,所形成色谱峰的峰高比较小,拖尾严重,从而影响对二 者进行准确定量分析引。在对有关熊胆或其制剂的成分分析方面的文献进 行研究过程中发现,采用高效液相色谱法测定熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸含 量的文献中,所采用的流动相强度普遍比较大,有的文献中所采用的有机 溶剂比例竟然高达%哺即,致使其形成的色谱峰太矮、拖尾严重、与其他 色谱峰分离度差,为此有必要建立规范准确的含量测定方法,以便更准确 地对引流熊胆中所含熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸进行定量分析。 .实验仪器及试药 .仪器 高效液相色谱仪,光电二极管振列检测器,色谱柱.×, ,?保护柱, 型高速离心机。 超声波震荡器, .试剂 乙腈:色谱级,美国迪马试剂公司;甲醇:色谱级,美国迪马试剂公 司;水:娃哈哈纯净水,杭州娃哈哈集团有限公司;磷酸二氢钠::分析纯, 北京化工厂;磷酸氢钠:分析纯,天津市天达净化材料精细化工厂;磷 酸:分析纯,天津市北方天医化工厂。 .试药 黑龙江中医药大学硕士学位论文 : 黑龙江黑宝熊胆粉,经黑龙江中医药大学生药学教研室鉴定为熊科动 物黑熊 的引流熊胆粉。在购自黑龙江黑 宝药业的熊胆粉样品中,选取批号为的样品作为实验样品;牛磺 熊去氧胆酸钠供含量测定用、牛磺鹅去氧胆酸钠供含量测定用均 来自中国药品生物制品检定所。 .实验方法的选择及结果 .色谱条件 ..色谱柱 色谱柱. , ,保护 柱。一 ..流动相条件 相:乙腈;. 相:每水中含./磷酸二氢钠溶液及./磷酸氢 二钠溶液各%,并加磷酸. 。梯度洗脱程序如表。 表梯度洗脱程序表 ..检测波长 ’ 选择为检测波长: .色谱条件的选择及其结果 ..色谱柱的选择及其结果 .本实验考察了 色谱柱.×, 和 , 迪马。。. 色谱柱,按拟定的色谱条件对同一熊胆 粉样品进行分析,结果表明 。。色谱柱所产生的峰形好, 分离度好,见图。黑龙江中医药大学硕士学位论文..检测波长的 选择 、 通过光电二极管振列检测器的检测,对比了在、 等波长下的色谱图,结果表明下的色谱图峰形最好,故选择 为最佳检测波长。不同波长的色谱图对比情况见图。 ..供试品溶液制备的方法及结果 ..提取溶剂及方法的考察 . 取熊胆粉,精密成定,分别用的%乙醇、%乙醇、水、 甲醇,超声提取 ,溶液过滤膜,滤液进行分析,结果表明,用 甲醇提取比用水、%乙醇、%乙醇提取所得的提取物的吸收峰面积稍大, 说明甲醇的提取效果好于%乙醇、%乙醇、水,故选用甲醇作为样品的 提取溶剂,见图。 ..提取方法和提取剂量的考察 和超声 两种方法 本试验对甲醇提取分别采取了加热回流 进行考察,加热回流法和超声提取法两种提取方法的效果相当,’但是超声 提取方法方便、简捷、易操作,因此选用甲醇超声提取方法。见图。 、 、 的甲醇中, 取熊胆粉,精密成定,分别溶于 后过. 微孔滤膜,滤液进行 超声提取 ,溶液均挥至结果表明,甲醇与 的提取提取效果基 分析,进样量均为 本相同,见图。因此本实验选用熊胆粉 ,溶于的甲醇中进 行超声提取的样品制备方法。 图不同色谱柱分离效果比较图 迪马色谱柱色谱柱 黑龙江中医药大学硕士学位论文 ?.,墨 ?., 直. 盘.;矗 叠奄,培 矗 . 口 .囊霜‘ 矗.,, 曩。,? 翘 鼍。拍 。‘ 矗 ?、曩 ?, 矗 图不同波长下的色谱图比较图 图用不同溶剂提取样品的色谱图比较 %醇 %乙醇 水甲醇 黑龙江中医药大学硕士学位论文 图不同提取方法所得样品的色谱图比较图 回流提取法 超声提取法 图用不同体积甲醇提取的样品的色谱图比较图 黑龙江中医药 大学硕士学位论文 因此,供试品溶液的制备方法为:取熊胆粉,精密称定。,加入 后, 甲醇,用超声波提取 ,提取上清液,经转离心 上清液过. 的微孔滤膜后备用。 ‘ .标准品溶液的制备 取牛磺熊去氧胆酸钠约,牛磺鹅去氧胆酸钠约,精密称定, 分别置容量瓶中,并分别加甲醇.,经超声波振荡至全部溶解后, 用甲醇定容至刻度线,将容量瓶的塞子塞好,反覆摇匀后将溶液 分别过 .叠的微孔滤膜备用。 .色谱峰的定性鉴别 将上述供试品溶液及标准品溶液按上述色谱条件进行分析,进 样量为 。分析完成后,将所得色谱图进行比较从而对色谱峰进行定 性,见图。两个标准物质的保留时间与样品色谱图中的两个成分色谱峰 的保留时间相同,说明在样品的色谱图中,处于 的色谱峰是熊去氧 胆酸的紫外吸收峰,处于约 的色谱峰是鹅去氧胆酸的紫外吸收峰, 二者的峰形比较好,而且与其他色谱峰之间的分离度也比较好,可以用于 对其的定量分析。 方法学考察 :线性关系的考察 ..称取牛磺熊去氧胆酸钠.,于容量瓶中,加甲醇少许,超 的微孔滤膜后备用。 声波振荡使其全部溶解后定容至刻度线后,过. ..称取牛磺鹅去氧胆酸钠.,于容量瓶中,加甲醇少许,超 声波振荡使其全部溶解后定容至刻度线后,过. 的微孔滤膜后备 用。 。 . ..标准曲线的绘制 、 、、、、 将两种对照品分别按进样量、 ,进 色谱仪进行分析,其峰面积,并根据其质量与峰面积做标准 曲线, ~. ,.;×一., 计算回归方程分别为 .。结果表明,用该方法测定熊去氧胆酸在 ?范围内的线性关 范围内的线性关系良好。表、.‘ 系良好,测定鹅去氧胆酸在黑龙江中医药大学硕士学位论文? 皿加舶加 帅 .?. 加? .?卯 卯 图熊胆中熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸的色谱及紫外光谱图 熊胆粉样品色谱图牛磺熊去氧胆酸标准品色谱图牛磺鹅去氧胆 酸标准品色谱图 熊去氧胆酸 ‘鹅去氧胆酸黑龙江中医药大学硕士学位论文?? 宣 宣薯皇宣 表牛磺熊去氧胆酸钠标准曲线制备结果表 表牛磺鹅去氧胆酸钠标准曲线制备结果表 .精密度试验 分别称取牛磺熊去氧胆酸钠.和牛磺鹅去氧胆酸钠.,置 容量瓶中,加甲醇分别配成混合标准品溶液,按上述色谱条件进样 ,重复进样次。测得色谱图中牛磺熊去氧胆酸和牛磺鹅去氧胆 酸的峰面积积分值的相对标准偏差分别为.%和.%,表明仪器精密 度良好,结果见表。 .重现性试验 取黑宝药业的熊胆粉批号为,按供试品溶液的制备方法制 备供试品溶液份,按上述色谱条件进样分析,进样量为 。测得 色谱图中牛磺熊去氧胆酸和牛磺鹅去氧胆酸的峰面积积分值的相对标准 偏差分别为.%和.%,结果见表,表明该方法重现性良好。 .稳定性试验 取黑宝药业的熊胆粉批号为,按供试品溶液的制备方法制 备供试品溶液份,按上述色谱条件分别在、、、 、进样分析,进样量为 。测得色谱图中牛磺熊去氧胆酸和牛磺鹅去氧胆酸的 峰面积积分值的相对标准偏差分别为.%和.%,结果见表,表明该 样品在内的稳定性良好。黑龙江中医药大学硕士学位论文 .加样回收试验 ’ 取黑宝药业的熊胆粉批号为,分别加入一定量的牛磺熊去 氧胆酸钠和牛磺鹅去氧胆酸钠,按上述色谱条件进行分析。测得 色 谱图中牛磺熊去氧胆酸和牛磺鹅去氧胆酸的平均回收率分别 为’.%和 .%,分别为.%和.%,结果见表、,表明该分析方法准 确度良好。 表精密度试验结果表% 平均值. . 表重现性试验结果表平均值 ‘. 表稳定性试验结果表 ?????????????????????一????? ?????一 %‘ 平均值 .. ???????????一. 黑龙江中医药大学硕士学位论文 表熊去氧胆酸加样回收率结果表 样品中 加入 测出 回收率 平均回收 次数的的 【的 % % 率% 量 量 量 . . . . . . . . . . . . . :。 . . . . . . . . 表鹅去氧胆酸加样回收率结果表 样品中 加入 测出 回收率 平均回收 次数的 的 的 % % 率% 量 量 量 . . 。 。 。 . . . . ’. . . . . . . . . . . . . , 小结 本实验建立了引流熊胆中熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸的含量测定方法, 并对其进行了方法学考察。结果证明,该方法的线性关系、精密度、准确 度、稳定性、重现性均良好。与前人的分析方法相比,本方法降低了流动 相的溶剂强度,使互为差向异构体的熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸能够分离, 并通过缓冲溶液系统和酸性条件抑制熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸 的解离,从 而使其保持较高的疏水性,增强其与反相色谱柱的结合能力,使得熊去氧 胆酸和鹅去氧胆酸在色谱柱上的保留量大大提高,从而提高色谱峰的峰黑龙江中医药大学硕士学位论文 高,抑制拖尾。用该方法分析熊胆中熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸的含量测定 能够得到可靠的结果。 第二节不同产地引流熊胆粉中熊去氧胆酸和鹅去 氧胆酸的含量变化规律的研究. .随着野生资源日益减少和人工养熊业的快速发展,引流熊胆己经基本 取代了天然熊胆;占据主导地位。由于各熊胆粉生产企业的具体情况、规 范化管理水平存在差异以及影响熊胆粉的产量和质量的因素较多,所以耳 前市场上的熊胆粉质量差异很大,主要表现在熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸含 量相差悬殊。目前,对有关引流熊胆粉中熊去氧胆酸和鹅去氧膻酸含量测 定的研究都是对一个样品或者对几个产地的个别样品进行分析,所得数据 具有片面性不能全面反映一个产地熊胆粉质量的真正情况,并且前人对熊 胆粉的质量影响因素研究较少,缺乏系统性。为此,有必要对一些熊胆粉 生产企业所生产的熊胆粉的质量动态情况进行深入研究,以便能发现造成 各企业所生产的熊胆粉中熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸含量不同的影响因素, 指导这些企业有针对性地改进生产方式,提高熊胆粉的产量和质量,’从而 提高经济效益。 .实验仪器及材料 .仪器 同第一节。 .试剂 同第一节。 .色谱条件 同第一节。 .实验材料 熊胆粉,经黑龙江中医药大学生药学教研室鉴定。为熊科动物黑熊 . 的引流熊胆粉。具体来源见表。 黑龙江中医药大学硕士学位论文 .样品的制备及测定 取熊胆粉,精密称定,加入甲醇,用超声波提取, 的微孔滤膜 取上清液,经转离心 后,取上清液,过。后备用,进样量为 ,按我们所确定的色谱条件进行分析。将所 得熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸的峰面积用标准曲线法计算其含量。各产