大肠杆菌O150O_抗原基因簇的破译和dTDP_鼠李糖合成酶基因的鉴定_cropped

大肠杆菌O150O_抗原基因簇的破译和dTDP_鼠李糖合成酶基因的鉴定_cropped 44 卷 1 期 Vol . 44 No . 1 微 生 物 学 报 Acta Microbiologica Sinica 2004 年 2 月February 2004 大肠杆菌 O150O- 抗原基因簇的破译和 dTDP- 鼠李糖合成酶基因的鉴定 112 31 31 磊郭宏杰冯 张 王 露淳徐建国1 )( 300071 天津 南开大学生命科学学院 2 ( ) 中国 CDC 传染病所 北京 102206 摘 要 :利用鸟枪法对大肠杆菌 O150 O- 抗原基因簇进行测序 ,序列全长 13551bp ,用生物信息学的方法进行序列分 ( ) () 析 ,共发现 11 个基因 ,分别为鼠李糖合成酶基因 rmlB 、rmlD 、rmlA 、rmlC糖基转移酶基因 3 个、O- 抗原转运酶基 ( ) ( ) 因 wzx和 O- 抗原聚合酶基因 wzy,另外还有两个基因功能未知 。用 PCR 的方法筛选出了针对大肠杆菌 O150 的 特异基因 ,可以用于基因芯片或 PCR 方法对大肠杆菌 O150 的快速 。另外 ,通过进化发现大肠杆菌 O150 的 O- 抗原基因簇中携带有典型的大肠杆菌鼠李糖合成酶基因 ,并且这些基因参与了 O- 抗原基因簇间的重组以形 成新的基因簇的过程 。 关键词 :大肠杆菌 , O- 抗原 , 特异基因 , 鼠李糖 () 中图分类号 :Q93 文献标识码 :A 文章编号 000126209 20040120034207 大肠杆菌为革兰氏阴性菌 ,根据其 O- 抗原分为 O150 的方法 。 个可以快速 、准确检测大肠杆菌 本实验首先用长 PCR 扩增出大肠杆菌 O150 的 166 种不同的血清型 ,一部分 O- 抗原特征存在于致 病的大肠杆菌中 。O- 抗原是一类多糖抗原 ,存在于 O- 抗原基因簇 ,用鸟枪法进行测序 ,得到的序列用生 几乎所有革兰氏阴性菌的表面 ,由 3 到 6 个单糖组 物信息学方法进行分析 ,对 O- 抗原基因簇中基因的 成 ,具有多样性 ,成为在 DNA 水平上研究分子进化 功能进行了预测 ,并用 PCR 的方法筛选出了针对大 的极好的 。O- 抗原对细菌的致病性和对环境的 肠杆菌 O150 细菌的特异基因 , 可用于基因芯片或 耐受力有非常重要的作用 ,而其多样性的作用主要 PCR 的方法对该菌的快速检测 。在于逃逸动物免疫系统和噬菌体的识别 。 另外 ,本文还对鼠李糖合成酶基因进行了鉴定 () 革兰氏阴性菌 O- 抗原的合成过程如下 : 细菌分和进化分析 。L- 鼠李糖 6- 脱氧-L- 甘露糖是许多药 步地由糖基转移酶将单糖转移到一个固定在细胞内 物的重要中间体 ,还可以合成香料或用作食品添加 4 膜的脂分子上 ,在内膜的内侧合成寡糖单位 。O- 抗 ,由于鼠李糖的应用前景越来越广 ,生产鼠李糖 剂 ( ) 原的寡糖单位通过转运酶 Wzx而被转移到内膜外的研究备受关注 。L- 鼠李糖在很多革兰氏阴性菌的 ( ) 侧 ,然后通过聚合酶 Wzy而聚合成多糖 ,再被联接 O- 抗原中存在 ,以 dTDP- 鼠李糖前体的形式参与 O-() 到一个糖脂分子上 LipidAΠcore形 成 脂 多 糖 分 子 。 抗原的合成 ,共有 4 个酶按顺序催化从 1- 磷酸- 葡萄 编码负责合成 O- 抗原的所有酶分子的基因一般都 1 ( 糖合成 dTDP- 鼠李糖 , 分别为 RmlA 1- 磷酸- 葡萄糖 相邻存在 ,在染色体上形成一个基因簇。 ) ) ( 胸苷转移酶、RmlB dTDP- D- 葡 萄 糖- 4 , 6- 脱 氢 酶、本研究选择大肠杆菌 O150 为 材 料 , 大 肠 杆 菌 2 O150 在 1972 年首先在患病的动物中被检测到, ) ( RmlCdTDP- 6- 脱氧- D- 葡萄糖- 3 ,5- 变位酶和 RmlD 被证实可以引起牛等牲畜的肠道感染 ,属于肠产毒 () dTDP- 6- 脱氧-L- 甘露糖脱氢酶。这 4 个鼠李糖合 ( ) 性大肠杆菌 Enterotoxigenic Escherichia coli , ETEC, 成酶基因在很多细菌的 O- 抗原基因簇中存在 ,有很3 其潜在的爆发性流行的危险很大,农业上急需一 高的同源性 ,通过与已知功能的序列进行比较 ,可以 鉴定大肠杆菌 O150 O- 抗原基因簇中的鼠李糖合成 () ()基金项目 :国家 863 基因芯片专项资助项目 2002AA2Z2051;国家自然科学基金资助项目 30270029 3 通讯作者 。Tel :86- 22- 23503151 ; Fax :86- 22- 23506281 ; E- mail :lwang72 @vip . sina . com , xujg @public . bta . net . cn () 作者简介 :郭宏杰 1973 - ,女 ,河北省乐亭县人 ,讲师 ,博士 。主要从事致病菌检测的研究 。E- mail :guohj @nankai . edu. cn其他作者 :李 收稿日期 :2003- 03- 31 ,修回日期 :2003207228 酶基因 。同时 ,对这些合成酶基因进行进化上的分 6 管长 PCR 产 物 , 用 Wizard PCR Prep s 产物 。合并 析有助于理解细菌 O- 抗原基因簇的进化历史 。纯化试剂盒纯化 PCR 产物 。 116 O- 抗原基因文库的构建1 材料和方法 用 DNase I 消化 PCR 纯化产物 , 回收 1,3kb 之 111 菌种 间的酶切片段 ,与 p GEM- T- Easy 载体在 T4 连接酶作 用下 16 ?连接 24h ,取连接产物电转化感受态大肠 大肠杆菌 O150 菌株由澳大利亚悉尼大学 α(α) 杆菌 DH5,涂布在含有氨苄青霉素 、X- Gal 和 IPTG Reeves 教授提供 ,受体菌株 大肠杆菌 DH5由本室 的 LB 固体培养基上 ,37 ?过夜培养 ,筛选白色克隆 , 保存 。 以碱裂解法用 96 孔平板大规模提质粒 , 用 EcoR ? 112 载体质粒 酶切鉴定其中的插入片段的大小 ,挑选插入片段在 p GEM- T- Easy 购自 Promega 公司 。 113 酶和试剂500bp 以上的克隆 。 117 序列测定和拼接Expand Long Template PCR 酶 购 自 Boehringer Mannheim 公司 , PCR 纯化试剂盒 、T4 连接酶 、Wizard 利用双脱氧终止法 , 采用 T7- sp6 公用引物 , 用 AB I377 型 DNA 自动测序仪对克隆中的插入片段进 PCR Prep s 纯 化 试 剂 盒 购 自 Promega 公 司 , EcoR ?、 行测序 ,由上海生物工程有限公司提供服务 。用英 DN a se I、X- gal 、IPTG、氨苄青霉素购自上海生工生物 () 国剑桥 MRC Medical Research Council分子生物学实 工程技术服务有限公司 。 114 基因组 D NA 的提取验室出版的 Staden package 软件包的 Pregap4 和 Gap4 5 软件拼接和编辑所有的序列 。 采用 Bastin法提取细菌染色体 DNA 。 115 O- 抗原基因簇的获得118 生物信息学进行序列分析 ( 用美国国家生物技术信息学中心 The National 大肠杆菌 O- 抗原基因簇位于 gal F 基因和 gnd 6 () 基因之间。根据 gal F 基因序列上游引物 5′2Center for Biotechnology Information , NCB I的 orffinder ) ATTGTGGCTGCAGGGATCAAAGAAAT- 3′, 根 据 gnd发现基因 ,用 blast 系列软件与 GenBank 中的基因比 ( 基 因 设 计 下 游 引 物 5′- TAGTCGCGTGNGC2较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什 ) CTGGATTAAGTTCGC- 3′。以大肠杆菌 O150 细菌基 么基因 ,用英国 Sanger 中心的 Artemis 软件完成基因 因组 为 模 板 , 用 长 PCR 方 法 扩 增 O- 抗 原 基 因 簇 。 注释 ,用 Clustral W 软件做 DNA 序列间的精确比对 , ( 用 TMHMM http :ΠΠwww. cbs. dtu. dkΠservicesΠTM2PCR 反应程序如下 : 94 ? 2min ; 94 ? 10s ,60 ? 30s , ) 68 ?15min ,共 30 个循环 ; 68 ?延伸 7min ,得到 PCRHMMΠ进行蛋白质跨膜片段的分析 。 表 1 大肠杆菌 O150 的 O- 抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因及其中的引物及 PCR 数据 Table 1 PCR testing of the specifity of E. coli O150 genes Base positions Base positions Base positions of Length of the Annealing temp2erature Gene Gene function of genes of forward primers reverse primers PCR fragmentΠbp of PCRΠ? 5632,7134 5706,5722 ,6475 6458O- antigen flippase 770 50 wzx 5719,5736 6681,6698 980 52 5978,5995 6789,6806 829 54 8681,8699 9169,9185 ,9197 8307505 48 orf 8 Glycosyl transferase 8418,8435 8995,9012 595 48 8333,8350 9050,9067 9397,9413 9882,9899 735 48 93379899,9354 ,9916 ,10098 9184503 50 orf 9 Glycosyl transferase 9489,9506 10035,10051 580 54 10302,10319 10852,10869 563 54 10293,10310 10954,10971 ,10994 10098568 50 orf 10 Glycosyl transferase 10377,10394 10973,10989 679 44 11217,11234 11985,12002 11225,11241 12035,12052 613 48 786 52 11012,12109 O- antigen polymerase wzy 828 53 11172,11189 11960,11977 806 54 微 生 物 学 报 44 卷 36 ( ) 见表 2的基因组为模板进行 PCR 。PCR 条件 : 菌 119 特异基因的筛选 94 ?2min ;94 ? 15s ,退火温度因引物的不同而不同 用 PCR 的 方 法 筛 选 大 肠 杆 菌 O150 的 特 异 基 () 参照表 1,退火时间 50s ,72 ? 2min ,共进行 30 个 因 。针对大肠杆菌 O150 的 O- 抗原基因簇中的 wzx 、 μ循环 ; 72 ?继续延伸 10min ,反应体系是 25L 。 wzy 和糖基转移酶基因 ,在基因内部各设计 3 对引 () 物 见表 1,以所有 166 株大肠杆菌和 43 株志贺氏 3表 2 用于筛选特异基因的 166 株大肠杆菌和 43 株志贺氏菌及它们的来源 Table 2 Bacterial strains and PCR pools used for testing of E. coli O150 Pool No . Strains of which chromosomal DNA included in the pool Source a E. coli type strains for O serotypes O1 ,O2 ,O3 ,O4 ,O10 ,O16 ,O18 ,O39 1 IMVS E. coli type strains for O serotypes O40 ,O41 ,O48 ,O49 ,O71 ,O73 ,O88 ,O100 2 IMVS 3 E. coli type strains for O serotypes O102 ,O109 ,O119 ,O120 ,O121 ,O125 ,O126 ,O137 IMVS 4 E. coli type strains for O serotypes O138 ,O139 ,O149 ,O7 ,O5 ,O6 ,O11 ,O12 IMVS 5 E. coli type strains for O serotypes O13 ,O14 ,O15 ,O17 ,O19ab ,O20 ,O21 ,O22 IMVS 6 E. coli type strains for O serotypes O23 ,O24 ,O25 ,O26 ,O27 ,O28 ,O29 ,O30 IMVS 7 E. coli type strains for O serotypes O32 ,O33 ,O34 ,O35 ,O36 ,O37 ,O38 ,O42 IMVS IMVS 8 E. coli type strains for O serotypes O43 ,O44 ,O45 ,O46 ,O50 ,O51 ,O52 ,O53 9 E. coli type strains for O serotypes O54 ,O55 ,O56 ,O57 ,O58 ,O59 ,O60 ,O61 IMVS IMVS 10 E. coli type strains for O serotypes O62 ,O63 ,O64 ,O65 ,O66 ,O68 ,O69 ,O70 IMVS 11 E. coli type strains for O serotypes O74 ,O75 ,O76 ,O77 ,O78 ,O79 ,O80 ,O81 IMVS 12 E. coli type strains for O serotypes O82 ,O83 ,O84 ,O85 ,O86 ,O87 ,O89 ,O90 IMVS 13 E. coli type strains for O serotypes O91 ,O92 ,O95 ,O96 ,O97 ,O98 ,O99 ,O101 IMVS 14 E. coli type strains for O serotypes O112 ,O162 ,O113 ,O114 ,O115 ,O116 ,O117 ,O118 b 15 E. coli type strains for O serotypes O123 ,O165 ,O166 ,O167 ,O168 ,O169 ,O170 ,O171 c 16 E. coli type strains for O serotypes O172 ,O173 ,O127 ,O128 ,O129 ,O130 ,O131 ,O132 , IMVS 17 E. coli type strains for O serotypes O133 ,O134 ,O135 ,O136 ,O140 ,O141 ,O142 ,O143 IMVS 18 E. coli type strains for O serotypes O144 ,O145 ,O146 ,O147 ,O148 ,O150 ,O151 ,O152 IMVS 19 E. coli type strains for O serotypes O153 ,0154 ,O155 ,O156 ,O157 ,O158 ,O159 , IMVS 20 E. coli type strains for O serotypes O160 ,O161 ,O163 ,O8 ,O9 ,O124 ,O111 IMVS 21 E. coli type strains for O serotypes O103 ,O104 ,O105 ,O106 ,O107 ,O108 ,O110 d 22 S higella Boydii strains B4 ,B5 ,B6 ,B8 ,B9 ,B11 ,B12 ,B14 d 23 S higella Boydii strains B1 ,B3 ,B7 ,B8 ,B10 ,B13 ,B15 ,B16 ,B17 ,B18 24 S higella Dysenteriae strains D1 ,D2 ,D3 ,D4 ,D5 ,D6 ,D7 ,D8 d d 25 S higella Dysenteriae strains D9 ,D10 ,D11 ,D12 ,D13 () ()d 26 S higella Flexneri strains F6a ,F1a ,F1b ,F2a ,F2b ,F3 ,F4a ,F4b ,F5 v :7F5 v :4 27 S higella Sonnei strains D5 , DR d 3 A total of 27 pools of DNA were made ,each containing 8 to10 strains. a . Institude of Medical and Veterinary Science ,Anelaide ,Australia ; b. O123 from IMVS ,others from Statens Serum Institut ,Copenhagen ,Denmark ; c . O172 and O173 fromStatens Serum Institut , Copenhagen ,Denmark , others from IMVS ; d. Institute of Communicable Disease Prevention and Control , Chinese Center for Disease Prevention and Control . 注意避免任何可引起基因组 DNA 断裂的操作 。 2 结果和分析 212 O- 抗原基因簇的测序 211 O- 抗原基因簇的获得 本研究采用“鸟枪法”对大肠杆菌 O150 的 O- 抗 原进行测序 , 首先对 PCR 纯化产物进行 DNase I 酶 长 PCR 产物用 018 %的琼脂糖凝胶电泳检测 , 切 ,提取大小在 1,3kb 之间的片段 ,与载体进行连 在 10,15kb 的位置出现一条电泳带 。为了保证 O- α接 ,取 1Π10 的连接产物电转化 DH5,共得到 500 个 抗原基因簇的序列质量 ,对大肠杆菌 O150 的基因组 共作 6 个 长 PCR 反 应 , 然 后 混 合 这 些 产 物 产 生 文 左右的白色克隆 。 - m ( 根据 P = e P : 未测定碱基的概率 ; m : 测定序 库 ,以减小 PCR 反应所带来的误差 。由于长 PCR 对 7 ) 列的覆盖率,为了保证序列质量 ,每个碱基至少 模板的完整性要求很高 ,所以在提取基因组时一定 ( ) 有 3 个以上高质量 大于 90 %的序列覆盖 ,我们首 B 糖基转移酶基因 、C 寡糖单位处理基因 。A 基因 、 先需要对 80 个 500bp 以上的克隆测序以达到 90 % 类基因由于有极高的同源性 ,很容易通过与已知功 的碱基测定概率 。以碱裂解法用 96 孔平板大规模 能的序列进行比较而鉴定 。C 类基因编码的蛋白由 提取质粒 ,用 EcoR ?酶切鉴定其中的插入片段的大 于有典型的 10,14 个跨膜片段 ,也可以用生物信息 小 ,大于 500bp 插入片段为 50 %以上 ,说明所构建的 学方法鉴定 。对于 B 类基因 ,由于编码此类酶的基 ( ) 大肠杆菌 O150 的 O- 抗原的基因文库是成功的 。挑 因之间的同源性很小 这与其它大多数酶不同,根 选插入片段在 500bp 以上的 80 个克隆首先以 T7 为 据与其它已知功能基因的比较 ,只能判断一个未知 引物进行单向测序 , 对于余下的 10 %的序列 , 再以 基因是否属于这类基因 ,但不能判断其确切转移哪 sp6 为引物测定部分插入片段的反向序列 , 将所有 一个单糖 。对大肠杆菌 O150 的 O- 抗原基因簇 , 用 所得序列用 Pregap4 和 Gap4 软件拼接和编辑 ,从而 orffinder 发现基因 ,找到 11 个开放的阅读框 ,所有开 得到大肠杆菌 O150 的 O- 抗原基因簇的全序列 , 序 放阅读框的 5′?3′方向为从 gal F 基因到 gnd 基因 。 ( gal F 和 gnd 不参与 O- 抗原的合成 ,只是用来扩增 列全长 13551bp 。 8 ,9 ) O- 抗原基因簇,用 blast 系列软件与 GenBank 中 213 O- 抗原基因簇的序列分析 的基因比较结果见表 3 。 O - 抗原基因簇一般含有 3 种基因 :A 单糖合成 表 3 大肠杆菌 O150 O- 抗原基因簇的基因功能预测 Table 3 Summary of ORFs in E. coli O150 ( ) Identical %Π ( ) Location in G + C% Similar proteins ( ) Gene No . of aa Putative function Similar %( )content reference sequence ()aa overlap RmlB ()137 4398Π99 361 dTDP- D- glucose 4 ,6- dehydratase 361 1138,2223 rmlB ( )Shigella boydii RmlD TDP- 6- deoxy-L- manno ()100 4795Π97 299 299 2223,3122 rmlD ( )Shigella boydii Se- dehydrogenase RmlA Glucose- 1-phosphate ()3180,4058 Π99 292 9843157 292 rmlA ( )Shigella boydii Thymidylyltransferase RmlC dTDP- 6- deoxy- D- gluco ()Π89 172 183 874063,4614 38158 rmlC ( )Shigella boydii Se- 3 ,5 epimerase ,5599 461632172 orf 5 327 Unknow Wzx ()120 2921500 Π41 419 O- antigen flippase 5632,7134 wzx ()Bacteroides fragilis orf 7 7137,8282 381 Unknow 31176 Glycosyltransferase ()orf 8 Π51 126 Glycosyltransferase 296 278307,9197 32188 ( )Clostridium acetobutylicum Glycosyltransferase ()orf 9 304 47Π63 285 Glycosyltransferase 9184,10098 31180 ( )Shigella flexneri 2a Glycosyltransferase ()32121 orf 10 48Π67 298 298 Glycosyltransferase 10098,10994 ( )Shigella flexneri 2a Wzy ()11012,12109 365 Π47 317 O- antigen polymerase 2530196 wzy ( ) Shigella boydii 21311 单糖合成基因 : 组成 O- 抗原的糖通常为中 orf 4 分别与合成鼠李糖前体的 dTDP- 鼠李糖的 4 个 合成酶基因有非常高的同源性 ,其中 , orf 1 与鲍氏志 性糖 、氨基糖 ,有时为罕见糖如 6 - 脱氧已糖 、3 ,6 - 贺氏菌 的 RmlB 在 361 个 氨 基 酸 中 有 98 %的 相 同 双脱氧 己 糖 等 , 所 有 的 单 糖 均 需 以 核 苷 酸 二 磷 酸 性 ,说明它们有极高的同源性 , 可以肯定 orf 1 基因 () NDP- 单糖前体的形式参与合成 O- 抗原 。细菌中 为 rmlB 基因 ,命名为 rmlB ; orf 2 与鲍氏志贺氏菌的 的常见糖由于它们为细菌基础代谢底物 ,其合成酶 RmlD 在 299 个氨基酸中有 95 %的相同性 ,说明它们 有极高的同源性 ,可以肯定 orf 2 基因为 rmlD 基因 , 基因存在于基因组的其它位置中 ,一般不在 O - 抗 命名为 rmlD ; orf 3 与鲍氏志贺氏菌的 RmlA 在 292 原基因簇里重复出现 。大肠杆菌 O150 的 O- 抗原的 结构未知 ,但通过进行 blast 比较 , orf 1 , orf 2 , orf 3 和 微 生 物 学 报 44 卷 38 个氨基酸中有 98 %的相同性 ,说明它们有极高的同 在种属内的时间的增长而进化到与其它片段相似的 源性 , 可以肯定 orf 3 基因为 rmlA 基因 , 命名 rmlA ;GC 比 ,这一特征说明 O- 抗原起源于低 GC 含量的细 orf 4 与鲍氏志贺氏菌的 RmlC 在 172 个氨基酸中有菌中 ,近期才通过横向转移进入他们现在所在的细 11 87 %的相同性 ,说明它们有极高的同源性 ,可以肯定菌中。 orf 4 基因为 rmlC 基因 ,命名为 rmlC ;大肠杆菌 O15021316 鼠李糖合成酶基因的进化分析 : 从 GenBank 的结构未知 ,但从以上结果可以肯定大肠杆菌 O150 中提取 已 知 功 能 的 鼠 李 糖 合 成 酶 基 因 的 序 列 , 用的 O- 抗原结构中有鼠李糖存在 。在已知序列的含 ( ) ClustralW 进行分析 见图 1。由图可以看出 , 大肠 有鼠李糖的 O- 抗原基因簇中 ,4 个合成酶基因一般 杆菌 O150 具有典型的大肠杆菌鼠李糖合成酶基因 以 rmlB 、rmlD 、rmlA 、rmlC 的顺序在 O- 抗原基因簇 中呈一个簇排列 ,在大肠杆菌 O150 中也为同样的顺 的特点 ,并且大肠杆菌和志贺氏菌的亲缘关系非常序 。 近 ,尤其在 rmlB 和 rmlD 中 , 二者的差异低于 5 % 。 21312 糖基转移酶基因 : orf 8 通过进行保守区域比 志贺氏菌属细菌共有 33 种不同的 O 抗原 , Reeves () 较 ,与糖基转移酶家族 2 相似 pfam00535 , 3e- 07,进 12 教授等发现志贺氏菌是从大肠杆菌进化而来 ,进 行 blast 比较 ,与丙酮丁醇梭菌的糖基转移酶有 27 % 化时间在 3 万 5 千年至 27 万年之间 ,其它的研究工 的相同性 ,51 %的相似性 ,说明它们之间有高度的同 源性 ,可以推测 orf 8 也为糖基转移酶基因 ,暂命名 ( 作包 括 多 位 点 酶 切 电 泳 Multilocus enzyme eletro2为 orf 8 。orf 9 与福氏志贺氏菌 2a 的 rf bF 基因在 285 ( ) ) phoresis , ML EE、核糖体分型 Ribotyping和对 8 个 个氨基酸 中 有 47 %的 相 同 性 , 63 %的 相 似 性 , rf bF 持家基因进行的分析都表明志贺氏菌属细菌属于大 基因编码 dTDP- 鼠李糖的糖基转移酶基因 , 所以推 13 肠杆菌属,我们对鼠李糖合成酶基因的进化分析 测 orf 9 是 一 个 糖 基 转 移 酶 基 因 , 暂 命 名 为 orf 9 。 orf 10 与福氏志贺氏菌 2a 的 rf bG 基因在 289 个氨基 也支持了上述论断 。另外 ,选择了 4 株沙门氏菌 O- 酸中有 48 %的相同性 , 67 %的相似性 , rf bG 基因编 抗原基 因 簇 中 的 鼠 李 糖 合 成 酶 基 因 进 行 了 研 究 ,码 dTDP- 鼠李糖的糖基转移酶基因 ,所以推测 orf 10 rmlB 中大肠杆菌与沙门氏菌的差异平均为 20 % ,比 是一个糖基转移酶基因 ,暂命名为 orf 10 。 二者用持家基因分析得出的 15 %的差异略高一些 。 21313 寡 糖 单 位 处 理 基 因 : 通 过 HMMTOP 分 析 , 这两个属的细菌在 14000 万年前分化 , 沙门氏菌有 orf 6 和 orf 11 是仅有的两个编码蛋白具有 10 个以上 47 种 O 抗原 ,其中 3 种与大肠杆菌相同 。说明它们跨膜片 段 的 基 因 。 orf 6 编 码 的 蛋 白 通 过 HMMTOP 分别在过去的 14000 万年中形成了大约 164 种和 43 分析发现 含 有 14 个 潜 在 跨 膜 片 段 , 通 过 Eisenberg 种新的抗原 。另外 ,通过对很多大肠杆菌和沙门氏 菌 O- 抗原基因簇进行序列分析和比较 ,发现不同个 体的基因簇之间的重组和转座子引起的重组为其进 化的主要途径 ,本研究通过对鼠李糖合成酶基因的 进化分析也可以看出 ,如果这 4 个合成酶基因是从 10 等的算法也发现 Orf 6 有 14 个潜在的穿膜区 ,而 同一祖先进化而来 ,没有发生过重组 ,那么 4 个基因 且与许多 Wzx 蛋白相似 , 例如 , 和热球菌的 Wzx 在 的进化树应该有相似的拓扑结构 ,但发现其 5′端基 () 因 包括 rmlB 、rmlD 和 rmlA 保守性比较强 ,具有种 419 个氨基酸中有 21 %的相同性 ,41 %的相似性 ,所 ( ) 属特异性 , 而 3′端基因 rml C具有更大的多变性 , 以可以推测 orf 6 很 可 能 是 wzx 基 因 , 命 名 为 wzx 。 ( 具有 O- 抗原的特异性 ,尤其在大肠杆菌中 包括志 orf 11 编码的蛋白通过 HMMTOP 分析发现含有 10) 贺氏 菌 更 为 明 显 。同 时 , 对 rmlB 、rmlD 、rmlA 和 个潜在跨膜片段 ,它的内膜的拓扑结构具有众所周 ( ) rml C 基 因 进 行 G + C% 的 分 析 , 平 均 值 分 别 为 () 知的 O- 抗原聚合酶 Wzy的典型特征 ,此外 ,它与鲍 43 % 、48 % 、45 %和 35 % , rml C 基因比其它 3 个基因 氏志贺氏菌编码 O- 抗原聚合酶的 Wzy 在 317 个氨( ) 的 G + C%明显偏低 ,也说明这 4 个基因具有不同 基酸中有 25 %的相同性 , 47 %的相似性 , 说明它们 的起源 ,可以推测 rmlB 、rmlD 和 rmlA 基因在大肠菌 之间有高度的同源性 ,所以命名 orf 11 为 wzy 基因 。 中已经存在很长时间了 , 而 rml C 基因以及其后的 21314 未知功能基因 : orf 5 和 orf 7 通过与已知序列O- 抗原特异性基因是在鼠李糖合成酶基因介导的重 比较 ,同源性比较低 ,无法推测其可能的功能 。组中转移到它现在所在的细菌中而形成新的抗原基 ( ) 21315 O- 抗原基因簇的 G + C% : 大肠杆菌 O150 因簇 。 ( ) 的 O- 抗原基因簇中 G + C%平均为 35158 % ,而基 ( ) 因组中其它位置 G + C% 一般为 50 % 。目前普遍 认为 GC 差异说明 DNA 片段的外源性 , 并随着在所 图 1 用 Clustral W 产生的鼠李糖合成酶基因( rmlB , rmlD , rmlA , 和 rmlC) 的进化树 Fig. 1 Phylogenetic trees for the rmlB , rmlD , rmlA , and rmlC genes generated ( )by Clustral Wneighbor- joining method ( ) ( ) ( ) Sequences used included those from three E. coli strains〔E. coli O150 EcO150, E. coli O26 EcO26, E. coli K12 Eck12〕、two S . ( ) () boydii strains Ecbd5 and Ecbd9、four S . enterica strains M324 , M293 , M287 , M285and six Streptococcus strarins〔S . pneumoniae 6A , ( ) ( ) ( ) ( ) 6B , and 18CSp6A , Sp6B , Sp18C; S . gordonii Sgo, S . suis Ssu, and S . pyogenes Spy〕. The scale bar indicates the 011 evolu2 tionary distance unit . 214 大肠杆菌 O150 特异基因的鉴定 ,但在身体衰弱或免疫力低下的宿主 的肠道寄生菌 最近研究发现 ,O - 抗原基因簇中的 B 和 C 类 中 ,原本正常的非致病性大肠杆菌也会引起宿主的 15基因 为 每 株 菌 的 特 异 基 因 , 可 用 于 对 该 菌 的 检 。另外还有很多大肠杆菌的致病性极强 ,致 感染14 测。根据这一理论 , 设计针对 B 和 C 组基因 的 病性大肠杆菌按致病机制分为肠致病性大肠杆菌 PCR 引物 ,以含有大肠杆菌 O150 的一组菌作为正对 ( ) Enteropathogenic E. coli , EPEC、肠侵袭性大肠杆菌 照 ,对所有 166 种大肠杆菌 ,43 株志贺氏菌进行 PCR( ) Enteroinvasive E. coli , EIEC、肠 产 毒 性 大 肠 杆 菌 反应 。不能产生正反应产物的基因将极有可能是大 ( ) ( ETEC、肠 出 血 性 大 肠 杆 菌 Enterohaemorrhagic E. 肠杆菌 O150 的特异基因 。 ( ) coli , EHEC和肠聚集性大 肠 杆 菌 Enteroaggregative 本研究针对大肠杆菌 O150 的 O- 抗原基因簇中) E. coli , EaggEC等 。在发展中国家 5 岁以下的儿童 的 wzx 、wzy 、orf 8 、orf 9 、orf 10 基因设计引物 , 在每个 中 ,估计每年腹泻人数 15 亿 ,死亡人群约 300 万 ,这 基因内 ,各设计了 3 对引物 ,每对引物分布在相应基 些地区的儿童社区研究中 , ETEC 是最常见的肠道致 因内的不同地方以确保其特异性 。每对引物除了在 病菌 。由于致病大肠杆菌的主要携带体为牛 、猪等 第 18 组中做 PCR 后得到了预期大小的一条带外 ,牲畜 ,我国人口众多 ,各地区发展不平衡 ,一些地区 在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带 ,所以的卫生条件较差 ,人畜交叉感染机会很多 ,这就为大 wzx 、wzy 、orf 8 、orf 9 、orf 10 基因对大肠杆菌 O150 是 肠杆菌大规模爆发流行提供了基础 。另外 ,一些农 高度特异的 。可用于快速准确地检测人体和环境中 () 业国家 如澳大利亚和加拿大也急需快速鉴定手段 的大肠杆菌 O150 。 以保证他们的出口牲畜及产品不含致病菌 。一些大 的食品公司也急需快速鉴定方法以确保食品的质 3 讨论 量 。 大肠杆菌是人类和其它脊椎动物中营共生生活 微 生 物 学 报 44 卷 40 Reeves P R. Bacterial polysaccharide synthesis and gene nomencla2 6 目前传统的大肠杆菌鉴定方法仍采取血清学鉴 ture . Trends in Microbiology ,1996 ,4 :495 - 5031 定 ,但这个方法的缺点在于需要培养单菌落 , 耗时 徐建国. 分子医学细菌学. 北京 :科学出版社 ,20001 7 长 、灵敏度低且容易漏检 。很多科学家都在探索用 Marolda C L , Valvano M A. The GalF protein of Escherichia coli is 8 分子生物学的方法进行这项工作 ,但都没有发现合 not a UDP- glucose pyrophosphorylase but interacts with the GalU pro2 tein possibly to regulate cellular levels of UDP- glucose . Mol Microbi2 适的 DNA 分子 。本研究从合成表面多糖抗原的基 ol ,1996 ,22 :827 - 840 . 因簇中 筛 选 特 异 DNA 片 段 用 于 基 于 基 因 芯 片 或 Stevenson G , Neal B , Liu D , et al . Structure of the O antigen of 9 PCR 方法对大肠杆菌的快速检测 ,既继承了传统 ,又 Escherichia coli K- 12 and the sequence of its rfb gene cluster . J B ac2 弥补了传统的血清学方法的不足 。 () teriol , 1994 ,176 13:4144 - 41561 Eisenberg D , Schwarz E. Analysis of membrane and surface protein 10 参 考 文 献 sequences with the hydrophobic moment plot . J Mol Biol ,1984 ,179 : 125 - 142 . 1 Whitfield C. Biosynthesis of lipopolysaccharide O antigens. 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Clinical Mi2 5 15 ( ) gene rf bcluster of Escherichia coli O1111 Gene , 1995 , 164 : 17 - crobiology Reviews , 1998 ,11 :142 - 2011 231 Sequence of Esc heric hia coli O150 O-antigen Gene Cluster and Identif ication of Rha mnose Pathway Genes 1 1 1 2 31 3GUO Hong-JieFENG LuZHANG ChunXU Jian- Guo WANG Lei 1 ()College of Life Science , Nankai University , Tianjin 300071 , China 2 (Institute of Communicable Disease Prevention and Control , Chinese Center f or Disease Prevention and Control , Priority L aboratory f )or Molecular Medical B acteriology , Ministry of Health , P O BOX 5 , Changping , Beijing 102206 , China Abstract : The Escherichia coli O150 O- antigen gene cluster was sequenced. It contains the genes for biosynthesis of nu2 ( ) ( ) cleotide sugars dTDP- rhamnose , as well as genes for O unit flippase wzx , O- antigen polymerase wzy and potential transferase genes. By polymerase chain reaction against representative stains for the 166 E. coli and 43 S higella O sero2 group s , we identified 5 genes that are highly specific to E. coli O1501This work provides the basis for a sensitive test for the rapid detection of E. coli O1501Phylogenetic trees for the rmlB , rmlD , rmlA , and rmlC genes was generated , and we found that these genes are typical E. coli genes and may have been involved in recombination events between O- anti2 gen gene clusters. Key words : Escherichia coli ,O- antigen , Specific gene , Rhamnose () Foundation item : Chinese National Programs for High Technology Research and Development 2002AA2Z2051; Chinese National Natural Science Foundation ()30270029 3 Corresponding author . Tel :86- 22- 23503151 ; Fax :86- 22- 23506281 ; E- mail :lwang72 @vip . sina . com , xujg @public . bta . net . cn Received date :03- 31- 2003