不同来源家蝇幼虫分泌物对猪蛔虫卵发育影响

不同来源家蝇幼虫分泌物对猪蛔虫卵发育影响 不同来源家蝇幼虫分泌物对猪蛔虫卵发育 影响 中国公共卫生2008年1月第24卷第l期ChinJPublicHealthJan2008Vo1.24No.1 文章编号:1001—0580(2008)O1.0046—02中图分类号:R383.1+l文献标志码:A 不同来源家蝇幼虫分泌物对猪蛔虫卵发育影响 国果,吴建伟,付萍,覃容责,张勇 【论着】 摘要:目的分别从饲养家蝇幼虫的饲料残渣及幼虫浸液中提取家蝇幼虫分泌物,初步纯化后观察对猪蛔虫 卵发育的影响.方法将家蝇幼虫饲料残渣或3龄幼虫浸泡于适量蒸馏水中4h,吸取浸液用硫酸胺盐析或透析的方 法分离分泌物,所得分泌物分别制成虫卵培养液,观察培养液中猪蛔虫卵发育情况.同时,设立不含家蝇幼虫分泌物 的培养液为阴性xCN.结果从饲料残渣和幼虫浸液中提取的分泌物0,30%,30%,50%的盐析蛋白液,盐析上清 液对虫卵发育均无影响;50%,80%的盐析蛋白液,透析外液可明显阻碍虫卵的发育.结论家蝇幼虫饲料残渣和幼 虫浸液中提取的幼虫分泌物均可阻碍猪蛔虫卵的发育,活性物质主要集中在50%,80%的盐析沉淀部分,其分子量 <14KD. 关键词:家蝇幼虫;分泌物;猪蛔虫卵;发育 EffectofmllscadomesticaIarvaesecretionfromdifferentsourcesondevelopmentofascariss uumeggGUoGuo.WU Jian—wei,FUPing,eta1.DepartmentofParasitology,GuiyangMedicalCollege(G-uiyang55000 4,China) Abstract:0bjectiveTheMuscadomesticalarvaesecretionwasextractedfromtheleachingliq uoroffedremnantand larvae.TheeffectWasstudiedonthedevelopmentofascarissuumeggsaftersimplepurification.MethodsThefedremnant and3instarlarvaeweresoakedindistilledwaterfor4hours,thentheleachingliquorWasisolatedwithsaltingoutbysolid ammoniumsulfateordialyzing.ThesecretionWaspreparedascultureliquidofascarissuumeggs.Thedevelopmentalrationof theeggWasobservedandcomparedwiththecontrolgroupwhichcultiratedinsameconditionwithoutthemuscadomestica larvaesecretion.ResultsThe0, 30%,30%--50%ammoniumsulfatepeUetsandsulfatesupernatantoftheleachingliquor offedremnantandlarvaedidnotshowedinfluencetothedevelopmentofascarisSUUITIegg.whilethe50%,80%sulfatepel— lets,dialyzedliquidcouldhinderthegrowthofeggobviously.ConclusionTheleachingfiquoroffedremnantandlarvaecan hinderthegrowthofascarissuumegg.Themajorsubstancewerethe50%, 80%sulfatepellets.themolecularweightof whichWasnomorethan14KD. Keywords:mL1SCadomesticalarvae;secretion;ascarissuumegg;development 猪蛔虫(Ascarissuum)是世界范围内广泛分布和流行的 一 种大型肠道寄生蠕虫,其感染率高达50%,70%,主要感 染于生长时期的仔猪[1,.新近研究证实,猪蛔虫也感染人. 因此,一些国家已经把猪蛔虫纳入公共卫生学的范畴(3_.有 研究明,家蝇幼虫体外分泌物中含有抑制多种严重的植物 病原菌(引,植物根结线虫(的物质;家蝇幼虫生态处理猪粪 后,猪粪中菌群数量,粪臭素等明显减少[6J,大大减少了粪便 对环境的污染,起到了生物净化环境作用(.我们前期工作 发现,用猪粪饲养家蝇幼虫,从饲料残渣中提取的幼虫分泌物 对猪蛔虫卵发育有一定抑制作用(.为进一步探索该分泌物 中的活性物质是否为蝇幼虫固有表达及其作用成分和性质, 进行了本研究. 1材料与方法 1.1材料 1.1.1家蝇(Muscadomestica)为本实验室饲养传代,成蝇 以奶粉白糖饲养,幼虫以麦麸为饲料. 1.1.2蛔虫卵制备从屠宰场采集新鲜猪蛔虫雌性成虫.解 剖剪切阴门至子宫下段长约5cm,将子宫剖开后用生理盐水 冲洗蛔虫卵于平皿中,加5%氢氧化钠溶液浸泡30min,经水 洗离心数次后再加30%次氯酸钠,振摇20min,脱去虫卵的 *基金项目:国家自然科学基金(39970087);贵州省教育厅项目(黔 科通2003108) 作者单位:1.贵阳医学院寄生虫学教研室.贵阳550004;2.贵阳 医学院药学院 作者简介:国果(1975一),女.贵州六枝人,讲师,博士,研究方向: 昆虫免疫. 通讯作者:吴建伟 蛋白质膜,将其配成一定浓度虫卵液备用. 1.2方法 1.2.1家蝇幼虫分泌物的制备将3龄家蝇幼虫或饲养幼 虫后的麦麸残渣用适量蒸馏水浸泡4h,不断振摇,吸取浸液 10000r/min离心10min,得家蝇幼虫分泌物粗提液. 1.2.2硫酸胺分段盐析[9分别取上述制备的分泌物粗提 液,4?条件加入一定量硫酸胺进行分段盐析.分别取盐析上 清,0,30%,30%--50%,50%--80%盐析沉淀脱盐后制成虫 卵培养液,其内加入适量福尔马林防止细菌生长.设立生理 盐水或未培养幼虫的麦麸浸液为阴性对照. 1.2.3透析将上述家蝇幼虫分泌物粗提液分别加到截留 分子量为14KD的透析袋中对水透析过夜,取透析外液制成 虫卵培养液,同上设立阴性对照. 1.2.4分泌物对蛔虫卵发育影响的观察将蛔虫卵计数滴 入培养液中,使其虫卵含量达2,2.5×10个/ml,置于28? 温箱中培养,连续观察15d.每天定时取20l培养液滴于载 波片上,覆一盖片后在显微镜下观察至少300枚虫卵,虫 卵发育到各期的数量.取上述实验组中对猪蛔虫卵发育影响 最大的分泌物活性液进行以下实验. 1.2.5温度对分泌物活性的影响将分泌物活性液于40, 60,80,100?处理30min后,10000r/min离心10min,取上清液 培养蛔虫卵,定期观察虫卵发育情况,以不处理的样品为对照. 2结果 2.1分泌物粗提液不同盐析段沉淀对虫卵发育的影响2 个来源的家蝇幼虫分泌物经盐析处理后,各盐析段组分对蛔 虫卵发育的影响均相似.培养第3d,对照组,盐析上清液组, 盐析0,30%,30%,50%沉淀组虫卵发育至二细胞期,发育 中国公共卫生2008年1月第24卷第1期ChinJPublicHealthJan2008Vo1.24No.147 率均>85%,6d后虫卵进入桑椹胚期,10d发育成一期幼虫. 从各组虫卵发育率曲线图可见上述4组虫卵发育情况基本保 持一致,每天虫卵发育率经统计学检验,差异无统汁学意义 (P>0.05).50%,80%盐析沉淀及未经处理的粗提原液 中,虫卵发育率自培养第3d起与对照组比较,差异均有统计 学意义(P<0.01).且50%,80%沉淀培养液中,虫卵前7d 一 直处于无明显发育状态,至第8d后发育率才有所上升,后 续观察至20d虫卵也仅发育到桑椹胚期,到30d时才有34% 发育到幼虫期.提示家蝇幼虫分泌物经盐析后抑制猪蛔虫卵 发育的物质主要存在于50%,80%段盐析蛋白中. 2.2分泌物粗提液透析外液对虫卵发育的影响(图1)幼 虫饲料残渣浸提液透析外液和幼虫浸液透析外液均能明显抑 制蛔虫卵发育,而且可延迟虫卵发育7,9d,与对照组比较, 差异有统计学意义(P<0.O1). 100 —80 . 妞40 20 0 时间(d) 图1分泌物粗提液透析外液中蛔虫卵发育情况 2.3温度对分泌物活性的影响(图2)分泌物活性液经各 温度处理30min后,其虫卵发育情况与对照组基本相似,提 示温度对分泌物活性影响不大,是一种耐热物质. 一 瓣 妞 691215 时间(d) 对照 10? 60? 80? 1O0"12 图2分泌物活性液经不同温度处理后对蛔虫卵发育影响 3讨论 本研究结果显示,无论从饲料残渣还是家蝇幼虫浸液中 提取的分泌物对蛔虫卵发育均有抑制作用,提示家蝇幼虫不 管生活在何种环境中,均可表达有活性的抑制蛔虫卵发育的 物质.经分段盐析,阻碍猪蛔虫卵发育的物质主要存在于 50%,80%盐析沉淀中,且抑制虫卵发育作用强于粗提原液, 与抑菌试验的结果相符ClO3.提示盐析有一定的纯化作用,将 干扰的杂质除掉后分泌物的活性有所增加.而且高温对其活 性影响不大.用截留分子量为12×100D,14×100D的透析 欢迎 袋透析,透析外液显示抑制虫卵发育活性,且这种活性强于 50%,80%的盐析沉淀,推测分泌物中活性成分主要为分子 量小于或约14×100D左右的物质.幼虫浸提法提取的分泌 物活性较饲料残渣中的强,可能是该方法提取的分泌物杂质 较少.而饲料残渣中除幼虫分泌物外还含有许多麦麸等植物 蛋白,在一定程度上影响了活性物质的性能. 总体上看.经家蝇幼虫分泌物处理后的猪蛔虫卵,除了发 育周期明显延长外,虫卵发育率也明显降低,这在一定程度上 可以减少猪接触到感染期虫卵的机率,有助于减少猪蛔虫病 的发生.至于家蝇幼虫分泌物中抑制蛔虫卵发育的物质是何 种成分,与分泌物中抗菌成分是否为同一物质,其作用机制尚 需进一步研究.这对于家蝇幼虫在生态环境中的作用和综合 利用,生物合成或仿生合成新一代无公害农药,均有实用价 值. 参考文献 【1]KennedyTJ,BruerDJ,MarchiondoA,etal,Prevalenceofswine parasitesinmajorhogproducingareaoftheUnitedStates[J]A— griPract,1988,445—500. 【2]RhoadsML.FettererRH,UrbanJR,eta1.Cuticulmrcollagen synthesisbyascarissuumduringdevelopmentfromthethird—to fourth-larvalstage;identificationofapotentialchemotherapeutic agentwithanovelmechanismofaction.TEKTR—ANUnited StatesDepartmentofAgriculture[J].AgriculturalResearchSer— vice,2000,11:29, 【3]UrbanJR,JosephF,RasmussenT,eta1.Migrationanddevelop— mentofascarissuumlarvaeinerthrocebuspatas:modelforvis— cerallarvamigrantsinhumans.TEKTR—AN,UnitedStatesofA— griculture[J],AgriculturalResearchService,1998,8:31, [4]张文吉,明九雪,罗记台,等.从家蝇幼虫饲料残渣中分离提取 生物活性物质的研究[J].北京农业大学,1993,19(2):103 — 104, [5]张财兴,朱开建,杨亚东,等.舍蝇幼虫分泌物及血淋巴活性研 究[J].厦门大学:自然科学版,2001,40(6)1301—1305, [6]陈美,陈小麟,家蝇幼虫饲料残渣防治植物线虫的研究[J].厦 门大学,2003,42:810—814. 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