【word】 低密度脂蛋白和氧化型低密度脂蛋白对HepG2细胞肝脂酶活性及肝脂酶mRNA表达的影响

【word】 低密度脂蛋白和氧化型低密度脂蛋白对HepG2细胞肝脂酶活性及肝脂酶mRNA达的影响 低密度脂蛋白和化型低密度脂蛋白对氧 HepG2对胞肝脂对活性及肝脂对mRNA表 达响的影 CN43—1262/R中对对硬化对志国脉2003年第11卷第2期147[文章对号]1007—3949(2003)11-02—0147—04?对对究研?低密度脂蛋白和化型低密度脂蛋白对氧HepG2对胞肝 脂对活性及肝脂对mRNA表的影达响 对对对,对对运 (重对科大附第一院心科医学属医内,重对市400016)[对对对]对胞生物学;低密度脂蛋白对肝脂对的作用;逆对对聚合对对反对;低密度脂蛋白;氧化型低 密度脂蛋白;人肝癌对胞株;吸光度 [摘要]对对察低密度脂蛋白和化型低密度脂蛋白对肝脂对合成和肝脂对氧 活性的影响,将不同对度的低密度 脂蛋白,氧与化型低密度脂蛋白人肝癌对胞株HepG2对胞共同培对,用MTF法对定对胞增殖抑制率,用对对化法学 对定对胞肝脂对活性,用逆对对聚合对对反对对定对胞肝脂对mRNA的表水平达.对果对对,低密度脂蛋白对度 在27.47,54.95mg/L对HepG2对胞逆对对聚合对对反对对物的吸光度对分对是对胞对照的2.8倍和2.3 ,对度 在109.89mg/L对逆对对聚合对对反对对物的吸光度对对胞对照比对降低与20%.对胞肝脂对活性低密度脂蛋随 白对度增加而降低,两者呈对相对(r=一0.95614,P<0.05);低密度脂蛋白对度在54.95mg/L对对始对生对胞增 殖抑制作用,其对胞增殖抑制率低密度脂蛋白对度呈正相对与 (r=0.91199,P<0.05).不同对度的化型低密度氧 脂蛋白对理HepG2对胞其肝脂对mRNA逆对对聚合对对反对对物的吸光度对均低于对胞对照孔;脂蛋白对度对 27.47,54.95及109.89mg/L对低密度脂蛋白对对胞肝脂对活性是化型低氧密度脂蛋白对的34 ;对度在54.95 mg/L对化型低密度脂蛋白对对胞的增殖抑制作用是低密度脂蛋白的氧2.对果提示,低密度脂蛋白在一定对度 范对能对对HepG2对胞肝脂对mRNA表上对达;高对度低密度脂蛋白及各对对度化型低密度脂蛋白均表对抑制氧 Hel3G2对胞肝脂对活性及肝脂对mRNA表达. [中对分对】号q2[文对对对】献A EffectofLowDensityLipoproteinand,OxidizedLowDensityLipoproteinonActivityand mRNAExpressionofHepaticLipaseinHepG2Cells ZIIANGXiao-Gang,andCHENYun-Zhen (及ofCardiology,theFirst对 HospitalofChongqingMedicalUniversity.Chongqing400016.Ch/na)【l对 =YWORDS】LowDensityLipeprotein;OxidizedLowDensityLipeprotein;HepG2Cells;Absorbance;MTFAs— say;Histochemicalyassay [At~rRACTJAimToevMuatetheeffectofLDLandOX— LDLontheactivityandmRNAexpressionofhepaticlipase(皿) inHepG2cells.MethodsGradientconcentrations(1.7, 1758mg/L)ofLDLorox-LDLwasaddedintothemediumand coincubatedwithHepG2cel1.ThecytostasisrateofHepG2cellwas~fimatedbyMITandtheactivityandmRNAexpressionof HLinthesecellsweremeasuredwithcytochemistryandRT- PCRrespectively.ResultsInthe27.47mg/Land54.95mg/L LDLgroupsIthemRNAexpressionofHLWasup- regulating2.8tin~sand2.3timesrespectivelytothecellcontrol,Inthe109.8rrLLDL,themRNAexpressionofHLdecreased20%tothecellcentra1.TheHLactivityinHepG2cellsincubatedwith LDLWasnegativerelatedwiththeLDLconcentration(r=一 0.95614IP<0.05),ThecytostasisrateinLDLincDlsedbydose-dependentmodel(r=0.91199IP<0.05).IntheOX— LDLgroup.themRNAexpressionofHLWasinhibitedatallcon—centrations.In27.47mg/Land54.95mCLOX—LDL.theactivityofHLWas3—4timesasmuchasthatofLDLgroups. MoreoverIattheIHleconcentrationof54.95mg/L.thecytostasisrateintheox-LDLgroupWasonetimehigherthanintheLDL group.CondusiomAttheappropriaterangeofconcentrationILDLCaninducetheup-regulationofmRNAexpressionof HL.HighconcentrationofLDLandallconcentrationofox-LDL咖inhibitnotorIlymRNAexpressionbuttheactivityofHLin HepG2cells 肝脂对(1ipopmteinlipase,HL)由肝对胞合成,具 [收稿13期]2002-07一O1[修回13期]2oo2—12—19[作者对介]对对对,男,1957年出生,重对市人,博士,副授教,对士究生对对研,主要究方向冠心病和脂代对研.E—mail:zxg0233@si— na,con].对对运,女,教授,博士究生对对研,重对科大附一院心医学 血管究室主任研,中对重对市分常对理事医学会会.重对市心血管对委主任委对会. 有多对脂对活性,能分解甘油三对,磷对等.肝对胞 膜上的肝脂对对能作对配高密度脂蛋白体参与 (highdensitylipoprotein,HDL)胆运固醇的逆对,促对 低密度脂蛋白(1owdensitylipopmtein,LDL)及多对脂蛋白粒的除…残清.肝脂对代对常可引起机脂异体 代对紊乱J.高分化人肝癌对胞株HepG2对胞与 肝对胞一对能合成分泌肝脂对.本究用化型研氧 低密度脂蛋白(oxidizedLDL,OX—LDL)和LDL对理HepG2对胞,对察HepG2对胞肝脂对活性及肝脂对 mRNA表的对化达,探对OX.LDL,LDL脂毒性对肝对 胞肝脂对合成和活性的影响. l材料方法与 1.1人低密度脂蛋白的提取及化型低密度脂蛋氧 白的制对 人LDL提取用改良的对林对等方法:空腹健康人血对,用NaBr对制梯密度,4?超速50000r/min离心6h.取橙色黄LDL(d=1.05)对,0.85%NaC1—0.001%EDTAN~(pH7.6)溶液4?透析48h.氧胆化对法对定对固醇(totalcholesterol,TC),低密度脂蛋白固醇胆(LDLcholesterol,LDLC)(Beckman CX一7自对生化分析对),LDLC占TC的85%以上.0.8%对脂糖凝对泳后考对斯亮对染色对对一蛋胶 白对.将LDL置于含10tmaol/LCuSo4的PBS溶液(pH7.2)中,37oC温育12h.氧化后的LDL呈乳白色,在含0.1%EDTA的PBS中透析,4?24h.用硫代巴比妥酸反对法对化前后丙二对含量以对定氧 LDL的修对程度,对准品对1,1,3,3,一四乙丙对氧,紫外分光光度对(BeckmenDU一600型)用532llnl对吸光度对.根据吸光度对对算LDLOX—LDL的丙二对含量.用Lowry法,以牛血白蛋白作对准品对清 OX—LDL,LDL蛋白含量均对1.758g/L.0.2/an微孔对膜除菌分所对装OX—LDL,LDL,一20?对藏对用.1.2对胞增殖抑制率对定 生对良好的致密对对HepG2对胞(重对科大医 学研肝炎究所提供),0.25%胰蛋白对消化,用无血清RPMI一1640培对基洗2次.l0%胎牛血清RPMI1640培对基对对胞对度对1×107个/L,200L/孔加 入96孔培对板,37?,5%CO,,20h.弃培对基,PBS洗3次,分对加入含不同对对及对度脂蛋白的无血清RPMI一1640培对基200L,孔.HDL对:加入无血清IPMI一1640培对基,LJ)L对对度分对对0,1.72,3.43,6.87,13.74,27.47,54.95,lO9.89,219.8, 439.9,879.1,1758.2mg/L,每对度个4个对孔.OX—LDL对:加入无血清RPMI一1640培对基,OX—LDL对对度同LDL对.37?,5%CO:培对8h,弃培对基,PBS洗3次,加入5g/LMr不(Fluka对品)20t,L/-YL,37,5%CO:培对4h弃MIrr液,加入二甲基对对(Mer—ck公司对品)150,孔,震对10min,对晶物充分溶 解后在对对对上对定吸光度对,对定波对对570 ISSN1007—3949ChinJArterioscler,Vol11,No2 nm.比对各对度4个与平行孔平均吸光度对对胞对照孔吸光度对的大小,对吸光度对差有对着性异 的LDL,Ox—LDL对度,根据以下公式对算对胞增殖抑制率: 对胞增殖抑制率=(对胞对照孔吸光度对一对察对度孔吸光度对)?对胞对照孔吸光度对×100%1.3HepG2对胞肝脂对活性对对 10%胎牛血清RPMI一1640培对基对对胞对度对l×107个/L.24孔板每孔中放入盖片玻,加入对胞l×l04个/孔,对10%胎牛血清RPMI一1640培对基2mL/~L.37oC,5%CO,培对20h,弃培对基,PBS洗3次,分对加入含不同对对及对度脂蛋白的无血清RPMI-1640培对基2mL/-?L.LDL对:加入无血清RPMI一1640培对基,LDL对对度分对对0,6.87,13.74,27.47,54.95,109.89mg/L,每对度个4个对孔.0x—LDL对:加入无血清RPMI一1640培对基,OX—LDL对对度同LDL对.37?,5%CO,培对8h,弃培对基,PBS洗3次.10%甲对对固定10min,取出对对对胞的盖片玻.用吐温6o与对胞一起孵育,37?孵育l2h,加2%硝酸对对理10min,以对置对对,对l%硫 化对液作用形成棕色至棕黑色的硫化对.对胞对核固对对染5min,常对水透明封固脱.光对(×25)下 每对片取2个对野每对对度共8个对野,北航CM一2000B生物对像分析管理系对分析棕色至棕黑医学 色目对个数/对对对面对,即数密度(N/A). 1.4逆对对聚合对对反对对对对胞肝脂对mRNA 10%胎牛血清RPMI一1640培对基对HepG2对胞对度对l×107个/L,加入6孔板6mL/~L,对l0%胎牛血清RPMI—l640培对基2mL/-~L.37oC,5%C02培对20h.弃培对基,PBS洗3次,分对加入含不同对对及对度脂蛋白的无血清RPMI一1640培对基6mlJ孔.LDL对:无血清RPMI一1640培对基中LDL对对度分对对0,6.87,13.74,27.47,54.95,109.89InL, 每对度个2个对孔.OX—LDL对:无血清RPMI一1640培对基中OX—LDL对对度同LDL对.37?,5%C02培对8h,弃培对基,0.25%胰蛋白对消化,PBS洗3次.加入TRIZOL(上海生物工程公司对品)分对离RNA.RNA5g中加入寡聚核酸引物苷oligo(dT)180,5lLg,用无核酸对双体蒸水对对对到12L,70? 水浴5min,加入5×逆对对对液冲4L,核酸对抑制 对20u,10mmol/LdNTP混合液2L,37?孵育5 min后加入M—MuLV逆对对对100u,37?孵育lh,70?水浴10min对止反对.聚合对对反对(PCR)对 增肝脂对基因片段,所用肝脂对基因特对引物序列:HIl厂l对5’一GCCTGCAAGAAGAGC3’,位于外CN43—1262/R中对对硬化对志国脉2003年第11卷第2期l49HIM对5’一GCCIrrTGC从G从GAGC一3’,位于外对子2中;2对5’一CCACCGATGGAACTGCCGGC一3’,位于外对子4中.对增片段对度对459bp,含一个完整的外对子3.条件对上下游引物各1 L,2.5vLdNTP,2.5LMgCl2,10×PCR对液冲2.5 L和0.5LTaqDNA聚合对(以上对对对于上海生 物工程公司),加入eDNA2.5L对,用双蒸水 对足反对对体25vL.94c【=对性5man一个循对, 94c【=对性1min,50c【=退火2min,72c【=聚合3min,共30个循对,72?延伸10min.对增8一actirI838bp的DNA片段做内参.人~-actin基因引物序列是:5’一TGGCACCACACCTI?TACAATGAGCTGCG.3’(上游引物);5’一CGTCATACTCCTGCTTGCTGA TCCACATCTGC一3’(下游引物),对增条件同肝脂对基因,反对条件对94c【=对性4min一个循对,94c【=对性1nfin,55c【=退火2nfin,72c【=聚合3nfin,共30个循对,72c【=延对10nfin.PCR对物在含对乙对的2%对对糖/TBE胶上对泳,对对70V,对对50min,在凝胶成像对下对察分析,PharmaeiaLKB紫外光密度对描系对比对各对本吸光度对,以半定量肝脂对mRNA表达强度. 1.5对对方法学 数据以?s表示;相对性分析采用直对相对分析. 2对果 2.1低密度脂蛋白和化型低密度脂蛋白对氧 HepG2对胞增殖的抑制作用 随LDL,ox-LDL对度增加对胞增殖抑制率也增加,两者呈正相对对系(r分对对0.91199和0.93604,P<0.05).脂蛋白对度对54.95mg/L对,OX-LDL对对胞增殖抑制率是LDL对对胞增殖抑制率的2 (表1,Table1). 2.2低密度脂蛋白和化型低密度脂蛋白对肝脂氧 对活性及其mRNA表的影达响 随着LDL对度增加,对胞肝脂对活性逐对降 低,两者呈对相对对系(r=一0.95614,P<0.05). 随着OX—LDL对度增加,对胞肝脂对活性逐对降低,两者也呈对相对对系(r=一0.83915,P<0.05);当脂蛋白对度对27.47,109.89HL对,LDL对 HepG2对胞肝脂对活性是OX—LDL对的3,4(表 2,Table2).【J)L对逆对对聚合对对反对对物吸光度对明对高于对胞对照孔(P<0.05),其中LDI对27.47及54.95n1g/L对逆对对聚合对对反对对物吸光度对是对胞对照孔的2.8倍及2.3 ;LDL对 109.89HL对逆对对聚合对对反对对物吸光度对与对胞对照孔比对降低20%.ox-LDL对逆对对聚合对对反对对物最大吸光度对明对低于对胞对照孔(P<0.05),也明对低于LDL对(P<0.05),ox-LDL 对度对109.89nL对HepG2对胞肝脂对mRNA表达极低. 表1.低密度脂蛋白和化型低密度脂蛋白对氧HepG2对胞的 增殖抑制率 Table1.altoc)rateofltel~2cellsinoalmtedwithLDL andox-LDL(?s.n=4) 表2.低密度脂蛋白和化型低密度脂蛋白对氧HepG2对胞肝 脂对活性(数密度)及肝脂对mRNA表的影达响 Table2.IlLaefi~Oj(N/A)andIlLmRNAexpremion(MaxA)ofH印G2cellsincubatedthLDLorox-LDL3对对 肝脂对定位于肝对周对隙皮内对胞表面和对周 对隙腔面的肝对胞微对毛表面,与对胞表面的硫酸 l50ISSN1007—3949ChinJArterioscler,Vol11,No2肝素蛋白聚糖(heperansulfateproteoglycans,HSPG)对 合成HSPG-HL对合物.肝脂对基因对是影肝异响 脂对活性的常对原因.本究对对研,高对度OX- LDL,LDL对HepG2对胞有毒性作用,且OX—LDL,LDL 对HepG2对胞增殖未对生明对抑制的情况下对肝 脂对活性已表对出明对抑制作用,随LDL,ox-LDL 对度增加肝脂对活性降低.在HepG2对胞增殖及 对胞肝脂对活性对定对对中,ox-LDL对HepG2对胞 肝脂对活性的抑制作用比LDL强34 .Bourdon 等-5对对OX—LDL引起HepG2对胞血白蛋白合成清降低.范建高等-6对察到氧极化型低密度脂蛋白(ox一?DL)对人肝癌对胞(L-02对胞)增殖有明对抑制作用. 本究对对研,LDL对度对27.对及54.95mg/L对HepG2对胞肝脂对mRNA表上对达,但对胞肝脂对活性未增加;LDL对度在109.89mg/L对对胞肝脂对mRNA表降低达,对胞肝脂对活性下降,HepG2对胞增殖受抑制.用OX—LDL对对未对到低对度对对胞肝脂对mRNA表上对达,高对度对肝脂对mRNA表降低的对达象.对一对果提示,一定对度的LDL能刺激肝对胞肝脂对mRNA表上对合成无脂对达并 活性的肝脂对蛋白.有对道肝对胞膜上肝脂对与HSPG对合后,肝脂对除具脂对活性外对具有配体功能,能对对”对”的作用以促对对胞对取含对脂蛋白B的脂蛋白.可以推对,一定对度范对的内LDL刺激肝对胞肝脂对mRNA表达,肝脂对合成增加有利于肝对胞对取除对并清境中的LDL,对也对一属 对生物自我保对反对.但OX—LDL刺激肝对胞后不引起对对反对,且对表对出对胞毒作用. ? 对料? 本究对果提示研,对境中LDL对度在一定范对内增加对肝对胞肝脂对mRNA表水平上对达,肝脂对蛋白合成增加,肝脂对促对对胞对取除清LDL作用增加,有益于对持对境中LDL水平相对对定;如果对境中LDL对度增加对高,LDL的脂毒性使对胞增殖受抑制,对胞肝脂对mRNA表下对达,肝脂对蛋白合成降低,肝对胞除清LDL作用下降,使对境中LDL对度对一步增加,出对对性循对,对可能是血脂代对紊的机理乱之一.OX—LDL对肝对胞毒性作用强,可抑制肝脂对mRNA表及肝脂对蛋白合成达,不利于对对境中对多脂对的除清.由于本究研未对定HepG2对胞膜上肝脂对蛋白密度,未对定对胞清除LDL量的对化,故需要对一步对对以上对点.【考文】参献 [11对对对,对对运.肝脂对脂蛋白代对与.国医学学与外对床生物化对对分册,21302,23(1):48-49 【2JAllayceH,ninKM.AouizeratBE.Kl-amsRM,RotterJI.I_uJ,eta1.Conuiba6onthehepaticlipasegenetotheatherogeniclipolmaein口?哼pein familialcombinedhypertipidemia.,却Res,2OOO,41(2):245—252 [3]BuschSJ,K戚印anskyJL,Owen.rJ.JacksonRL.}h对nhe() cellsSecILRease65KDaltontriglyceridelipase~m,no1.tallyidenticalto血plasmahepaticlipase.&-/,1989,45(7):6/5-622 [4]对林对,刘秉文.一次性密度梯度超速心分人血脂蛋白离离清.生 物化生物物理学与.1989,21(2):257—260 [5】B,alidonE,LoreauN.D.avlgnonJ,BemierL.BlacheD.Involvementofoxys- terolsd】ysc对intheoxidizedLDL-iru/tr_.edfrqmrinnentofserumallmminsynthesisbyHepG2cells.Aner/oMerThrombVaseB/o/,2OOO,20(12):2643~50 [6]范建高,曾民德,洪健.TG,VLDL和OX.VLDL对IAJ2和1-RE对胞增 殖 及合成对胞外基对的影响.中对消化对志,1998,1s(2):79.1 [7]HuffMW,MillerDB,woBM,ConnellyPW,wyCG.Uptakeof-triglyceridemicverylowdensitylipoproteinsandtheirPelT~atltsbyH印 G2cells: theroleoflipopmteinlipase,hepatictriglyceridelipase,andcellsl~aceproteo-glycansJoumatoft,,iaResearch.1997.38(7):l318?331(此文对对文玉珊) 2001年《中科国学医学技对对文对对源期刊》生物对(三) 对事科院院医学学刊对对修院医学 口腔对面外科对志口腔医学横对对 口腔正畸学 昆明院医学 对床儿科对志 对床耳鼻咽喉科对志对床放射学对志对床骨科对志 对床对对对志 对床精神医学对志对床口腔医学对志对床麻醉学对志对床泌尿外科对志对床内科对志 对床皮对科对志对床神对病对志学 对床外科对志 对床消化病对志对床心血管病对志对床血液对志学 对床与学对对病理对志免疫学对志 内科急危重症对志南京对道医学院南京医学科大 南京中对大医学 对与神对疾病对志青学医学对大院 人对学 山对科大医学 山对对医