Nogo（N-18）在大鼠海马及大脑皮质中分布和发育的免疫组织化学研究

Nogo（N-18）在大鼠海马及大脑皮质中分布和发育的免疫组织化学研究 Nogo(N-18)在大鼠海马及大脑皮质中分布 和发育的免疫组织化学研究 第34卷第3期 2003年6月 解剖 ACTAANATOMICASINICA Vo1.34.No.3 Jun.2003 Nogo(N.18)在大鼠海马及大脑皮质中分布和 发育的免疫组织化学研究 鄂玲玲周长满杨磊 (1.北京军医学院解剖学教研室,-iL京100071;2.北京大学基础医学院解剖学-q组织学胚胎学系,北京100083) [摘要]目的观察Nogo(N—l8)在成年大鼠,乳鼠和胎鼠海马及大脑皮质中的分布规律,探讨其存在的意义. 方法采用抗Nogo(N.18)多克隆抗体免疫组织化学链霉卵白素.过氧化物酶SP(slreptavidinperoxidase,SP)法.结 果成年大鼠海马以及大脑皮质神经元胞核Nogo(N.18)免疫反应呈强阳性,胞浆和突起的反应较弱,而乳鼠和胎 鼠海马及大脑皮质神经元Nogo(N.I8)免疫反应阳性产物只存在于突起和胞浆中.结论Nogo(N一18)免疫反应阳 性神经元广泛分布于成年大鼠,乳鼠和胎鼠海马及大脑皮质,其生物学意义有待探讨. [关键词]Nogo;免疫组织化学;海马;大脑皮质;大鼠 [中图分类号]R322.81[文献标识码]A[文章编号]0529.1356(2003)03—298 DISTRIBUTIONANDDEVELOPMENTOFNogo(N-18) IMMUNOREACTIVITYINTHEHIPPOCAMPUSAND CEREBRALCORTEXOFRAT ELing.1ing.. ZHOUChang-mall.,. YANGLei2 (』.DepartmentofAmttomy,BeltingMedicalCollegeofPM,Bering100071,Chimt; 2.DepartmentofAmttomy,PekingUniversityHealthScienceCentre,Bering100083,China) [Abstract]ObjectiveThedistributivefeatureofNogo(N-18)inthehippocampusandcerebralcodexoftheratswas observedinordertorevealthesignificanceofNogo(N一 18)expressionintheseregions.MethodsNogo(N-18)antiserum immunohistochemicalSP(streptavidinperoxidase,SP)stainingtechniquewasusedinthepresentstudy.ResultsThepositive Nogo(N.18)immunoreactivitywasverystronginneuronalnucleiofhippocampusandcerebralcoriexofadultrat,butweakerin cellbodiesandprocesses.Incontrast,infetalandneonatalrat,hippocampusandcerebralcortexneuronalbodiesandprocesses werepositivefortheNogo(N一 18),butneuronalnucleiwasnegative.ConclusionNogo(N-18)?containingneuronsarewidely distributedinthehippocampusandcerebralcodexofadultandfetalandneonatalrats. [Keywords]Nogo;Immun0hist0chemistry;Hippocampus;Cerebralcodex;Rat 哺乳动物外周神经损伤后有再生能力,但中枢 神经系统损伤后则不能再生.人们普遍认为其原因 之一是与髓鞘抑制因子的存在有关?.有报道说 中枢神经系统中某些种属的神经纤维可以在外周神 经移植物中延伸相当长的距离.Schwab等通过 对中枢和外周的髓鞘对比发现中枢神经蛋白选择性 地抑制神经突起的生长.研究发现分子量为35kD [收稿日期]2002一O1—29[修回日期]2002—06—13 [基金项目]全军医学科研基金杰出人才项目(O1JO18),北京 大学"985"行动重大项目(707—689143) [作者简介]鄂玲玲(1971一),女(汉族),河南人,实验师 *通讯作者(Towhomcorrespondenceshouldbeaddressed) (NI35)和250kD(N1250)的蛋白质有很强的抑制神经 突起再生的作用.编码这种抑制性蛋白的是Nogo 基因,其特异性抗体IN一1已被制备,Nogo有3个异 构体:N0go—A,Nogo—B,Nogo—C.Chen等克隆了 Nogo-A基因,并证明了Nogo—A有内质网膜定位信 号.NogoA是一种神经突起生长抑制因子,并由少 突胶质细胞产生.近来Chen发现Nogo—A不仅在 少突胶质细胞,而JL在脑,脊髓,发育神经组织及外 周神经节内其他神经元中都有NogomRNA达. 本实验采用免疫组织化学的方法,观察Nogo(N一18) 在成年大鼠,乳鼠及胎鼠的海马和大脑皮质中的分 布 鄂玲玲等.Nogo(N-l8)在大鼠海马及大脑皮质中分布和发育的免疫组织化学研究 '299 和方法 1.动物和取材 成年雄性Wistar大鼠(200,210g),新生3d的 乳鼠和孕19d的胎鼠各5只(由军事医学科学院动 物中心提供).麻醉后经左心室,升主动脉依次灌注 生理盐水200ml,4%多聚甲醛,0.1mol/L磷酸盐缓 冲液(PBS,Ph7.4)300ml,分别取脑组织浸于4%多 聚甲醛中后固定,振动切片机进行冠状切片(片厚 40Mm). 2.免疫组织化学染色 成鼠,乳鼠和胎鼠切片各分为实验组和对照组, 分别进行免疫组织化学染色,步骤如下:切片分别经 0.3%H,0,和3%正常免血清孵育处理后,实验组 切片滴加羊抗鼠Nogo(N一18)血清(1:100,Santa),湿 盒中室温孵育24h后,依次用链霉卵白素一过氧化物 酶(streptavidin,SP)免疫试剂盒中生物素标记的兔抗 羊IgG(1:200,Vector)和辣根酶标记链霉卵白素工作 ?孵育处理;0.05%DAB一0.01%H2O一0.01 液37 mol/LPBS呈色.各步骤之问均用0.01mol/LPBS充 分洗涤.然后将切片裱于经明胶处理的载玻片上, 常规脱水,透明,封片.对照组取一套与实验组相邻 的切片分别做:(1)空白对照实验:以0.01mol/LPBS 代替一抗血清进行免疫组织化学染色;(2)替代实 验,以与一抗血清同浓度的正常兔血清代替一抗血 清进行免疫组织化学反应. 结果 1.对照组 空白对照实验和正常血清替代实验免疫组织化 学反应均为阴性. 2.实验组 2.1成年大鼠:实验组切片经Nogo(N一18)免疫组 织化学染色后,在成年大鼠海马,齿状回(图【A)及 大脑皮质(图1B)神经元中出现极强的Nogo(N一18) 免疫反应性,阳性物质呈棕黄色.海马的锥体细胞 层,多形层及齿状回的颗粒细胞层和多形层细胞高 倍显微镜下可见Nogo(N一18)免疫反应阳性物质不仅 存在于神经元胞浆,突起内,而且存在于神经元胞 核,且胞核免疫阳性反应最强(图1D,E,F,G).分 子层散在分布着个别的阳性细胞.海马CA1(图 1D),CA2(图1E),CA3(图1F),CA4(图1G)区及齿状 回(图1G)的免疫阳性细胞均密集且着色较深,而海 马,齿状回其他部位的Nogo(N一18)阳性细胞则呈弥 散性的分布.大脑皮质的分子层,外颗粒层,外锥体 细胞层,内颗粒层,内锥体细胞层(图1C),多形细胞 层的神经元中均有极强的Nogo(N一18)免疫反应,而 胞核免疫反应最强,着色最深(图1B,C). 2.2乳鼠:实验组切片经Nogo(N.18)免疫组织化 学染色后,在乳鼠海马,齿状回(图2A,D)及大脑皮 质(图2B,C)中神经元高度密集,出现较强的Nogo (N.18)免疫反应阳性,阳性物质呈棕黄色.高倍显 微镜下可见乳鼠海马CA1(图2D)区和大脑皮质(图 2c)中Nogo(N一18)免疫反应阳性物质仅存在于神经 元胞浆及突起内,而胞核为阴性. 2.3胎鼠:实验组切片经Nogo(N一18)免疫组织化 学染色后,在胎鼠海马(图3A)及大脑皮质(图3B) 中神经元出现较弱的Nogo(N一18)免疫反应阳性,阳 性物质呈棕黄色,神经元高度密集,互相重叠.高倍 显微镜下可见胎鼠大脑皮质中Nogo(N一18)免疫反应 阳性物质出现在神经元胞浆及突起内,而胞核为阴 性(图3B).成年大鼠,乳鼠,胎鼠海马与大脑皮质 内Nogo(N一18)的免疫反应性的相对强度见附表. 附表大鼠海马和大脑皮质中的Nogo(N-l8)免疫反应性 TableNogo(N—l8)immunoreactivityinhippocampusandcerebralcoNexoftherat 注:Nogo(N一18)在大鼠海马和大脑皮质神经元中表达的摘要.+.弱;++.较强;+++. 强;一.无表达. Note:SummaryofNogoproteinexpressioninthehippocampusandcerebralcodexofrat.Exp ressionisdenotedas:+,weak;++,medium;+++,strong expression;一,notdetectable. 解剖34卷,3期 讨论 Nogo是少突胶质细胞特异性的Rtn家族的成 员,其特定的功能域对神经突起生长有抑制作用. Nogo蛋白在N末端没有疏水的信号序列,而C末端 有两个长的疏水序列(35个和36个氨基酸),两个 疏水序列间有一位于胞外的由66个氨基酸残基组 成的胞间/突起间结构域,而其N端和C端位于胞 内.Josephson"..最新研究表明,NogomRNA广泛分 布于胚胎,发育,成年的大鼠海马,大脑皮层神经元 胞浆,突起近端内.本实验结果显示,乳鼠和胎鼠海 马及大脑皮质中的神经元胞浆及突起内出现Nogo (N一18)免疫反应产物,与上述Josephson报道一致. PSORT?(http:?psort.nibb.ac.iP)表明,Nogo—A 的氨基酸序列中包含有核定位信号,因此推测Nogo— A可能表达于神经元核内.Jin初步报道Nogo—A (NI250)在小脑Purkinje细胞,大脑皮质细胞和脊髓 运动神经元的细胞核内有表达.本结果显示,成年 大鼠海马及大脑皮质神经元不仅胞浆,突起内有 Nogo(N一18)蛋白的表达,而且胞核内也出现了极强 的Nogo(N一18)免疫反应,与上述Jin报道相一致,证 实了PSORT?的分析.但乳鼠和胎鼠海马及大脑 皮质中的神经元胞核内Nogo(N一18)蛋白表达为阴 性,这与Jin的报道和PSORT?的分析不一致,这可 能是因为乳鼠和胎鼠海马及大脑皮质中神经元的胞 核内Nogo(N一18)蛋白表达量很低,本实验方法,未能 检测到;也可能是因为在大鼠发育阶段胞核内不表 达Nogo(N一18)蛋白,而只有在成年以后胞核内才出 现Nogo(N一18)蛋白.Nogo(N一18)蛋白的这种阶段性 表达与神经纤维生长,发育有什么关系?其机制是 什么?尚需进一步研究. Nogo—A是一种公认的中枢神经突起生长抑制 蛋白,传统上认为仅被中枢神经的少突胶质细胞表 达,星形胶质细胞和周围神经系统的施万细胞不表 达,其特异性抗体IN一1具有促进中枢神经系统损伤 后再生的作用?.那么Nogo(N一18)在大鼠海马及 大脑皮质神经元内的表达有什么意义呢?是否与抑 制神经突起生长有关呢?它又是怎样实现抑制神经 突起生长的功能呢?众所周知,哺乳动物外周神经 损伤后有较强的再生能力,而中枢神经系统损伤后 却不能再生.Josephson报道:NogomRNA也表达 于胎鼠,新生鼠及成鼠背根节,三叉神经节,交感神 经节,颈上节.为什么中枢神经系统和周围神经系 统神经元内均有Nogo表达,可两者损伤后再生能力 却有如此大的差别呢?是否可以假设Nogo蛋白的 神经突起抑制作用是胶质细胞和神经元内的Nogo 蛋白共同作用的结果?因此,Nogo在抑制神经突起 生长时其结构域所发挥作用的分子机制还需要更加 深人的探索.假如这种抑制作用可被克服,是否可 以实现神经突起的再生?这一问题对解决中枢神经 系统再生之谜也许会有重要的意义. 参考文献 [1]McKerracherL,DavidS,JacksonDL,eta1.Identificationofmyelin. associatedglycoproteinasamajormyelin—derivedinhibitorofneurite growth[JJ.Neuron,1994,13(4):805—8l1. [2JBregmanBS,Kunkel—BagdenE,SchnellL,eta1.Recoveryfromspinal cordinjurymediatedbyantibodiestoneuritegrowthinhibitorslJJ. Nature,1995,378(6556):498501. 13jCaiD,ShenY,DeBellardM,eta1.Priorexposuretoneurotrophins blocksinhibitionofaxooalregenerationbyMAGandmyelinviaacAMP— dependentmechanismlJj.Neuron,1999,22(】):89—1O1. 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Explanationoffigures Fig.1ANogoirmnunoreactivitypositiveneuronsinthehippocampusand dentategyrusofadultrat.Hip,hippocampusDG,dentategyrus ×40 Fig.1BNogoirmnunoreactivitypositiveneuronsinthecerebralcortexof adultrat.×100 Fig.ICHighermagnificationphotomicrographofrectangleinFig.IB. showingNogoimmun0reactivitvpositivepyramidatcellinthe cerebralcortexofadultrat.Arrowshowpositivepyramidatcell ×40O Fig.1D,E,F,GNogoimmunoreaetivitypositiveneuronsintheCA1,CA2, CA3,CA4ofhippocampusanddentategymsofadultrat.CAI一4, CA14ofhippocampusDG,dentategymsarrowshowpositive neuronsD,E:×4OOF:×200G:×1oo Fig.2ANogoimmunoreactivitypositiveneuronsinthehippocampusand dentategymsofneonatalrat.Hip,hippocampusDG,dentate gyms×40 Fig.2BNogoimmunorea(:tivitypositiveneuronsinthecerebralcortexof neonatalrat.×200 Fig.2CHighermagnificationphotomicrographofrectangleinFig.2B, showingNogoimmunoreactivitypositiveneuronsinthecerebral cortexofneonatalrat.Arrowshowpositiveneurons×400 Fig.2DNogoimmunorea('tivitypositiveneuronsintheCA1ofhippocampus ofneonatalrat.CA1.CA1ofhippocampusalTowshowpositive neuronsx400 Fig.3ANogoimmunoreactivitypositiveneuronsinthehippocampusof embryorat.Hip,hippocampusx40 Fig.3BNogoimmunoreactivitypositiveneuronsinthecerebralcortexof embryorat.Arrowshowpositiveneuronsx400 (编辑郭崇洁)