提高葡萄酒酿酒酵母Saccharomyces ellipsoideus不对称还原合成R扁桃酸效率研究（可编辑）

提高葡萄酒酿酒酵母Saccharomyces ellipsoideus不对称还原合成R扁桃酸效率研究（可编辑） 提高葡萄酒酿酒酵母Saccharomyces ellipsoideus不 对称还原合成R扁桃酸效率研究 江南大学 硕士学位论文 提高葡萄酒酿酒酵母(Saccharomyces ellipsoideus)不对称 还原合成(R)-扁桃酸效率的研究 姓名:韩莹 申请学位级别:硕士 专业:发酵工程 指导教师:徐岩 20090601摘要 摘 要 光学纯扁桃酸是一种重要的手性药物中间体,被广泛应用于多种手性药物的 合成, 国际市场需求增长较快。利用生物法制备光学纯扁桃酸具有反应条件温和、 反应速率快、 得率高、产品光学纯度高和环境友好等优点,已经成为国内研究的热点。本 研究以葡萄 酿酒酵母 催化不对称还原制备僻一扁桃酸一为研 究对象,对提高反应过程的底物浓度、生物催化剂的重复使用进行研究,并在 小试 反应罐水平实现生物法制备尺.。旨在探索出一条生物催化制备.的途径。 具体内容包括: 对利用分批补料提高不对称还原合成尺.扁桃酸底物浓度进行了研究,结果表 明,利用分批补料可以显著降低底物对反应过程的抑制,提高反应的底物浓度。本研究 在单因素试验的基础上,采用响应面因素水平的中心组合设计研究了补料次数、转 化时间、初始底物浓度诸因素共同作用对产物浓度的影响,确定最佳组合是补料次数 次、转化时间 、初始浓度. /,得出的最高产物浓度为. /,..值也达到 了%。比优化前提高了将近%; 在应用原位吸附技术来提高反应的底物浓度的研究表明:在反应体系中添加 大孔吸附树脂,可以显著降低底物对反应过程的抑制,提高反应的底物浓度。 在建立了树脂最适添加量的基础上,通过最适添加树脂量将溶液中底物总浓度控制在最 适水平,从而实现高底物浓度、快速反应。在 /初始底物浓度转化体系中加入. 后,反应 ,产物但.的产率和..值分别为.%和%,比 树脂,平衡 优化前反应的底物浓度提高了将近%。对添加树脂后的反应体系进行了温 度、、 ., /,在此条件下, 和转速的优化。得出反应的最适条件为?, / 底物浓度下的反应时间缩短了 。最终发现将两种结合,在添加吸附树脂 的体系 中进行分批补料是最高效的方法,将底物浓度提高到 并且产率达到了 /,反应 .%,..值为%,而且菌体重复使用性能很好; / 在 发酵罐上进行工艺放大实验中,在 /底物浓度,不通气, 的搅拌转速,?,:的菌体量的条件下,产率及..值分别可达%和%。 关键词:酿酒酵母;不对称还原;例扁桃酸;底产物抑制;原位吸附;生物 催化剂稳定性; ,. 似,. . , , ,. ? 一一 . .., :. .. , . , /. . /。 . . , . , ,... . ?/. ,%.. 僻一 .%. ,, . , ., /.. / . / /. .% 一 ?. . ./ ‖, .. % %. 俾. ; ;僻 : ;; ; ; 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是拳人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果.尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 期: 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定: 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允 许论文被查阅和借阅,可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文, 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致. 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签 名: 导师签名: 哆 照曼 \ / 日 期: ./ 第一章引言 第一章引言 .立题意义 手性化合物在人们生活中具有重要作用,由于两个对映体在药理、毒理及功能作用 等各方面均有所不同,制备光学纯的手性模块化合物在医药、农业、材料,以及环保等 领域都具有广泛的价值【】。手性药物是当前国内外新药研究和开发的热点,手性、手性 技术成了新药研制中的重要关键词。据不完全统计,世界上市销售的药物总数为 种,天然及半合成药物种,其中手性药物为种;合成药物种,其中手性 药物种。而且手性药物所占比例还在逐年上升,预计到年全球上市新药将有 %为单一异构体。据报道,手性药物年销售增长率超过%,达到亿美 元,估计年销售额可达亿美元。在市场需求及巨大利润的推动下,世界各 大制药公司纷纷将注意力转向手性药物的开发,形成手性技术的热潮。 自世纪年代,欧洲发生的“反应停事件后【】,人们逐渐认识到手性药物中 的两个对映体在人体内的药理活性、代谢过程及毒性存在着显著的差异。年,美国 食品及药物管理局对具有手性分子的药物提出了光学性医药品的管理要求和政 策,规定提出含手性分子药物最好以单一异构体形式申报,对用消旋体申报 的药物,需 提供各对映体及消旋体分别进行的药理和毒性试验报告,否则会被认定含有%的杂质 而遇到麻烦,难以批准。并且随着环保要求越来越严格,减少废料的排放就要求减少不 必要异构体的生产,产品最好以单一异构体形式出现。 光学活性的【.羟基酸是指手性碳上带有羟基同时带有羧基的一类化合物,是重要的 手性“砌块,可用于不对称合成大量生物活性分子【】。在这类化合物中,光学纯扁桃酸 在商业角度上被认为是最重要的代表。扁桃酸又称.羟基苯乙酸、苯乙醇酸、苦杏仁酸, 其分子结构式如下: 其中,单一对映体尺.扁桃酸是一种重要的手性药物中间体,被广泛应用于多种光 学活性药物的合成,如半合成青霉素和头孢菌素等抗生素【,、减肥药物【、抗肿瘤药物 、农药【】、以及其他药物‘, ,而其本身也被誉为“万能’’拆分剂,广泛应用于各种手 性化合物的光学拆分。 由于其应用非常广泛,国际市场需求约以年均%左右增长【,市场潜力非常巨大, 国际上已有部分公司能够合成光学纯扁桃酸【,但还不能满足需求。目前国内已有部分 厂家能生产消旋体扁桃酸,但还没有规模化生产单一对映体的报道,因此,加快单一对 映体扁桃酸的研究开发,打破国外公司对手性产品的市场垄断、形成适合于我国国情的 工业生产方法迫在眉睫。同时,通过开发出新的生产工艺,研究出用于拆分扁桃酸和其江南大学硕士学位论文 他手性化合物的专用酶源和拆分方法,拓宽光学活性化合物的生产范围,从多方面 多层次探寻影响拆分专用酶源的因素,不仅对满足我国光学活性产品市场的需要具有实 际意义,也对解决手性技术领域存在的重大问题具有重要的理论指导意义。 .国内外研究进展 .国内外研究进展 ..国际上制备.扁桃酸的研究现状 由于光学纯扁桃酸在众多领域内的广泛应用,其重要性为大家所共知,国内外已有 许多学者尝试了多种途径来制备,概括起来主要包含三类:即色谱法、化学法和生物转 化法。 其中,制备手性色谱柱可以直接拆分扁桃酸对映体】,具有快速、产品纯度高 和 方法简便等优点,也有需应用手性分离介质、处理量小和成本高等缺点,往往仅限于检 测及实验室制备。虽然也有利用手性制备柱生产光学纯扁桃酸的报道,但其生产成本昂 贵,年生产量还不到吨级,无法实现规模化生产。 化学拆分法主要是利用手性拆分剂与扁桃酸两种对映体形成非对映体盐类增加物 理性质差异,然后将结晶分离。目前,国内外报道用于拆分扁桃酸的手性试剂有主要有 麻黄碱、【.甲基苄胺、辛可宁以及苯甘氨酸丁酯等】,其反应过程见图示.,但这 种方法有严重的局限性,如产率不高、产物光学纯度不够高、手性拆分剂价格昂贵、拆 分剂受药品管制、有一定毒性、环境不友好等等。 ? 一十 尼.一/ 图一回一甲基苄胺拆分外消旋局桃酸.? ,回 研? 生物转化,又叫生物催化,即利用某种生物材料主要是酶或微生物来催化进行 某种化学反应,目前生物催化在化学合成工业中的运用呈现出非常显著的发 展趋势 口。。应用于手性技术的主要是选择性生物催化。由于生物酶对底物有高度的立体选择 性,不仅有化学选择性和非对映异构体选择性,并且有严格的区域选择性、面选择性和 对映异构体选择性。可直接将化学合成的外消旋衍生物、前体或潜手性化合物转化成单 第一章引言 一对映异构体的光学活性产物。生物催化的优点还有:反应条件温和常温、常压,设 备简单,生产安全,反应速率快,反应步骤少,副反应少,收率高,产品光学纯度高, 环境友好等。符合世纪“绿色化学的要求,被认为是手性化合物生产取得突破的 关健技术。正因为此,利用生物催化法制备光学纯扁桃酸成为国内外研究的热点。 ..生物法制备光学纯扁桃酸的主要途径 目前,根据反应途径及作用特点,生物法制备俾.扁桃酸的方法大致可分为三类: 动力学拆分,不对称转化和去消旋作用。动力学拆分以扁桃酸及其衍生物的外消旋体为 底物,反应只作用于其中某一对映体,所得光学纯对映体的产率不高于%,如 脂肪酶 催化不对称转酯化、水解,腈水解酶不对称水解,氧化还原酶催化不对称氧化还原反应 等;不对称转化以潜手性化合物为底物,经转化得到光学纯的产物,如还原酶不对称还 原苯甲酰甲酸为尺一扁桃酸;去消旋作用以外消旋体为底物,将其中某一对映体转化为 另一对映体,以得到光学纯的产物,产率高于%,如微生物立体选择性转化。国际上 已报道的制备俾.扁桃酸途径见图.。弋 ? 图各种制备固.扁桃酸途径 .? 具体反应途径如下: 途径: 】报道了利用脂肪酶不对称水解外消旋扁桃酸甲酯得到 产物俾.扁桃酸,转化率为%时光学纯度可达%..,反应途径如图.。 江南大学硕士学位论文 八一足. 固 .. 图脂肪酶不对称水解扁桃酸甲酯制备僻一扁桃酸 .? 一途径: 等‘利用“’’脂肪酶催化回.扁桃酸与乙酸乙烯酯发 生转酯化反应,通过柱层析分离得到.扁桃酸,光学纯度大于%..,反应途径见 图 .。 ................................................................. ..............?? 励一 尼. ’ 图脂肪酶转酯化制备俾扁桃酸 “’’ .途径: 等叫以外消旋扁桃腈为底物,利用筛选出的腈水解酶不对称水解, 获得似.扁桃酸,转化率.%,光学纯度大于%..,反应途径如图。 足 ?一 图腈水解酶不对称水解制备.扁桃酸 一 .途径: 等【】利用筛选出的菌株不对称氧化,一苯 醇得到.扁桃酸,但氧化过程副产物较多,给分离纯化带来了困难,产物得 率%, 光学纯度%..,反应途径见图。 : ;‘...,. 冠‘?一一,?/一 图不对称氧化法制备固.扁桃酸 . 一途径: 苯甲酰甲酸还原酶, 等【】利用 在添加辅酶的情况下,不对称还原苯甲酰甲酸为.扁桃酸,产物光学纯度达 %..,反应途径见图.。 第一章引言 。。 / ? 六固一 图.不对称还原苯甲酰甲酸制备黔扁桃酸 .途径: 等尝试了耦合氧化还原反应来制备尺.扁桃酸,利用 不对称氧化两一扁桃酸为苯甲酰甲酸,再加入辅酶,用 细胞破碎后粗酶液还原苯甲酰甲酸为俾.扁桃酸,最终 收率可大于%,但由于需要辅酶参与,反应过程繁琐,两种转化过程对体系要 求不同, 操作条件难以控制,还处于探索阶段,反应途径见图.。 鼢删括嗽?州 旷删警 图双菌氧化还原法制备肛扁桃酸 .? 一 途径:微生物不对称还原法掣】利用 苯甲酰甲酸还原酶,在添加辅酶的情况下,不对称还原苯甲酰甲酸为俾.扁桃 酸, 产物光学纯度达%..,反应途径见图。 。。 / ? 六 劢一 图.不对称还原苯甲酰甲酸制备.扁桃酸. 僻 微生物不对称还原法是指利用微生物体内具有立体选择性的酶将潜手性化合物还 原为单一对映体的过程。其理论产率可以达到%;具有操作简单,理论产率高等优 点,缺点是此过程需要辅酶的参与。】以上几种制备光学纯扁桃酸的方法的具体比较 如表.所示。根据比较可以知道微生物不对称还原法是一种比较好的方法,本研究就 是在已经选育出的一株不对称还原合成.扁桃酸的菌株上进行的研究。 江南大学硕士学位论文 表.生物法制备光学纯扁桃酸的方法比较..不对称还原法生产尺.扁桃酸的国内外研究进展 自从 年 .了】等用活性干酵母不对称还原苯乙酮酸甲酯生产.扁 桃酸甲酯以来,近年人们对此途径的研究就没有停止过。国内外利用不对称还原法 生产.扁桃酸的研究进展如下表.,从表中可以看出虽然国内外学者一直对此 途径进 行研究,但是并没有工业化生产的报道。其主要原因是底物浓度较低,转化速度慢,导 致催化的时空产率不能满足工业化的要求。 表近几年国内外生产僻扁桃酸的研究水平 生::兰垒呈翌璺旦宝璺竖皇呈翌 翌垒坚竺翌竖垦:垒坠翌翌呈坐垒垡 主要研究者和研 课题组 菌种 主要研究内容 底物浓度 究时间 ..影响微生物全细胞不对称还原制备.扁桃酸生产的因素 第一章引言 囤一囤 圉一防姒 图利用全细胞葡萄酒酿酒酵母制备肛扁桃酸 . 利用全细胞制备尺.扁桃酸途径如图.所示,从上游菌体发酵到全细胞转化,再 到下游产物的提取。利用全细胞生物法制备俾.扁桃酸具有很多优势,如全细胞体系不 需要添加辅酶或是辅酶循环体系,便于操作,催化剂稳定等。然而生物催化体系中存在 一些共同问题,如高浓度底物产物对反应的抑制和对菌体的毒害,以及产物 的降解,下 游提取困难等,这使得反应产率低,催化剂利用率低,生产成本过高。 据报道,生物催化反应要在工业生产上经济可行,条件之一是其反应完成后的产物 浓度至少要达到 /至 。目前全细胞不对称还原制备僻.在产物光学 纯度%以上的水平下的初始反应底物浓度为 /。初始反应底物浓度过低主要原因 是菌体对底产物的耐受能力有限,当接触菌体的底产物达到一定浓度时,菌体受到 毒害,反应受到抑制。 .生物催化过程提高反应底物浓度促进时空产率 ..生物催化过程时空产率低的原因 生物催化过程中,造成较低产率有几个方面的原因。生物催化过程很多时候底 产物为有机物,其对生物催化剂有一定的毒害,当其浓度达到或超过一定浓度时,可能 造成催化剂钝化、酶失活等问题,从而造成反应速率下降甚至停止;另一方面,很多底 产物均为水不溶性,因此限制了催化剂在水相体系中对它们的作用,从而极大地限制了 其反应;其次,随着反应向生成产物方向的进行,产物浓度的增加使得向生成 产物方向 逆反应方向平衡增加;造成反应速率下降甚至停止。 ..生物催化过程提高产率的方法 底物供给策略是通过控制与催化剂直接接触的底物浓度来达到提高反应速率从而 提高总产率的一种手段。这种策略有个依据。其一,当底物达到一定浓度时,其对催 化剂造成毒害或是对酶造成抑制,因此能将底物浓度控制在这个范围以下时将会减少毒 害和抑制;其二,对于一些生物催化反应,溶解在反应体系中的底物浓度越低,催化剂 选择性越高,因此通过控制溶解的底物的浓度可能能够提高产物的值和总产率?。。 底物供给速度和供给的能力是在底物供给过程中考虑的个重要因素,其影响着反 应速率和总产率。根据底物本身的性质可以考虑不同的供给方法,以下对其进行分别介 江南大学硕士学位论文 绍: 分批补料:传统的批处理反应,催化剂和底物一起加入反应体系,当底物浓度过 高时,势必导致底物抑制和毒害造成反应受到抑制。当以游离酶作为催化剂 时,这种现 象更加明显,据报道,当底物浓度达 /而溶解在体系中的底物浓度为 / 时,海因酶表现出%的活力丧失【引。运用分批补料则可以控制反应体系中底物的浓度, 使每次补的料均在引起抑制的底物浓度范围内,从而可以提高总产率。然而,这只适 用于产物对反应不存在抑制或是产物对催化剂没有毒性的情况。 辅助相: 有机溶剂:对于一个水溶性差的底物而言,添加合适的有机相作为反应的辅助相将 极大增加其溶解度。其相当于底物供给系统,能够不断地向水相中供给底物,如果选择 合适的有机溶剂,将可以提高反应体系中的总底物浓度而控制水相中的底物浓度在一个 合适的范围之内。有机相可能通过增加传质或是增加细胞壁的通透性来增加底物的利用 率。底物、产物、溶剂间的相互作用是影响反应平衡的主要因素,因此溶剂的疏水性、 对底物的溶解性、介电常数将成为选择有机相作为辅助相时需要考虑的因素【。如用假 单胞菌分解苯酚,以甲基正壬酮为辅助相时其产率可增加倍【引。 离子液:以有机溶剂为辅助相可能产生危险的废液,而用离子液则不存在这 样的问 题,它是潜在的清洁绿色合成溶剂系统。离子液是在室温或接近室温下为液体的有机盐。 根据离子液的性质不同,反应体系可能成为单相或是两相。使用离子液作为辅助相还具 有一系列的优点:稳定、使用温度范围广、溶解底物范围包括无机物、有机物和聚合物, 同时对催化剂的毒性非常小。由于离子液所具有的特点,它可能增加酶的稳定性和活力、 提高立体选择性。等人在.丁基一.甲基咪唑四氟硼酸盐离子液中添加碳形成新的 离子液以增加对底物的溶解性,使转化率从%提高到%。 树脂:吸附树脂通过原位产物分离广泛用于解决生物催化过程中产物抑制的问题。 在实现底物供给的方面,其与有机溶剂相似也是将底物萃取到另外一相。树脂将萃取到 上面的底物缓慢释放到溶液中,从而维持溶液中总是低底物浓度,底物从固相到液相的 传质是这种现象的驱动力一。相对于有机相而言,固相的树脂优点是其没有毒性,缺点 则是高树脂浓度可能会破坏催化剂。因此,在用树脂作为固相相时,选择很关键,应该 考虑到其对底物产物的亲和力,以及和催化剂的亲和力。利用树脂的最终目的是要控制 合适的底物浓度,并且利于下游产物的提取,从而提高反应总产率郴。 .本课题研究目的和内容 本课题为教育部长江学者创新团队编号::江苏省高技术工业项目编 号:。本研究室已经筛选出一株可以不对称还原苯乙酮酸生产尺.扁桃酸的 菌株 ,该菌转化 /苯甲酰甲酸的转化率和..值分别为 %和大于%。但是目前葡萄酒酿酒酵母催化苯甲酰甲酸生成尺一扁桃酸存在反应底 物浓度低,催化剂利用率低,产物提取困难等因素。 针对以上问题,本研究从反应过程着手,探索出一种能够提高反应过程底物浓 第一章引言 度的方法,对催化剂稳定性进行研究,也对催化反应的扩大反应进行初步研究,以期达 到高浓度、多批次转化,高效、经济获得.扁桃酸的目的。这有助于推动生物法 生产一扁桃酸工业化的发展。 本课题拟从以下几个方面进行研究: 根据该转化的特性:转化之所以效率较低主要是因为高底物浓度对反应存在抑 制作用,从而可以得出通过分批补料可以使得反应的底物浓度一直维持在一 个不引起抑 制的低水平的范围内,从而提高反应效率。 根据的性质和反应本身的性质,利用原位吸附技术提高反应的初始底物浓 度。首先筛选出能较快吸附底物和有较大吸附量的树脂。利用树脂对底物的吸附平衡, 控制溶液中底物的含量,从而减少底物对反应抑制和对菌体的毒害,以达到提高初始反 应底物浓度目的。 在利用分批补料和原位吸附技术提高反应底物浓度的研究的基础上,将两种方法 结合,迸一步提高反应的底物浓度。 将摇瓶中的催化反应扩大到实验室小试中,考察葡萄酒酿酒酵母催化反应在罐中 的反应情况,对发酵罐中影响其反应的各因素进行考察,使其在发酵罐中的生产水平与 . 摇瓶中一致。 江南大学硕士学位论文 第二章材料与方法 .实验材料 ..菌种 为实验室保藏 ..培养基 斜面培养基:麦芽汁琼脂培养基。 .%, 起始培养基成分:葡萄糖%,酵母膏.%, .%。 .%, .%,? ..主要试剂 安徽广德科苑化工有限公司 苯甲酰甲酸纯度% 美国公司 尺.扁桃酸色谱纯 美国公司 研.扁桃酸色谱纯 尺,固.扁桃酸色谱纯 美国公司 苯甲酰甲酸色谱纯 美国公司 异丙醇色谱纯 淮阴汉邦科技有限公司 正己烷色谱纯 淮阴汉邦科技有限公司 三氟乙酸化学纯 上海实验试剂有限公司 乙酸乙酯分析纯 中国医药集团化学试剂有限公司 苯甲酸分析纯 中国医药集团化学试剂有限公司 其余生化试剂均为市售分析纯和化学纯。 表各种树脂主要参数 . 树脂型号 极性 平均孔径/ 比表面积/.。 ~ 非极性 ~ 中极性 ~ 非极性、 强极性 ..主要仪器 高效液相色谱仪 戴安,紫外检测器, ..,日本 , 发酵罐 美国公司 .水浴恒温振荡器 太仓市医疗器械厂 回转式恒温调速摇瓶柜 上海欣蕊自动化设备有限公司 第二章材料与方法 河南巩义市站街光亚仪器厂 .循环水真空泵 无菌超净工作台 苏州净化设备厂紫外可见分光光度 美国公司 计 瑞士公司 计 电子天平. 瑞士公司 冷冻高速离心机 德国贝克曼公司 自动灭菌锅. 美国公司 .型电热鼓风箱 上海市上海县第二五金厂 .实验方法 ..菌种的培养 斜面培养:接种后的斜面置于?恒温培养箱培养。 / 种子培养:菌种由斜面接种到装液量%的 摇瓶中,于?, 。 下振荡培养 发酵培养:将培养 发酵培养 的种子液以%~的接种量:接种至装有 。 基的 /, /,?下发酵培养 发酵罐中,于通气量 /下离心 将发酵液在 并用生理盐水洗涤两次,收集菌体用于催化反 应。 ..微生物细胞催化的转化反应 .,. /,加入. 在 / 的磷酸钾缓冲溶液中 湿菌体细胞及 。 苯甲酰甲酸,于?的恒温摇床上振荡反应 在分批补料实验中,转化开始步骤如上。在一定时间后,为了得到所要求的底 物浓 度,每次补料分批操作都要加入一定量的苯乙酮酸。 乙 反应结束后,离心转化液,取上清液用 /盐酸酸化至.,再用 酸乙酯萃取,将有机层分离出,低温真空干燥,得到的残留固体用 异丙醇溶 解后 用于分析。 ..微生物菌体量的测定 通过考察微生物湿细胞重,测定微生物菌体量。 一曲 .微生物湿细胞重;:离心洗涤后湿细胞与离心管的总重;:空离心管 重。 ..反应底物、产物光学纯度及产率的测定 ...僻和回一扁桃酸分析方法的确定 ?柱上通过手性固定相高效液相色谱 职一、.一及俾,?扁桃酸标样在江南大学硕士学位论文 进行分析,固扁桃酸的保留时间为. ,月扁桃酸的保留时间为 . 。 各标样谱图如图.所示: 回扁桃酸 回扁桃酸 僻固扁桃酸 图.利用分析尺.、研.及僻,回.扁桃酸.. 固一,?职,?.×. 确定具体色谱条件为:手性柱 :流动相正己烷:异 丙醇:三氟乙酸::.;流速. /;柱温?:柱压常压;紫外检测器,检 测波长 进样量“。 ....和固.扁桃酸曲线的测定 分别配制.‰至%/浓度范围内的.和.扁桃酸溶液,进行分析, 第二章材料与方法 测定俾一和一扁桃酸标准曲线。如图.、.所示。?。×释值髫 一。孕【劲戡誊。 回一扁桃酸浓度几 肋一扁桃酸浓度/ 图.研扁桃酸标准曲线 图.固.扁桃酸标准曲线 .. .. 四 ...苯甲酰甲酸分析方法 苯甲酰甲酸标样在 ?柱上通过手性固定相高效液相色谱 进行分析,其保留时间为. ,其色谱图如图.。 图液相色谱分析苯甲酰甲酸 . 具体分析方法同扁桃酸的分析方法。 ...苯甲酰甲酸标准曲线的测定 分别配制.%至%/浓度范围内的苯甲酰甲酸的异丙醇溶液,在 .柱上进行分析,色谱条件见....章节。测得标准曲线如图.所示。江南大学 硕士学位论文 . 晷. 支 娶. 恒 髫 . 苯甲酰甲酸浓度/ 图.苯甲酰甲酸标准曲线 . ...反应产物光学纯度及产率的计算 在上述的色谱条件和扁桃酸浓度范围内,由分析得到的.和矽.对映体的峰 面积计算产物光学纯度及产率。 产物的光学纯度通过对映体过量值%.., 来评价。 俾扁桃酸的对映体过量值%../】×% 扁桃酸总回收率%【/×% % 职一扁桃酸收率%/ :反应后回.对映体的峰面积;:反应后尺.对映体的峰面积; :反应前回和俾一对映体的峰面积之和。 ..树脂的预处理 将种大孔树脂分别用无水乙醇浸泡 ,放净洗涤液,按同样方法处理,直至一 份 洗涤液在试管中加倍体积去离子水不显混浊为止,然后用蒸馏水充分淋洗至 大孔树脂 无残留乙醇,抽滤,室温下保藏备用。 ..树脂对底物吸附过程的测定 在 、浓度为. .,加入 /的磷酸钾缓冲溶液中 /底物和. 各种树脂,取吸附过程中不同时刻的上清用乙酸乙酯萃取,通过液相分析底 物含量,从 而计算树脂对底物的吸附量。 ..葡萄酒酿酒酵母催化的不对称还原反应 在 、浓度为. .,加入底物苯甲酰甲酸、 /的磷酸钾缓冲溶液中 树脂,吸附平衡后加入. /反应。 菌体细胞、于?, ..树脂的强化再生 将大孔树脂分别用无水乙醇浸泡 ,放净洗涤液,按同样方法处理,直至一份 洗 涤液在试管中加倍体积去离子水不显混浊为止,然后用蒸馏水充分淋洗至大 孔树脂无 残留乙醇,抽滤,室温下保藏备用。 第二章材料与方法 ..俾扁桃酸的分离纯化 僻扁桃酸的提取分离提纯步骤如图.所示。根据研究可以确定产物.的纯 化步骤为吸附、解吸附、脱色、浓缩和重结晶。用树脂对.进行吸附,用乙 酸乙酯对吸附上的产物进行解吸附,用活性炭脱色,用苯作为重结晶的溶剂。 真空缮压浓 上 重结晶 图励.纯化步骤 .江南大学硕士学位论文 第三章结果与讨论 .分批补料提高不对称还原合成假一扁桃酸效率的研究 ..底物浓度对产物产率的影响 为了研究底物浓度对转化的反应速率取前 单位体积单位时间内生成的产物 量作为反应速率和..值的影响,在初始值.,温度?的不同的底物浓度条件 下做了七组转化实验,底物浓度范围为 /到 /。结果如图.所示。 随着底物浓度的增加. /,也随之增加,这说明随着苯乙酮酸浓度的增 加加速了生物催化还原反应。当底物浓度大于. /时,底物苯乙酮酸对酵母细 胞的生物催化活性产生影响,并且伴随着底物抑制作用发生。当苯乙酮酸的浓度大于 /时,以线性的方式下降。这说明高浓度底物对该反应存在明显抑制。 .. . 丘. 鼍. 要 . . .图底物浓度对产物生物生成速率和..值的影响 . ..一 ..底物抑制数学模型的建立 对不对称还原生成单一构型化合物的动力学研究还很少。对其动力学的研究很重 要,动力学的研究对合成产物的优化可以提供指导作用。本还原反应的底物抑制属于非 竞争型抑制。】研究生物催化还原的动力学特征和模型对设计和优化工业生产 俾.扁桃酸是必需的。 底物抑制动力学模型一般基于假设:结合过多的底物分子在酶的催化中心导 致形成 了无活性的多重复合体。修改的型方程式被普遍运用。 /【。?厥】 根据不同的动力学机制,底物抑制动力学以下,,三个方程式描述。 :/他 :/// :/狐// 运用非线性回归求出模型中的动力学常数,见表?。模拟曲 线如图.。在低底物浓度的范围内 /,所有的模型都和实验数据拟合得不 错,但是在高底物浓度 /时,只有曲线和实验数据相吻合。因而,模 第三章结果与讨论 ,,,,底物抑制常数;产物生成速率,~; 底物浓度,?~; 残差平方和。 :????们??加 . 图底物抑制各种动力学模型的模拟和实验数据 .? ..分批补料提高底物浓度 上述已经证明了底物抑制作用的存在,因为底物抑制作用的存在使得反应的 底物浓 度低,造成时空产率低。可以通过底物供给策略提高底物浓度,使得反应中的底物浓度 一直保持在一个合适的水平,从而也提高了菌体的稳定性能。底物供给策略主要有:分 批补料、辅助相有机溶剂、离子液、树脂等。以有机溶剂为辅助相可能产生危险的 废液,有机溶剂对细胞也会产生毒害作用。而且通过实验也证明 不适合通过两相体系来提高底物浓度,可能原因是 耐有机溶剂的能力太差。然而离子液价格昂贵,不适合大规模生产。所以通过分批补料 或者添加树脂的原位吸附方法是提高底物浓度比较好的方法。在底物动力学研究的基础 上可以选择出最佳的反应底物浓度,在这个底物浓度下,产物生成速率较大。根据以上 的研究选择初始底物浓度为 /,从第个小时开始补加底物,每隔 补加一定量 的底物,结果如图.,从图中可以看出产物浓度随着补料次数的增加也在增加,但当 补料次数大于次后,产物浓度增加的并不明显。 江南大学硕士学位论文 补料次数 图补料次数对反应的影响? . ...不同的因素对分批补料的影响 ....初糖浓度对反应影响 细胞中的氧化还原酶催化苯甲酰甲酸还原时要不断消耗作为电子供体的还原型辅 酶,活性细胞为了维持正常的生理氧化还原状态,需要不断再生还原型辅酶, 以保持胞内正常的氧化还原平衡。这就需要葡萄糖作为辅助底物。不同初糖浓度对转化 的影响如图所示。从下图可以看出,葡萄糖浓度为时,产率仅为%,这是因为 活性酵母利用了自身含有的辅酶作为电子供体催化还原反应,但在消耗完以后,就不能 再继续转化了;而葡萄糖浓度在./..%之间均能有较好的转化效果,细胞利用辅助底 物葡萄糖实现了辅酶循环,使得还原反应能持续进行,产率均大于%。但当葡萄糖浓 度大于%时,对转化有明显的抑制作用,可能是由于高浓度葡萄糖影响了胞内酶系的 活性,从而使得转化效果下降。由此选择初糖浓度为%。 葡萄话浓度‘%/ 图.葡萄糖浓度对转化的影响.? ....补糖时间对反应影响 葡萄糖为辅助底物,随着转化时间的延长也要补加葡萄糖。。首先对补加葡萄 糖的 初始时间进行了考查。根据检测到的葡萄糖消耗过程可以得知转化的前两个 小时已经在 转化液中检测不到葡萄糖。不同的初始补糖时间对反应的影响如图.所示。 第三章结果与讨论 ? ? 加 ? 拿 ; ? 一%爵 , ? 柏 仲 。 扑话 补希 补话 补话 补话 仝日 初始补糖时间 图不同的时问下补加葡萄糖对转化率的影响 .? ’ 之前补糖导致 从上图可以得出,从第 开始补糖,得到的产率最高。在第 产率比空白低的原因可能是因为补糖时间太早,导致葡萄浓度比较高,从而 影响了胞内 酶系的活性。 ....补糖浓度的确定 在已经确定了初糖浓度和初始补糖时间的情况下,要进一步的确定补糖浓度, 因为 向反应液中添加不同浓度 葡萄糖为辅助底物,所以葡萄糖对转化的影响很大。每隔 的葡萄糖,对反应结果进行考察,从而得出最佳补糖浓度。结果如图所示。从 下图 可以看出添加.%葡萄糖时得到的转化率最高。 拿 雾 褂 一 .? 《 ? . . .? .口 . 补糖浓度% 图补糖浓度对反应结果的影响. .... 值的影响 在已经选择出初始值的最佳值为.的情况下,在转化的同时值也在下降, 但是在反应的第 将值调 开始,一直维持在.左右。所以在转化的第 到不同的值,考察其对转化的影响,因为底物是酸性的,补加底物必然导致值 的下降,所以需要选择补料后调节值到的一个最佳值。考察了调节不同的值 对反应的影响,结果如图.。从下图可以看出,值为.最好。 江南大学硕士学位论文 ? : ? 碍 阳 一 : 寥 ? ? 一零一瓣钆 柏; 弱 ? 拍 ? . .墨 ,. ,. ,. ,.廿 甘 . 寻. 值 图?值对反应的影响 .? ....补料次数对转化结果的影响 在反应过程中补加底物是一种缓解底物抑制作用很好的方法。不同的补料方式对转 化的影响也是很大的。从底物动力学模型可以看出底物浓度在 /时,产物生成速率 最大,所以选择初始底物浓度为‖,每隔一定的时间进行补料,使得最终底物总浓 度为 。对不同的补料次数进行了转化结果的考察,结果如图. /,反应时间为 所示。从下图可以看出,随着补料次数的增加,产物浓度也在增加,补料对提高底物浓 度的效果还是很明显的。但是当补料次数大于后,产物浓度增加的并不明显。 备 零 瑙 爰 。 霉 , 次数 图.补料次数对反应的影响 . ...用响应面优化生物转化的条件 响应面法是一种优化过程的综合技术,采用该法可以建立连续变量曲面模型和回归 方程,可同时对影响因变量的各因子水平及其交互作用进行优化与评价,是降低开发成 本、优化生产条件、提高产量质量的一种有效方法,该法已经被广泛的应用。选择补料 次数、转化时间、初始反应浓度、转数这四个因素,俾.扁桃酸的浓度为响应值。以上 已经对单因素进行了考察,在单因素试验结果基础上,采用了中心组合试验设计, 分别用、、来表示补料次数、转化时间、初始浓度、及转数,并以.、、分别 代表变量的水平。其因素所代表的参数水平见表.,其实验设计及方差分析见表?。 第三章结果与讨论 采用软件对实验数据进行回归分析。由此可求出影响因素的一次效应、二次 效应及其交 互效应的关联方程。 表中心组合实验方案设计的因素和水平编码值表 垒宝:兰旦宝曼盥型?型璺曼磐垒曼?宝兰. 曼翌趔 翌丝型璺堂里璺宝兰 罂 . 补料次数 转化时间 初始浓度 表 实验设计和实验结果 . 转化时间/ 序号 补料次数/次 初始浓度// 产物浓度// 对表的数据,用 .软件进行多元回归分析,可以得出回归模型的相 关系数为.,表明该模型的拟合度较好,可用此模型对僻.扁桃酸含量进行分 析 和预测。其方差分析见表。 表.回归分析结果 模型参数 平方和 自由度 均方 值 经回归拟合后,试验因素对响应值的影响可用回归方程表示: ............. 江南大学硕十学能论文 图补科次数与初始底物浓度交互作用对反应的影响 ? ? 图.表示的是补料次数和初始浓度的交互作用对反应的影响,从上图可以看出 随着补料次数的增加,初始浓度的降低,产物浓度在增加,而且变化范围较大,说明初 始浓度和补料次数的交互作用明显。第三章结果与讨论 圉.初始底物浓度与转化时间交互作用对反应的影响 图是转化时间和初始浓度相互作用的图,从图中可以看出,随着初始浓度的 减少和转化时『日的增加,产物浓度也在增加,可能原因是转化时间的增加、初始浓度的 减少,使得底物浓度保持在一个较好的水平,使得产物浓度生成速率增加。但是转化时 间超过 以后,随着初始浓度的减少,产物浓度有所下降,可能原因是底物浓度一直 维持在比较低的水平,使得产物生成速率较低。 根据以上的研究可以得出一个最佳的组合,从而得出一个最高的产物浓度值。最佳 组合是补料次数次、转化时间 、初始浓度 /.得出的犀高产物浓度为 ,。 在此条件下进行了三组验证实验.三组验证实验的平均值为 值达到了 /,且 %。产率与理论值预测相比误差小于%。因此,利用响应值法得到的优化结果具有 实用价值。 .树脂原位吸附促进高浓度底物不对称还原合成.扁桃酸不同树脂对苯甲酰甲酸的吸附 根据原位底产物分离原理,利用一种树脂,能以较快速率大量吸附底物和产物。 这样它能缓慢释放底物和产物,使溶液中的底物和产物的总量维持在一定水平,从而能 同时减少底物和产物对反应的抑制和菌体的毒害,使反应能在受到最小抑制的情况下持 续进彳于。选择了种人孔吸附树脂对底物的吸附情况进行了考察。结果如图所示。 以上已经证明底物抑制作用和产物抑制作用的存在。添加适当的树脂到反应液巾吸附一 定量的底物,使得反应液中的底物浓度一区保持在较低的水平,从而能减少底物对 反应的抻制和菌体的毒害作用,使得反应维持在较高的反应速率下进行反应。选择了 种大孔吸附树脂对底物的吸附情况进行了考察。结果如图.所示。从图中可 以看出, 树脂】对底物的吸附效果最好,能以较快的速率吸附底物,在吸附一 个小时后基本达到平衡,并且可以求出底物的吸附量约为 鼻,树脂,其他树 脂对底物吸附量和吸附速率都很小。这说明树脂对于该反应是一种较好的原 位 吸附具。江南大学硕士学位论文 一?,一毯袋哩子磐叫 ,时间 图.不同树脂对苯甲酰甲酸的吸附.? : . , .,?, .舀 ..添加不同树脂对高浓度底物反应效率的影响 为了验证树脂对反应的实际效果,考察了高浓度底物 /和 /的情 况下按照底物质量倍的关系添加树脂的转化效果,结果如图.及.所示。当底 物浓度为 /时,由于反应受到一定抑制,产率比较低,而添加树脂后,产物得率都 有了一定的提高。这是由于每种树脂对底物都有一定的吸附,使得溶液中底 物浓度均有 不同程度的降低,从而使得反应能保持在一个相对低浓度底物的环境中,提 高了反应效 果。但是由于除了外的几种树脂对底物的吸附作用都很小,所以提高的范围 也 很小,但是在添加了树脂后,转化效果明显得到了很大的改善。反应的..值也 维持在较高的水平。当底物浓度为 树脂也很大限度的提高了产率。 /时, ? ? ? 为 ? ? 柏 %瓣 ? ? ?空白 树脂 表不同树脂对 /不对称还原反应的影响 . / 嘏 第三章结果与讨论 ? 孚柏 拿 一 褥 一 ? 《 ? 一 芏日 树脂 表.不同树脂对 /不对称还原反应的影响 四 .? / ..最适树脂添加量 树脂的添加量对反应也存在不同的影响,为了选择出最佳的树脂添加量做了 不同 的树脂添加质量和底物质量不同的比例下的实验,从而得出最佳的树脂添加 量比率。结 果如图.,从图中可以看出树脂添加量为底物质量的倍时产率最高,所以最佳 树脂 添加量为底物质量的两倍。 ? ? ? 琶 鐾? ? 树脂质量/底物质量 图.树脂添加量对反应的影响 .? ..一定的树脂添加比率下树脂添加量对反应的影响 树脂添加量为底 通过实验也证明了 为最合适的树脂,而且最合适的 物质量的两倍。在最适的树脂添加比率的基础上,考察了在 的体系中不同的 树脂 添加量对反应了影响,结果如图,图?为分别在 /、 /、 /、 /、 /的底物浓度下添加不用的树脂量对反应的产物生成情况的影响,从图.可以 看 出随着树脂添加量的增加产物浓度也在增加,当底物浓度为 /时,产物浓度为. /,产率达到了%,并且从图中可以看出不添加树脂的产率明显比添加树脂的 低,但是当底物浓度超过 /后,随着树脂量的增加产物浓度并没有明显增加。 江南大学硕士学位论文 ? ? ? ? ?藿一趟爱霉扎 ? . . . 树脂质量口 图.一定的树脂添加比率下树脂添加晕对反应的影响 / .? ..环境因子对原位吸附反应体系的影响 ... 值对原位分离反应体系的影响 主要是影响细胞的酶系,不同酶的最适反应不一样,在某一下,该反应 所需的酶能表现出最佳的协同性,因而能达到最好的转化效果。酶催化反应 中值是 一个至关重要的因素。值的改变会使得反应中酶和底物的离子状态。而且, 值还 影响树脂对底物的吸附能力。本研究考察了从.到.的转化,结果如图.所 示。值对反应的产率影响还是较大的。值在...范围内的高浓度底物的反应 液 中,添加树脂对消除底物抑制也没有很大的作用。当值为.时,反应的最终产 率 最高。因而确定.为反应的最适初始值。 ?拿 盆 百 磺,摹 . 口. ,, ,. . , 口 图.添加树脂的转化体系值对转化的影响 ’ .? ...温度对原住吸附反应体系的影响 温度对菌体生长和酶的产生都有很大的影响。具体表现在两个方面:一方面, 温度 升高,细胞中生物化学反应速率加大,生长代谢加快;另一方面,温度过高,细 胞中对 温度较敏感的蛋白质、核酸等物质可能会受到不可逆的破坏。因此合适的反 应温度对转 化很重要。 第三章结果与讨论 ? ? ? 蓬静钆 柏 ? ? 々 ? 温度/? 图.温度对转化的影响. : ., /, /, /, .曲 本研究考察了种温度下菌体的转化情况,结果如图.,从图中可以看出在 至?温度范围内,随着温度的升高,活化分子增加,酶催化活性增加,转化收率也 在增加:而当温度大于?时,随着温度增加收率反而下降,且产物光学纯度也在下 降,这可能是因为温度增加导致了部分酶变性失活,使得转化效果降低,因此后面的反 应选择最适转化温度为?。 ...转速对原位分离反应体系的影响 转速主要影响溶液传质和溶氧。转速增加,增加底物和酶的接触,从而使反应速度 增加;另一方面,转速增加,溶液和空气的接触面也增大,使得溶氧浓度增加,影响细 胞中与呼吸链有关的代谢,从而影响转化反应。 ? ? ? 述醉 ? 幻 。 叫 , 转/ 图.转速对转化的影响. : /, ., /,?, .吕 本研究考察了种转速下对菌体转化的影响。结果如图.所示。结果表明:转 数对反应的..值影响不明显,对产率的影响较明显。如图所示,在 /时,具有 较高的产率,能达到%以上。..值也达到了%。因此选择反应的最适转数为 /。江南大学硕士学位论文 ...反应条件对 /底物浓度下反应的影响 反应条件优化后, , /底物浓度下反应过程如图?所示。可以看出,反应 其产物的产率可以达到%以上,相当于优化前反应 的水平。 ? 零 糌 址 时间 图?反应条件对 /底物浓度下反应的影响. / .利用分批补料结合树脂添加提高底物浓度 通过对分批补料和利用树脂提高底物浓度的研究可以看出,这两者虽然都提高了底 物浓度,但是还是没有超过 /。有文献报道在两相体系中进行分批补料可以进一步 的提高底物浓度,所以考查在添加树脂的体系中进行补料,从而进一步的提高底物浓度。 在初始底物浓度为‖的条件下,在添加树脂的体系中,从反应的第 开始 每隔 进行补加底物,并且补加底物后调节值到.,直到总底物浓度为‖ 时结束补加底物,反应过程曲线如图.,从图中可以看出,产物生成速率一直维持在 一个比较高的水平。对体系中只补加底物、在添加树脂的体系中进行补加底物、只添加 树脂的体系和直接以 /转化的空白实验这四种反应进行了产率的比较,实验结果如 图.。从图中可以看出,在含有树脂的体系中进行补料明显的比其他两种要 好。在添 加树脂的体系中进行补加底物的产率达到了.%,而其他的三种方式都在%以 下。 而且此工艺较简单,具有最终实现工业化生产的前景,是高效合成尺.扁桃酸 的新型技 术路线。 第三章结果与讨论 图.在添加树脂的体系中进行分批补料的反应过程曲线/跎 .? ? ? ? 享? 一 术 糌 一柏鼍 ?/空白 只朴加底物添加树脂的朴料只添加树脂 图?不同的反应方式对产率的影响 . ..高浓度产物浓度对反应的影响 研究了产物的浓度对反应速率的影响,在添加了不同的产物浓度的条件下对 反 应的反应速度做了研究,实验结果如图,从图中可以看出:当产物浓度低于 /时, 酵母细胞的还原活性维持在一定的水平,产物生成速率也维持在一个比较高的水平。但 是当产物浓度高于 /时,产物对反应的抑制作用就显现了出来,随着产物浓度 的增加,产物生成速率基本上以线性的方式在下降。 上述提到的一系列产物抑制的实验数据和模型吻合。模型是根据乙醇发酵过程 产物抑制模型重写的。模型中的表示相关于底物浓度的产物生成速率的。 从图三可以看出:模型能很好的描述生物还原存在明显的产物抑制作用的动力 母,为.,相关系数为., 学行为。并且估算出的动力学参数为为. 说明模型和实验数据吻合得非常好。 :一产矿 。产物抑制常数:产物抑制指数;产物浓度, 点 /.一 图.产物抑制动力学拟合曲线及实验数据点 江南大学硕士学位论文.?根据以上的研究可以得出:当产物浓度超过‖时就对反应产生了比较明显的抑 制作用。在添加树脂的体系中进行分批补料使得底物浓度达到了‖,这就使得产物 浓度也达到了 /以上,使得产物浓度已经接近于了产生抑制作用的水平,虽然在反 应中添加了树脂,树脂对产物的吸附效果如图.所示,树脂对产物的吸附作用很微 弱,这样就使得底物浓度不能进一步的提高。 ,一趟爱零址餐喜? .?强 叫?? 时间 图. ?对产物的吸附情况.? 僻? ..酵母细胞连续多批次重复使用 细胞的催化稳定性关系到催化剂的利用率,催化剂的利用率越高,生产成本越低。 为了考查葡萄酒酿酒酵母的稳定性,本研究考察了在添加树脂的体系中进行补加底物到 最终底物浓度为 /条件下菌体使用四批次的反应效果。每次转化结束后,将菌体离 心出来,并且用生理盐水洗涤两次,然后重复转化实验,所以从实验过程如上。结果如 图.所示,随着菌体的重复使用,反应效果一直保持较高的水平,产率和..都达到 了要求的水平。 ? ? ? ?嚣 ?? 姗 ? 钆 批次 图.菌体批次对产物产率和..值的影响 .? . 升规模不对称还原制备俾.扁桃酸的研究 第三章结果与讨论 在前面的研究中,利用葡萄酒酿酒酵母全细胞不对称还原苯乙酮酸制备俾.扁桃酸 的反应均是在摇瓶中进行。要想工业化生产俾.扁桃酸,将反应扩大是必不可少的。而 将反映扩大到反应罐中和摇瓶在、温度、溶氧控制上与摇瓶有一定的区别。如何将 摇瓶中