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下调lncRNA-MALAT1表达对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的保护作用

樊帅帅 宋磊军 蔺 聪 刘 扬

新生儿缺氧缺血性脑损伤（hypoxic-ischaemic brain damage,HIBD）是临床常见病，预后较差。研究发现，lncRNA肺腺癌转移相关转录子1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，lncRNA-MALAT1）下调明显促进小鼠缺血性脑卒中后血管新生[1]。脑源性神经营养因子（brainderived neurotrophic factor，BDNF）及其受体原肌球蛋白相关激酶B（tropomyosin-related kinase B，TrkB）信号通路与神经细胞生长、凋亡密切相关，且该通路已被证实参与HIBD的调控[2]。本研究抑制lncRNAMALAT1表达新生大鼠HIBD模型的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组SPF级7 d龄SD大鼠40只（雌雄各半，体质量在12～16 g），购自郑州大学实验动物中心[许可证号SCXK（豫）20180001，伦理批号IACUC20190525001]。将大鼠随机分为假手术组、模型组、lncRNA对照组、silncMALAT1组，每组10只。

1.2 模型制作 以Rice-Vannucci法建立新生大鼠HIBD模型[3]。吸入2%七氟醚维持麻醉，永久结扎左侧颈总动脉（假手术组仅穿线不结扎），苏醒后继续喂养2 h，置于有机玻璃缺氧箱，持续输入含8%O2、92%N2的混合气体，缺氧2 h，观察大鼠行为，出现夹尾、尖叫、自发左转圈，则建模成功。模型组造模失败2只，lncRNA组失败2只，silncMALAT1组失败1只，最终35只大鼠纳入研究：假手术组10只，模型组8只，lncRNA对照组8只，silncMALAT1组9只。

1.3 给药方法 建模成功后2 h，2%七氟醚麻醉，大鼠脑立体定位仪标记左侧侧脑室[4]。lncRNA对照组、silncMALAT1组缓慢推注空载体重组腺病毒、silnc-MALAT1各5μl（病毒滴度为2.5 ×1013pfu/L，上海吉玛制药技术有限公司提供）。假手术组、模型组推注5μl生理盐水。停针1 min后缓慢退针，骨腊封闭。

1.4 Morris水迷宫试验评估空间学习和记忆能力[5]造模后7 d进行1次适应性训练，造模后8～11 d进行定位巡航试验，记录90 s内登陆安全平台的时间即为逃避潜伏期，若90 s内未找到则引导至安全平台，停留30 s，记录为90 s。造模后12 d撤去安全平台，记录90 s内的游泳轨迹，分析目标象限停留时间及穿越目标象限内安全平台的次数。

1.5 TUNEL染色检测海马神经元凋亡情况Morris水迷宫测试次日处死大鼠，迅速分离海马组织，4%多聚甲醛固定48 h，石蜡包埋，制作4μm冠状位切片。按照TUNEL试剂盒（美国Roche公司）说明书操作，DAB显色，苏木精核染，封片，显微镜下观察细胞核染棕黄色或黄色颗粒则为凋亡细胞，记录每平方毫米凋亡细胞数。见图1。

1.6 实时定量PCR法检测mRNA的表达 取海马组织70 mg，采用Trizol试剂提取组织总RNA，逆转录获得cDNA，再采用SYBR Green I实时PCR试剂盒（上海羽朵生物科技有限公司）进行实时定量PCR。以β-actin为内参，以2-ΔΔCT法计算相对表达量。

1.7 免疫印迹法检测蛋白表达 取海马组织50 mg，组织裂解液冰上裂解30 min，4℃预冷，16 099.2 g离心15 min，取上清液测定总蛋白浓度。取10μg待测蛋白和40μg上样缓冲液混匀，置于沸水中10 min，16 099.2 g心10 min，进行SDS-PAGE电泳，经转膜、封闭、兔抗大鼠BDNF、TrkB单抗一抗（美国Abcam公司）、HRP标记的二抗孵育（美国Abcam公司），显影、曝光，分析并计算目的蛋白与内参β-actin灰度值比值。

1.8 统计学方法 采用SPSS 21.0 软件分析；计量资料均以x±s表示，采用单因素方差分析和SNK-q检验；P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 lncRNA-MALAT1对HIBD大鼠学习和记忆功能的影响Morris水迷宫试验结果显示，与假手术组相比，模型组、lncRNA对照组目标象限停留时间和穿越平台次数均明显减少（P＜0.05 ），模型组和lncRNA对照组之间无统计学差异（P＞0.05 ）。与lncRNA对照组相比，silncMALAT1组目标象限停留时间和穿越平台次数均明显增加（P＜0.05 ）。见表1。