细胞的原代培养与传代培养

细胞的原代培养与传代培养原代培养通过组织块直接长出单层细胞或用酶或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养，在首次传代前的培养可认为是原代培养。原代培养最大的优点是，组织和细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，在一定程度上能反映体内状态。特别是在细胞培养会合时，原代培养的某些特殊功能表达尤为强烈。在这样的培养阶段能更好地显示与亲体组织紧密结合的形态学特征。在供体来源充分、生物学条件稳定的情况下，采用原代培养做各种实验，如药物测试、细胞分化等，效果很好。但应注意，原代培养组织是由多种细胞成分组成的，比较复杂。即使全为同一类型的细胞，如上皮细胞或成纤维细胞，也仍具有异质性，在分析细胞生物学特性时比较困难。其次，由于供体的个体差异及其他一些原因，细胞群生长效果有时也不一致。原代培养也是建立各种细胞系(株)必经的阶段。假如原代培养能够维持几小时甚至更长，即可进行进一步筛选。有的细胞具有继续增殖能力，有的细胞类型只是存活而不增殖，而另外一些细胞只是在特殊条件下应用而不存活，因而细胞类型的分布将会改变。在单层培养的情况下，瓶底全部铺满细胞，达到会合以后，对密度有依赖性的细胞则逐渐减少生长，而失去密度依赖敏感性的细胞则生长增加，天然或自发转化的细胞则过度生长。借助于频繁传代，保持细胞低密度生长，有利于保存细胞的正常表型(如小鼠成纤维细胞)。而自发转化则倾向于高细胞密度的过度生长。细胞密度过大，培养基消耗将尽，细胞代谢产物积聚过度，细胞增殖变慢，应进行传代培养。传代培养原代培养形成的单层细胞汇合以后，需要进行分离培养，否则细胞会因生成空间不足或由于细胞密度过大引起营养枯竭，都将影响细胞的生长，这一程序常称为传代或传代培养。原代培养在首次传代时即为细胞系，能连续培养下去的为连续细胞系;不能连续培养的为有限细胞系。通常，传代培养是指扩大培养，也就是将一份细胞一分为二或者一分为三进行培养等。但严格说来，不论稀释与否，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代或传代培养。可以理解，在任何时候，细胞从一个瓶子接种到另一个瓶子时总会丢失一部分，因此，在客观上细胞必定有所稀释。传代代数这一概念常常容易同“增殖代数”相混淆。细胞“一代”一词仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间。如某一细胞系为第153代，即指该细胞系已传代153次。它与细胞“增殖代数”(细胞世代或倍增)不同，在细胞一代中，细胞约能倍增3,6次。由此可见，细胞代数与增殖代数相关，确切的代数则依赖于细胞株和培养条件的不同而异。但构成一个细胞系的生长条件必须是同样的，因而细胞系应该表达近似的增殖代数或倍增代数。1.悬浮细胞:离心后计数细胞，根据细胞增殖速度，加入新鲜完全培养基，制成适当密度后，放入新瓶培养:快速增殖的肿瘤细胞45系，可调节密度为1×10细胞/ml至1×10细胞/ml，对增殖缓慢细胞可加大密度。2.贴壁细胞:吸弃培养基，用PBS洗一遍，沿培养瓶侧壁加入2-3ml新鲜配制的胰酶(浓度为0.2-0.3%，以PBS配制后过滤除菌)，完全覆盖全部细胞层，室温静置1分钟，吸去胰酶，以残留的胰酶继续消化，镜下观察，当细胞开始变圆但尚末完全脱落时(一需3-15分钟不等，依各细胞类型而定)立即加入2-3ml带血清的培养基，中止胰酶消化，对着培养瓶底角充分吹打细胞，使成单细胞，计数细胞，按所需密度传代，一瓶生长密集的细胞可传代3-6瓶。注:1.一般传代后24小时左右，细胞进入指数生长期，是良好的实验材料。2.贴壁细胞的消化，应掌握各类型细胞不同的消化时间，避免过度消化，损伤细胞活力;或消化不足，不能充分解离成单细胞。3.如为长期实验，每个月重新复苏一支细胞，避免长期传代引起细胞特性变异;4.有些肿瘤细胞需体内传代，即接种动物体内传代。对这些细胞株应避免在体外过多传代，如体外培养，应在10代以内使用。原代培养物经首次传代成功后即为细胞系(cellline)，由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成。如果不能继续传代，或传代次数有限，可称为有限细胞系(finitecellline)，如可以连续培养，则称为连续细胞系(continuouscellline)，培养50代以上并无限培养下去。从一个经过生物学鉴定的细胞系由单细胞分离培养或通过筛选的方法由单细胞增殖形成的细胞群称细胞株(cellstrain)。所以细胞株是通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养细胞。从培养代数来讲，可培养到40-50代。