中华鳖“腐皮病”的病原菌研究.doc

中华鳖“腐皮病”的病原菌研究.doc 中华鳖“腐皮病”的病原菌研究 论文摘要:对浙江某养殖场患“腐皮病”的中华鳖进行了病原菌分离，分离到2株细菌(编号为040908-1和040908-2)。经人工感染试验证明，这2株细菌都是引起该病的病原菌。分别采取传统细菌生理生化鉴定以及全自动细菌鉴定仪VITEK-32对这2株细菌进行了鉴定，结果均明菌株040908-1为普通变形菌(Proteus vulgaris)，而菌株040908-2为维罗纳气单胞菌温和生物变种[U1] (Aeromonas veronii biovar sobria)。研究了27种药物对这2株细菌的药敏试验，结果显示，妥布霉素、新霉素、奥复欣、先锋必素、庆大霉素、卡那霉素等6种药物对这2株细菌均有良好的抑制作用，氟哌酸、吡哌酸、链霉素、四环素等4种药物仅能有效抑制菌株040908-1的生长，而复方新诺明仅对菌株040908-2有显著的抑制作用。论文关键词:中华鳖,腐皮病,普通变形菌,维罗纳气单胞菌温和生物变种 中华鳖是浙江省四大水产养殖主导品种之一，据统计，2008年全省养殖鳖产量达到103960吨。随着浙江省中华鳖养殖的快速发展和集约化程度的不断提高，中华鳖发病日趋增多，给养殖业带来巨大的经济损失。“腐皮病”是中华鳖养殖过程中的主要病害之一，[U3]发病范围广，持续时间长，对浙江省中华鳖养殖产业造成了严重的损失。本文对我省中华鳖“腐皮病”的病原进行了初步分离研究。 1与方法 1.1材料 病鳖取自浙江德清某养殖场，活力差，四肢、颈部、背甲及裙边均有皮肤溃烂病灶;健康鳖取自浙江萧山某养殖场。 1.2病原菌分离 取症状典型的病鳖，无菌条件下从病鳖肝、肾、脾等组织取样，划线接种于普通营养琼脂培养基上，28C恒温培养24h后，挑取形态特征一致的优势菌落进行克隆培养，共分离到040908-1、040908-2两株细菌，转接斜面保存备用。 1.3人工感染试验 试验采用60cm×50cm×40cm的塑料箱，每箱放养体重50g~80g的健康中华鳖5只，[U4]水温保持25?左右，连续充气，暂养一天后进行感染试验。试验菌株培养18h~24h后，以无菌生理盐水制成菌悬液，菌悬液含菌量按McF浊度管结合活菌计数方法确定，菌株040908-1为7.5×10cfu/ml，菌株040908-2为1.2×10cfu/ml。以从右后肢注射(0.2ml/只)的方法，将2株菌分别单独或者混合进行人工感染试验。对照组注射等量无菌生理盐水。感染组与对照组均设立两个平行组。 1.4病原菌鉴定 按照常见细菌系统鉴定手册、伯杰细菌鉴定手册(第九版)的方法进行细菌学鉴定。同时采用VITEK32全自动细菌鉴定仪(法国生物梅里埃公司，bioMérieux)的GNI卡进行比较鉴定。 1.5药敏试验 在普通营养琼脂培养基上以纸片法测定病原菌对不同药物的敏感性，经28?恒温培养24h，观察 抑菌圈的有无并用游标卡尺测量其直径，抑菌圈越大，则病原菌对该种药物越敏感。药敏纸片(直径6mm)购自杭州微生物试剂有限公司。同时采用VITEK32全自动细菌鉴定仪(法国生物梅里埃公司，bioMérieux)的药敏试验卡(GNS506)进行MIC测定。 2结果 2.1人工感染试验结果 人工感染试验结果见表1。健康鳖经040908-1、040908-2两菌株人工感染，2d后陆续发病，发病率为100,;4d后病势加重并出现死亡，7d内全部死亡。人工感染的病鳖与自然发病鳖的症状基本一致。从感染死亡鳖分离细菌作鉴 定，结果与试验菌株完全相同。试验期间对照组鳖健康活泼，无任何症状。由此证明菌株040908-1、040908-2均为中华鳖“腐皮病”的致病菌。 表1人工感染试验结果 Tab.1Resultsofartificialinfectiontest 菌株 菌液浓度 (CFU/ml) 注射量 (ml/只) 试验数 (只) 累计死亡数 (只) 死亡率 (,) 040908-1 7.5×10 0.2 5 5 100 040908-2 1.2×10 0.2 5 5 100 040908- 1/040908-2 7.5×10 /1.2×10 0.1+0.1 5 5 100 对照 无菌生理盐水 0.2 5 0 0 2.2病原菌鉴定结果 两株病原菌鉴定结果如表2所示。菌株040908-1杆状，革兰氏阴性，有鞭毛，具有运动性，氧化酶阴性，触酶阴性，生理生化反应与文献所述普通变形菌基本一致。菌株040908-2杆状，革兰氏阴性，氧化酶阳性，生理生化反应与文献所述维罗纳气单胞菌基本一致。 根据全自动细菌鉴定仪VITEK-32的鉴定结果(表3)，菌株040908-1的生物编码为6012140120，属于普通变形菌(概率为 99,)。菌株040908-2的生物编码为7000300064，属于维罗纳气单胞菌温和生物变种(概率为90,)。 表2分离菌株的生理生化特性 Tab.2Physiologicalandbiochemicalcharacteristicsoftheisolatedbacteria 鉴定项目 040908-1 040908-2 鉴定项目 040908-1 040908-2 菌体形状 杆状 杆状 柠檬酸盐利用 , - 革兰氏染色 - - 液化明胶 + / 葡萄糖氧化发酵 F F 水解淀粉 / + 葡萄糖产气 + + 葡萄糖产酸 + + 氧化酶 - + 肌醇 , - 接触酶 + / 山梨醇 , - 吲哚 + + 蔗糖 + - 甲基红 - - 乳糖 , - V.P. + + 果糖 + / 产硫化氢 + - 甘露糖 - - 七叶苷 + - 纤维二糖 + / 水杨苷 , - 阿拉伯糖 , - 丙二酸盐 , - 麦芽糖 + + 赖氨酸脱羧酶 - + 半乳糖 + / 精氨酸双水解酶 - + 鼠李糖 , - 鸟氨酸脱羧酶 - + 甘露醇 - - 脲酶 + - 密 二糖 , / β-半乳糖甙酶 - - 苦杏仁甙 - / 硝酸盐还原 + + 木糖 / - 动力 + + KCN - - 棉子糖 - - 甘油 / + 表3分离菌株的 VITEK-32鉴定结果 Table3ResultidentifiedbyVITEK-32oftheisolatedbacteria 项目 结果 项目 结果 040908-1 040908-2 040908-1 040908-2 三氯新DP3 - + 葡萄糖氧化OFG + + 阳性生长控制GC + + 乙酰氨ACE - - 七叶灵ESC - - 植物尿母蓝PLI - - 尿素URE + - 枸橼酸盐CIT - - 丙二酸 盐MAL - - 苯丙氨酸TDA - - 多粘菌素B PXB + - 乳糖LAC - - 麦芽糖MLT + + 甘露醇 MAN - + 木糖XYL - - 棉子糖RAF - - 山梨醇SOR - - 蔗糖SUC + - 肌醇INO - - 侧金盏花醇ADO - - 香豆酸COU - - 硫化氢H2S + - β-半乳糖苷酶 ONP - - 鼠李糖RHA - - 阿拉伯糖ARA - - 葡萄糖发酵GLU + + 精氨酸 ARG - + 赖氨酸LYS - - 鸟氨酸ORN - - 氧化酶OXI - + 综合上述结果，可以把菌株040908-1和 040908-2分别鉴定为普通变形菌Proteusvulgaris和维罗纳气单胞菌 温和生物变种Aeromonasveroniibiovarsobria。 2.3药敏试验结果 用纸片法测定了2株细菌对27种药物的敏感性(表4)。妥布霉 素、新霉素、奥复星、庆大霉素、卡那霉素等药物对2株细菌均有 较强的抑制作用，氟哌酸、吡哌酸、链霉素、四环素对菌株040908-1有显著抑制作用但对040908-2无抑制作用或仅有微弱抑制作用， 而复方新诺明仅对040908-2有抑制作用。 表4药敏试验结果 Tab.4Sensitivitiesofstrain040908-1and040908-2to27antimicrobialagents 药物 含量 (μg /片) 抑菌圈(mm) 药物 含量 (μg /片) 抑菌圈(mm) 040908-1 040908-2 040908-1 040908-2 氯洁霉素 2 0 0 吡哌酸 30 19.92 0 复方新诺 明 1.25/23.75 0 24.45 新霉素 30 21.28 21.55 氟哌酸 10 36.10 15.88 奥复星 5 28.74 22.20 磺胺异唑 300 0 0 链霉素 10 22.45 7.87 多粘 菌素B 300 IU 0 9.41 新生霉素 30 10.40 9.73 氨苄青霉素 10 0 0 先锋必素 75 18.19 28.19 阿莫西林 10 0 0 万古霉素 30 0 0 青霉素 10 IU 0 0 庆大霉素 10 22.48 19.51 利福平 5 10.56 11.51 卡那霉素 30 29.56 19.47 羧苄青霉素 100 13.01 0 头孢羟唑 30 0 9.09 氧哌嗪青霉素 100 16.52 21.60 麦迪霉素 30 0 11.80 先锋霉素V 30 0 9.45 四环素 30 20.38 9.89 妥布霉素 10 24.99 21.54 强力霉素 30 18.97 16.99 丁胺卡那霉素 30 21.79 17.31 表5VITEKGNS-506卡测定结果 Table5SensitivitiesdetectedbyGNS- 506 药物 040908-1 040908-2 MIC值(μg/mL) 是否敏感 MIC值(μg/mL) 是否敏感 Amoxicillin/CA阿莫西林/榛酸 ?32 R ?32 R Ampicillin氨苄西林 ?32 R ?32 R Cefotaxime头孢胺噻肟 ?4 S ?4 S Cefoxitin头孢西丁 4 S ?2 S Cefotazidime头孢他啶 ?8 S ?8 S Cephalothin头孢噻吩 ?32 R 16 I Gentamicin庆大霉素 ?0.5 S 1 S Imipenem亚胺培南 ?4 S ?4 S Nalidixic Acid喹啶酸 ?16 S ND ND Netilmicin奈替米星 ?4 S ?4 S Nitrofurantoin呋喃妥因 ?32 S ?32 S Pefloxacin氟哌喹酸 ?1 S ?4 R Ticaracillin替卡西林 ?16 S ?16 S Tobramycin妥布霉素 1 S 2 S Trimethsulfa复方新诺明 ?320 R ?10 S 注:S――敏感;I――中间;R――耐药。同时采用VITEKGNS-506卡对分离菌株进行了药敏检测，结果见表5。其中040908-1对复方新诺明有抗药性而040908-2敏感，与纸片法结果相同。 3讨论 3.1关于“腐皮病”的病原菌[U5] 关于中华鳖“腐皮病”的病原菌已有较多研究，已经分离到的病原菌包括嗜水气单胞菌、豚鼠产气单胞菌、温和气单胞菌、假单胞菌及无色杆菌等多种细菌。本研究从患“腐皮病”的中华鳖体内分离到的普通变形菌和维罗纳气单胞菌温和生物变种两种菌，人工感染能够引起健康中华鳖发病与死亡，并能从病死鳖体内重新分离回收到原感染菌，证实是中华鳖“腐皮病”的病原菌。 普通变形菌能够引起对虾、赤点石斑鱼发病，同时也是鳖穿孔病的主要病原之一，[U6]还能引起人类食物中毒。维罗纳气单胞菌温和生物变种可引起中华鳖“拟白斑病”，还是彩虹鲷、丁以及幼体斑马贝的病原菌，还可以引起人类腹泻及其它感染。这2株菌作为人类与水生生物的共同病原菌，已引起医学界和水产学界的重视。鉴于普通变形菌和维罗纳气单胞菌生物变种都是条件致病菌，推测很可能是由于受伤或者环境胁迫导致鳖体抗病力下降，病菌菌乘机侵入造成发病。因此对该病的控制应以预防为主，加强管理，避免鳖体受伤以及养殖环境恶化。对于已发病的鳖，要根据药敏试验结果，选择合适的药物进行治疗。 3.2关于中华鳖病害的命名 [U7] 到目前为止，对于中华鳖病害的命名多根据症状，比如腐皮病、穿孔病、白点病等。但事实上某些症状之间可以相互转化，如腐皮病可以进一步发展成溃疡、穿孔病等;而同一症状也有可能由不同细菌引起的，如已报道有多种细菌可以引起腐皮病。 在本研究中，从病鳖体内分离到2株不同的病原菌，且都能导致健康鳖出现同样的症状，但2株菌对于药物的敏感程度却有很大不同，复方新诺明对菌株040908-2有明显抑制作用，但对菌株040908-1却毫无作用;而链霉素、四环素对2株菌的作用效果却刚好相反。鉴于不同病原菌可以导致鳖出现相同症状，且不同病原菌对于同一种药物的敏感程度存在较大差异，如果没有确定病原而光凭症状来用药，很容易引起误用，不但达不到治病的目的，还可能延误病情，造成更大的损失。因此，有必要对中华鳖病害的命名重新加以梳理和。