花生胰蛋白酶抑制剂_PI_基因的克隆和原核表达
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花生胰蛋白酶抑制剂(PI)基因的克隆和原核表达
刘培培 温韵洁 宾金华
(华南师范大学生命科学学院,广东省植物发育生物工程重点实验室,广东 广州 510631)
蛋白酶抑制剂(protease inhibitor,PI)是一类能够抑制蛋白质水解酶活性的多肽
或蛋白质,普遍存在于植物中。种子中含有丰富的 PI,报道最多的是豆科、茄科、禾本科
及十字花科等植物。
PI 的分子量一般比较小,它们能与蛋白酶活性部位或变构部位结合抑制酶的催化活性
或阻止酶原转化为有活性的酶,在调节蛋白酶活性和蛋白质代谢...
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花生胰蛋白酶抑制剂(PI)基因的克隆和原核
达
刘培培 温韵洁 宾金华
(华南师范大学生命科学学院,广东省植物发育生物工程重点实验室,广东 广州 510631)
蛋白酶抑制剂(protease inhibitor,PI)是一类能够抑制蛋白质水解酶活性的多肽
或蛋白质,普遍存在于植物中。种子中含有丰富的 PI,报道最多的是豆科、茄科、禾本科
及十字花科等植物。
PI 的分子量一般比较小,它们能与蛋白酶活性部位或变构部位结合抑制酶的催化活性
或阻止酶原转化为有活性的酶,在调节蛋白酶活性和蛋白质代谢等方面起着重要的作用。
根据其作用的酶活性部位的不同,PI 分为丝氨酸蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂(巯
基蛋白酶抑制剂)、金属羧肽酶蛋白酶抑制剂和天冬氨酸蛋白酶抑制剂。目前已发现的植物
来源的 PI 主要属于前 3种类型。其中,最主要的为丝氨酸蛋白酶抑制剂类型。
植物种子的 PI 至少具有三种最基本的生理功能:第一,作为抗营养因子成为植物的繁
殖策略之一,保护种子免受病原微生物、昆虫、鸟兽等猎食者的侵害或取食;同时也是进
行抗虫、抗病等遗传育种及基因工程研究的热点课题;并为人们治疗多种与蛋白质代谢有
关的疾病,展示了新的广泛前景;第二,作为自身蛋白酶活性的调节因子,在种子发育及
萌发过程中调节蛋白酶的活性,阻止对种子或幼苗不利的各种不良蛋白水解反应;第三,
作为贮藏蛋白为幼苗的生长提供氮源和碳骨架。
随着分子生物学、细胞生物学和生物工程研究技术的迅速发展,以及功能基因组学的
蛋白质组学等研究手段的建立,对植物中蛋白酶抑制剂的研究越来越深入。有关蛋白酶抑
制剂在植物抗病虫害中的作用,也引起了科学家广泛的兴趣。
本实验室段小华(2004)从花生种子中纯化分离出一种蛋白酶抑制剂,对胰蛋白酶具有
强抑制作用。对该蛋白进行 N 端序列分析表明,该蛋白酶抑制剂属于丝氨酸蛋白酶的
Bowman-Birk 家族的成员。该蛋白酶抑制剂具有体外抑制黄曲霉孢子萌发的菌丝生长的能
力,具有抗菌的有效成分。由于从段小华(2004)的实验结果看,从花生种子中纯化出胰蛋白
酶抑制剂的过程非常繁琐,而且得率很低,仅有 0.036%,因此有必要建立一个能大量获得纯
化的花生胰蛋白酶抑制剂的方法。
大肠杆菌表达系统是基因表达技术中发展最早、目前应用最广泛的表达系统,是分子生
物学产业化发展的重要工具。大肠杆菌的遗传背景清楚,容易培养,能大规模发酵,以及
可供选择利用的克隆和高效表达,使之成为人们克隆和表达外源基因的首选菌株。
以花生(Arrachis hypogaea L.)汕油 523 种子为材料,从发育中后期的花生种子中提
取总 RNA,经反转录获得 cDNA
,根据花生 PI 的 cDNA 序列设计特异性引物,通过 PCR
扩增获得 PI 全长 cDNA。PCR 产物和 pET32a 原核表达载体经双酶切、纯化后利用 T4 连接酶
进行连接并转入大肠杆菌(Rosetta gami B(DE3))中。转化子经抗性筛选、PCR 鉴定、双酶
切鉴定和测序证明花生 PI 基因原核表达载体 pET32a-PI 构建成功。经 IPTG 诱导后在大肠
杆菌中诱导出大量有抑制活性的目的蛋白。
国家自然科学基金(30671338、30971841)资助项目
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