枸杞多糖对DES诱导的仓鼠睾丸氧化损伤的保护作用

畜牧兽医学报 　2008 ,39 (5) :6522657 A ct a V eteri nari a et Zootechnica S i nica 枸杞多糖对 DES 诱导的仓鼠睾丸 氧化损伤的保护作用 马爱团1 ,2 ,陈耀星1 3 ,王子旭1 ,董玉兰1 (1. 中国农业大学动物医学院 ,北京 100193 ; 2.河北农业大学中兽医学院 ,定州 073000) 摘　要 : 为研究枸杞多糖 (LBP)对己烯雌酚 (DES)诱导的仓鼠睾丸氧化损伤的保护作用 ,将 24 只成年雄性仓鼠随 机分为 4 组 ,即正常对照组、DES 组、DES + LBP 组、DES + VC + V E组。连续处理 7 d 后统计睾丸质量和相对质量 , 观察睾丸组织结构的变化 ,检测睾丸组织和血浆中超氧化物歧化酶 (SOD) 、谷胱甘肽过氧化物酶 ( GSH2Px) 、总抗 氧化能力 ( T2AOC)和丙二醛 (MDA) 的含量。结果 LBP 显著逆转了 DES 引起的生精损害 ,睾丸质量显著上升 ( P < 0105) ,曲细精管排列有序 ,生精细胞轮廓清晰。同时 LBP 显著提高体内 SOD 和 T2AOC 含量 ( P < 0101) ,降低 MDA 水平 ( P < 0101) 。给予 LBP 后各项指标均接近对照组 ,与补充维生素组没有显著性差异。说明枸杞多糖可 有效对抗自由基 ,抑制脂质过氧化 ,减弱 DES 导致的生精损害 ,提示 LBP 是缓解环境雌激素生殖毒性的有效成分 之一。 关键词 : 枸杞多糖 ;己烯雌酚 ;生精损害 ;抗氧化 中图分类号 :S853174 　　　　文献标识码 : A 　　　　文章编号 :036626964 (2008) 0520652206 收稿日期 :2007206227 基金项目 :国家自然科学基金 (30471247 ; 30671514 ;30700575) ;国家重点基础研究发展计划项目 (2007CB109105) 作者简介 :马爱团 (19682) ,女 ,河北安新人 ,副教授 ,博士生 ,主要从事中药药理学及生殖免疫学研究3 通讯作者 :陈耀星 ,教授 ,博士生导师 , Tel : 010262733778 ,E2mail : yxchen @cau. edu. cn Protection of L ycium Ba rba rum Polysaccharides on Diethylstilbestrol Induced Oxidative Damage in Testis of Hamster MA Ai2t uan1 ,2 , CH EN Yao2xing1 3 , WAN G Zi2xu1 ,DON G Yu2lan1 (1 . Col lege of V eteri nary Medici ne , Chi na A g ricul t ural Uni versi t y , B ei j i ng 100193 , Chi na; 2 . Col lege of T radi t ional Chi nese V eteri nary Medici ne , A g ricul t ural Uni versi t y of Hebei , Di ngz hou 073000 , Chi na) Abstract : Protective effect s of L yci um B arbarum polysaccharides ( LBP) on diet hylstilbest rol (DES) induced oxidative damage in hamster testis was studied in t his experiment . Adult ham2 sters ( Mesocricet us aurat us) were randomly divided into 4 group s : Cont rol group , DES group , DES + LBP group , DES + VC + V E group . Absolute and relative testicular weight were calculated , morp hological changes of testis were observed and the content s of SOD , GSH2Px , T2AOC , MDA in testis tissue and plasma were detected af ter 7 successive days t reat ment . The result s showed t hat LBP had an evident effect in reversing t he rep roductive damage induced by D ES. In D ES + LBP group , the absolute and relative testicular weight were significantly upgraded ( P < 0. 05) and t he seminiferous t ubules were lined up in order . Levels of SOD and T2AOC elevated marked2 ly in LBP group ( P < 0. 01) ,which was similar with cont rol , but MDA showed t he reverse tend2 ency. There was no significant difference between LBP and vitamin group . It is concluded t hat LBP could efficiently rest rain the p roduction of reactive oxygen species , inhibit t he generation of lipid peroxidation , accordingly at tenuate t he rep roductive toxicity of DES. These result s indicated t hat LBP is one of t he active component s in at tenuating t he oxidative damage induced by environ2 　5 期 马爱团等 :枸杞多糖对 DES 诱导的仓鼠睾丸氧化损伤的保护作用 mental est rogens. Key words : LBP ; D ES ; rep roductive toxicity ; antioxidation 　　环境中具有类雌激素活性的内分泌干扰物能够 引起各种类型的雄性生殖障碍 ,如性腺发育不良、睾 丸萎缩、精子活力降低、睾丸肿瘤等[ 1 ] 。己烯雌酚 (Diethylstilbest rol , DES)是一种合成雌激素 ,为研 究环境激素效应的药物模型。研究明 ,环境雌激 素引发的生精损害多与氧化应激有关[223 ] ,因此 ,寻 找高效低毒的抗氧化药物以缓解内分泌干扰物的危 害是非常重要的。中药在自然界分布广泛 ,由于其 天然、低毒受到人们的信赖 ,目前又因其抗氧化活性 而倍受关注。枸杞是我国传统的名贵中药材 ,枸杞 多糖 (L yci um B arbarum Polysaccharides , LBP) 是 其主要成分之一 ,具有多种药理作用和生物活性 ,尤 其在抗氧化和增强免疫力方面有很多报道[ 425 ] 。近 年发现 ,LBP 对动物生殖系统具有保护作用 ,能够 缓解氧化应激引起的生精损伤[627 ] 。仓鼠是研究环 境雌激素效应的良好动物[8 ] ,本试验通过 DES 诱导 仓鼠生精损害 ,研究枸杞多糖对生精损害的缓解作 用及其对抗氧化系统的影响 ,将枸杞传统的滋阴补 肾功能与现代药理学有机结合 ,为临床筛选抗氧化 药物提供依据 ,为人类及动物的生殖健康提供保障 , 有助于中药产品的国际化。 1 　材料与方法 111 　动物处理 　　成年雄性仓鼠 ( Mesocricet us aurat us ) (购自北 京维通利华实验动物技术有限公司) ,平均体重约 125 g。仓鼠正常饲养 7 d 后 ,随机分为正常对照 组、D ES 组、D ES + LBP 组和 D ES + VC + VE组 (每 组 6 只) 。除正常对照组外 ,其余 3 组分别皮下注射 1 mg/ kg 体重 DES(Sigma 公司 ,橄榄油溶解) ,正常 对照组注射同等剂量橄榄油[ 9 ] ,连续用药 7 d。同时 DES + LBP 组仓鼠灌服 10 mg/ kg [6 ]的枸杞多糖 (曲阜天然绿色工程有限公司 ,纯度 7315 %) 。DES + VC + V E组通过灌服 VC和 VE ,与 LBP 的作用进 行比较 ,VC及 VE剂量分别为 100 mg/ kg[10 ] 和 200 IU/ kg [11 ] 。正常对照组和 DES 组灌服蒸馏水。仓 鼠每天称重 ,处理结束后称取睾丸质量 ,计算睾丸相 对质量 ,相对质量 = 睾丸质量 (g) / 体重 ( kg) 。心脏 采血 ,分离血浆 ,左侧睾丸制作组织匀浆 ,血浆及组 织匀浆用于检测抗氧化酶的活性 ;右侧睾丸用 4 % 多聚甲醛固定 ,用于形态学观察。 112 　组织形态学观察 　　取固定好的睾丸制备 6μm 石蜡切片 , H E 染 色 ,光镜下观察睾丸组织结构。 113 　氧化指标的检测 　　睾丸组织和血浆中超氧化物歧化酶 ( Superox2 ide dismutase , SOD) 、谷胱甘肽过氧化物酶 ( Gluta2 t hione peroxidase , GSH2Px) 、总抗氧化能力 ( Total antioxide capacity , T2AOC) 、丙二醛 (Malondialde2 hyde , MDA)的检测使用相应试剂盒 (购自南京建 成生物制品厂) 。相应方法 :黄嘌呤氧化酶法检测 SOD 含量 ,二硫代二硝基苯甲酸法检测 GSH2Px 含 量 ,化学比色法测定 T2AOC 活性 ,硫代巴比妥酸法 ( TBARs) 检测 MDA 含量 ,考马斯亮蓝法检测蛋白 质含量 ,分光光度计 ( Helios Gamma 型 ,英国产) 测 量其 OD 值。方法及步骤严格按照试剂盒说明书进 行。 114 　统计学处理 　　使用 SPSS12 软件包进行 One Way ANOVA 分析 ,数据以均值 ±差 (珚x ±s)表示 , P < 0101 为 差异极显著 , P < 0105 为差异显著。 2 　结 　果 211 　LBP对仓鼠睾丸形态、质量的影响 　　药物处理后各组仓鼠的体重都有上升的趋势 , 其中对照组上升最快 ,D ES 组最慢 ,但各组之间没 有显著性差异。睾丸形态和质量发生显著变化 , DES 处理组的仓鼠睾丸显著萎缩 ,体积变小 (见图 1) ,质量下降 ,睾丸相对质量降低 (见表 1) ,与对照 组比较差异极显著 ( P < 0101) 。加入 LBP 后 ,睾丸 质量及其相对质量显著回升 ,形态大小基本恢复至 对照组水平。VC及 VE处理组仓鼠的睾丸质量和相 对质量也显著增加 ,但与对照组差异显著 ( P < 0105) (见图 1 和表 1) 。 212 　睾丸组织结构的变化 　　光学显微镜下 ,对照组的仓鼠睾丸结构完整 ,曲 细精管排列整齐 ,管壁中生精细胞轮廓清楚 ,管腔内 充满精子和长形精子细胞 (图 2A) 。1 mg/ kg D ES 356 畜 　牧 　兽 　医 　学 　报 39 卷 　 图 1 　对照组和不同处理组睾丸形态大小的比较 Fig11 　Comparison of testicular shape and size of different groups 处理后 ,曲细精管的管壁变薄 ,管壁中细胞排列紊 乱 ,细胞分层减少且不明显 ,细胞间出现较大的间 隙 ,管腔内有异常脱落的精母细胞和圆形精子细胞 , 几乎所有管腔内均少见或未见有长形精子细胞 (图 2B) 。DES 处理的同时加入 LBP 或维生素后 ,显著 改善了睾丸的组织结构 ,曲细精管生精上皮基本完 整 ,各级生精细胞排列有序 ,管腔中有大量精子 ,与 对照组比较没有明显差别 (图 2C ,2D) 。 表 1 　LBP对仓鼠体重及睾丸质量的影响 Table 1 　Effects of LBP on body weight and testicular weight in hamster 组别 Group 初体重/ g Initial BW 末体重/ g Final BW 睾丸质量/ g Testicular weight 睾丸相对质量/ (g/ kg) Relative testicular weight Control 132. 4 ±11. 7 140. 8 ±6. 1 3. 32 ±0. 21Aa 23. 65 ±2. 02Aa DES 132. 6 ±6. 7 135. 0 ±5. 3 2. 23 ±0. 62Bc 16. 48 ±4. 16Bc DES + LBP 131. 6 ±7. 8 136. 2 ±7. 2 2. 91 ±0. 20ab 21. 35 ±1. 26ab DES + VC + V E 133. 8 ±3. 7 137. 6 ±3. 5 2. 78 ±0. 30b 20. 25 ±2. 48b 同一列数字不同大写上标字母表示差异极显著 ( P < 0. 01) ,不同小写上标字母表示差异显著 ( P < 0. 05) The different lowercase and capital letters followed the data in the same column showed significantly difference at 0105 and 0101 level , respectively A.对照组 ,睾丸生精细胞排列有序 ,轮廓清晰 ,管腔内充满大量精子 ;B. DES 组 ,睾丸生精细胞排列紊乱 ,管腔 内均少见或未见有精子 ; C. DES + LBP 组 ;D. DES + VC + V E组 ,C 和 D 生精上皮基本完整 ,各级生精细胞排列 有序 ,与 A 组接近 A. Control group , all spermatogenetic cells were line up in order and filled with mature sperms ;B. DES group , derangement of spermatogenetic cells and few mature sperms were observed in lumens ; C. DES + LBP group , D. DES + VC + V E group1 Spermatogenic cells were orderly arranged in integrated spermatogenic epithelium in group C and D which was similar with group A 图 2 　LBP对仓鼠睾丸曲细精管及生精细胞形态结构的影响 　标尺示 100μm Fig12 　Effects of LBP on morphology of seminiferous tubules and spermatogenetic cells in hamster 　Bar = 100μm 456 　5 期 马爱团等 :枸杞多糖对 DES 诱导的仓鼠睾丸氧化损伤的保护作用 213 　相关氧化指标的检测 21311 　SOD 的检测结果 　连续应用 7 d DES ,导致 仓鼠睾丸组织和血浆中 SOD 含量显著降低 ,而 LBP 和维生素组均逆转了 SOD 的下降 ,使体内 SOD 含量显著回升 ,均恢复至对照组水平 ,与 DES 组比较差异极显著 ( P < 0101) ,见图 3。 不同大写字母表示差异极显著 ( P < 0101) ,不同小写字母表示差异显著 ( P < 0105) 。下同 The different lowercase and capital letters above the column showed significantly difference at 0105 and 0101 level , respectively1 The same as below 图 3 　LBP对仓鼠睾丸组织和血浆中 SOD 含量的影响 Fig13 　Effects of LBP on SOD contents in testicular tissue and plasma in hamster 21312 　GSH2Px 的检测结果 　经检测 ,连续 7 d 注 射 DES ,使睾丸组织中 GSH2Px 显著下降 ,与对照 组比较差异极显著 ( P < 0101) 。LBP 的加入对睾丸 组织中 GSH2Px 含量没有明显改变 ,但显著提高了 血浆中 GSH2Px 水平 ( P < 0105) ,维生素组睾丸和血浆中 GSH2Px 含量均比 DES 组显著升高 ( P <0105) ,见图 4。 图 4 　LBP对仓鼠睾丸组织和血浆中 GSH2Px 含量的影响 Fig14 　Effects of LBP on GSH2Px contents in testicular tissue and plasma in hamster 21313 　T2AOC 的检测结果 　T2AOC 的变化趋势 与 SOD 相似 ,应用 DES 后 ,睾丸组织和血浆中 T2 AOC 显著下降 ,与对照组比较差异极显著 ( P < 0101) 。LBP 和维生素的使用均显著提高了体内 T2 AOC 含量 ,达到对照组水平 ,与 DES 组比较差异极 显著 ( P < 0101) ,见图 5。 21314 　MDA 的检测结果 　DES 处理后 ,仓鼠睾丸 组织和血浆中 MDA 含量显著上升 ,其变化趋势与 SOD、GSH2Px 和 T2AOC 相反 ,D ES 组与对照组比 较差异极显著 ( P < 0101) 。LBP 和维生素均显著降低睾丸组织中 MDA 含量 ,达到极显著水平 ( P <0101) 。同时 LBP 和维生素显著降低血浆中 MDA含量 ( P < 0105) ,见图 6。3 　讨 　论　　很多雄性生殖系统疾病与接触环境雌激素有关 ,试验证实 ,胚胎期、出生前后或成年动物接触DES 均可导致雄性生殖损害[1 ,9 ] 。枸杞是我国传统 556 畜 　牧 　兽 　医 　学 　报 39 卷 　 的中药材 ,枸杞多糖 (LBP) 为其主要成分。研究证 实 LBP 能够减轻高温引起的小鼠睾丸损伤 ,增加附 睾质量[6 ] 。摘除小鼠半侧睾丸后 ,LBP 可以提高性 激素水平 ,增加副性腺质量 ,提高精子活力[7 ] 。 　　本试验表明 ,连续应用 7 d D ES ,导致睾丸萎 缩 ,绝对和相对质量均显著降低 ,而加入 LBP 后 ,明 显缓解了 D ES 的生殖毒性 ,睾丸质量上升至对照组 水平 (图 1、表 1) 。同时睾丸组织结构有明显的改 善 ,LBP 组仓鼠曲细精管排列整齐 ,管壁中生精细 胞轮廓清楚 ,层次分明 ;管腔内有大量精子 (图 2) , 其结果与对照组接近。维生素 C 和 E 是外源性抗 氧化剂 ,对 ROS 具有很好的清除效果[10211 ] 。VC 和 VE的联合使用 ,也显著改善了 DES 引起的生精损 害 ,使睾丸质量及相对质量显著回升 ,但与对照组存 在显著差异 (图 1 ,表 1) ,因此从睾丸形态及质量来 看 ,LBP 对 D ES 损害的缓解作用优于维生素组 ,提 示枸杞多糖对生殖细胞具有很好的保护作用 ,这与 祖国医学关于枸杞补肾壮阳 ,滋阴生精的理论是一 致的。 　　目前 ,环境雌激素引起的雄性生殖损伤已经得 到公认 ,但其作用机理不明。据报道 ,雄性生精损害 与活性氧 ( ROS) 密切相关[3 ] ,精子对 ROS 很敏感 , 少量的 ROS 就能够干扰生精细胞的功能 ,使 DNA 断裂[2 ] 。生精细胞比体细胞更易受到 ROS 损害的 原因 ,一是生精细胞膜含有丰富的多不饱和脂肪酸 , 容易被氧化 ;另外生精细胞镶嵌在支持细胞膜上 ,支 持细胞产生的 ROS 可直接损伤生精细胞[12 ] 。本试 验中 ,DES 处理组仓鼠睾丸和血浆中 SOD、GSH2Px 和 T2AOC 含量均显著下降 ,而 MDA 上升 ,与对照 组比较有极显著差异 (图 3～6) ,说明 DES 降低抗 氧化酶水平 ,导致生精细胞脂质过氧化 ,干扰细胞正 常功能 ,引起生精损伤。加入 LBP 后睾丸和血浆中 抗氧化酶水平显著上升 ,其中 SOD、T2AOC 含量均 与 DES 组有极显著差异 ( P < 0101) ,达到对照组水 平。血浆中 GSH2Px 也显著上升 , 而睾丸组织 GSH2Px 与 DES 组比较没有显著变化。说明 LBP 通过增加仓鼠体内 SOD 水平 ,提高清除超氧阴离子 自由基的能力 ,使 DES 诱导的氧自由基含量下降。 虽然组织中 GSH2Px 变化不明显 ,但 LBP 组总抗氧 化能力显著提高 ,推测 LBP 通过影响其他抗氧化酶 含量 ,使机体总的清除 ROS 能力上升 ,减轻 ROS 对 生精细胞的损害。 656 　5 期 马爱团等 :枸杞多糖对 DES 诱导的仓鼠睾丸氧化损伤的保护作用 　　研究证实 ,LBP 对机体抗氧化酶活性有显著影 响 ,它能够提高老年小鼠的 SOD、GSH2Px、T2AOC 含量 ,使之恢复至青年鼠水平[13 ] 。另外 LBP 能够 减轻高温引起的小鼠睾丸损伤 ,增加 SOD 含量[6 ] , 还可以减轻 H2 O2引起的生精细胞 DNA 损伤[ 7 ] ,本 试验结果与上述研究类似。 　　维生素 C 和 E 是外源抗氧化剂 ,能够提高机体 抗氧化酶水平 ,增强对 ROS 的清除作用 ,缓解氧化 损伤[ 10211 ] 。本试验证实 ,VC及 VE通过增加体内抗 氧化能力 ,降低脂质过氧化物的含量 ,逆转 DES 引 起的睾丸生殖损伤。维生素组与 LBP 组的各检测 指标均无显著性差异 ,说明枸杞多糖能有效对抗自 由基 ,抑制脂质过氧化 ,从而减弱 D ES 引起的生精 细胞损伤。结果提示 LBP 是缓解环境雌激素生殖 毒性的有效中药成分之一。 参考文献 : [ 1 ] 　PFL IEGER2BRUSS S , SCHU PPE H C , SCHILL W B. 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