乳酸菌抗热保护剂的优化组合

乳酸菌抗热保护剂的优化组合 程艳薇1, 2 ,谭书明3* ( 1. 贵州大学发酵工程与生物制药重点实验室,贵阳 550003; 2. 贵州大学 化学与化工学院,贵阳 � 550003; 3. 贵州大学 生命科学学院,贵阳 � 550003) 摘要:以干酪乳杆菌( L . casei)、鼠李乳杆菌和 3号菌为目标菌株,对喷雾干燥乳酸菌粉抗热保护剂进行 了研究。结果: 高温驯化后干酪乳杆菌、鼠李乳杆菌和 3号菌最高适应温度为 50 � , 通过 L 9 ( 34 )正交 试验,得出干酪乳杆菌高温驯化抗热保护剂最佳配比是在 MRS液体培养基中添加明胶 1. 5 g / dL、蔗糖 6 g / dL、甘油 3 mL/ dL;鼠李乳杆菌的最佳配比为: 明胶 1 g / dL、蔗糖 4 g / dL、甘油4 mL/ dL; 3 号菌的 最佳配比为明胶 1. 5 g/ dL、蔗糖6 g/ dL、甘油 5 mL/ dL。结论:此条件下得到的复合抗热保护剂可以很 好的保护干酪乳杆菌、鼠李乳杆菌和 3号菌的最佳存活率, 以满足将进一步进行的喷雾干燥法制备乳酸 菌粉发酵剂的需要, 所生产的乳酸菌粉的活性能够达到生产泡椒的,进而缩短了泡椒发酵的时间, 保证了泡椒的良好风味。 关键词:干酪乳杆菌;鼠李乳杆菌; 3号菌; 抗热保护剂;组合 中图分类号: T S201. 57 � � � 文献标识码: B � � � 文章编号: 1000- 9973( 2010) 07- 0055- 05 Optimization of lactic acid bacteria combination of heat- resistant protective agent CHENG Yan-w ei1, 2 , T AN Shu-ming3* ( 1. Guizhou U niversity , Guizhou Prov ince Laboratory of Fermentat ion Engineering and Biolo gical Pharmacy , Guiyang 550003, China; 2. Guizhou University, Schoo l of Chemist ry and Chem ical Engineering, Guiyang 550003, China; 3. Guizhou University, College of L ife Science, Guiy ang 550003, China. ) Abstract: L actobacil lus casei ( L . casei) , r hamnose and 3 st rains of Lactobacillus st rains as the goal of spray-dried lact ic acid bacteria pow der heat-protect ive agent w as studied. Results: Af ter the high- temperature domest icat ion , the highest temperatur e of Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnose and 3 bacteria adapts to 50 � , through the L9 ( 34 ) orthogonal experiment, the best rat io o f heat pro- tect ive agent of Lactobacillus casei is to add gelat in 1. 5 g/ dL , sugar 6 g / dL and gly cerol 3 mL/ dL in MRS liquid medium; the best rat io of buckthorn Lactobacillus: Gelat in 1 g/ dL , sugar 4 g / dL and gly cerol 4 mL/ dL ; The best rat io o f Num. 3 bacteria is g elat in 1. 5 g / dL , sugar 6 g/ dL and g lycero l 5 mL/ dL . Conclusion: T he condit ion of the fabricated composite thermal pr otect iv e agents can be pro- tected very well, the best sur vival rate of Lactobacil lus casei, Lactobacillus rhamnose and 3 bacteria can meet the further carried out by spr ay-dried powder prepared by lactic acid bacteria fermentat ion 收稿日期: 2010- 02- 22 � � � � � � � � * 通讯作者 基金项目:贵州辣椒产业化关键技术研究与应用示范,黔科合 NZ 字[ 2005] 3010; 发酵型素辣椒产品加工关键技术研究, 黔科合 GY 字 2007( 3023) , ( 2007 筑科农第 6- 1 号) 作者简介:程艳薇( 1985- ) ,女 ,河北衡水人, 研究生,主要从事农产品加工与贮藏研究工作; 谭书明( 1964- ) ,男 ,贵州湄潭人, 教授,主要从事农产品加工与贮藏研究工作。 �55� 2010 年第 7 期 总第 35 卷 � � � � � � � � � � � � � � � 中 国 调 味 品 CHINA CONDIMENT 试验研究 � � agent needs, the product ion of the act ivity o f lact ic acid bacteria pow der achieves the requirements of the product ion Pickle , there by shortening the fermentat ion t ime, Pickle ensure a good f lav or. Key words: L actobaci l lus casei ; L actobaci l lus buckthorn; No. 3 bacteria; Heat- pr otect iv e agents; combina- t ion � � 乳酸菌是人体肠道中的重要微生物, 与人体健康 息息相关,当其达到一定数量时,它能改善或调节肠道 微生物菌群的平衡, 增强机体免疫力, 降低胆固醇水 平,缓解乳糖不耐症以及抑制肿瘤细胞的形成等, 即起 到健康促进效果 [ 1, 2]。人们生活中无处不显示着乳酸 菌的存在,越来越受到人们喜爱的酸奶,贵州省传统的 泡椒,它们的成功生产都是乳酸菌的功劳。目前, 传统 的乳酸菌发酵剂逐渐被遗弃,取而代之的是一次性直 投式粉末发酵剂。此类发酵剂不仅可以直接用于生产 发酵乳品,也可以作为食品添加剂使用或直接食用。 因此,对乳酸菌粉末发酵剂的研制具有重要的理论意 义与实用价值。国内外有关粉末发酵剂的研制,大多 采用冷冻真空干燥工艺, 此法最大的优点是菌的存活 率高,但工艺复杂, 成本高,难以规模化生产和推广应 用;也有采用喷雾干燥法生产的报道[ 3, 4] 。但从参数 控制来看,为了提高菌存活率,一般控制较低的喷粉温 度,因而不能连续喷粉,喷粉效率较低, 不适于大批量 生产[ 5] 。 本文对干酪乳杆菌、鼠李乳杆菌和 3 号菌抗热保 护剂做了重点研究, 为喷雾干燥法生产干酪乳杆菌粉 发酵剂、鼠李乳杆菌粉发酵剂和 3号菌粉发酵剂提供 理论与实验依据 [ 6, 7]。 1 � 材料与 1. 1 � 材料与仪器 1. 1. 1 � 材料 乳酸菌来源:干酪乳杆菌( L. casei )纯化冻干菌种 广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心 ;鼠李乳杆 菌贵州省贵州大学生命科学学院微生物实验室 ; 6号 菌 贵州省石迁和记绿色食品开发有限公司提供的泡 椒中提取而得。 较为常见抗热保护剂:蔗糖、甘油和明胶。 培养基: MRS 培养基。灭菌前 pH 调至 6. 2~ 6. 4, 121 � 灭菌 20 m in。 1. 1. 2 � 主要仪器 生化培养箱 SPX-250B-Z 型 上海博迅实业有限 公司医疗设备厂; 不锈钢立式电热蒸汽压力灭菌锅 LDZX-4型 上海申安医疗器械厂 ; 电热鼓风干燥箱 成都天宇实验设备有限责任公司 ; 净化操作台 苏州 净化实验设备有限责任公司 ; 天平 T G328 上海 分析天平厂 ; 电冰箱 180-BCD 风华电冰箱厂。 1. 2 � 方法 1. 2. 1 � 真空冷冻干燥菌种的恢复培养 安瓿管开封:用浸过 75%酒精的脱脂棉擦净安瓿 管。用火焰加热其顶端, 滴少量无菌水至加热顶端使 之破裂,用镊子敲下已破裂的安瓿管顶端。 菌株恢复培养: 用无菌吸管吸取 0. 3~ 0. 5 mL 适 宜的无菌生理盐水, 滴入安瓿管内, 轻轻振荡,使冻干 菌体溶解呈悬浮状。吸取全部菌体悬浮液, 移植于建 议的斜面培养基(说明书上附带)上,并在37 � 下培养 2~ 3天,连续培养 3次。 1. 2. 2 � 乳杆菌高温驯化试验 将干酪乳杆菌、鼠李乳杆菌和 3号菌种在 35, 37, 40, 43, 45, 48, 50, 53 � 逐级传代培养各 2~ 3天,使乳 杆菌逐渐适应高温、低湿环境,提高其耐热能力。培养 时采用液体培养基,然后于480 nm 下测定其 OD值选 择其较好的 OD值下的温度进行后期实验。 1. 2. 3 � 抗热保护剂试验 通过上述试验筛选出干酪乳杆菌、鼠李乳杆菌和 3号菌的最高驯化温度, 在高温驯化的过程中传代培 养发现它们的活菌数量均有所减少,为了获取高效(包 括高细胞含量与高细胞活力等)的乳酸发酵剂,需要添 加一些抗热保护剂来提高乳杆菌的菌活量, 同一种保 护剂因添加量不同对菌体细胞在湿热条件下保护效果 也不同。本试验先通过单因素试验在 50 � 培养 48 h 后观察提高菌体存活率的主要影响工艺条件,选用蔗 糖、明胶、甘油为考察因素。 1. 2. 3. 1 � 蔗糖添加量对菌体存活率影响 在一定量的液体培养基中分别加入 4 , 6 , 8 , 10 , 12 g/ dL 蔗糖,接种量均为 2%然后放入 50 � 的培养 箱中培养 48 h,于 480 nm 下测定 OD值。 1. 2. 3. 2 � 明胶添加量对菌体存活率影响 在一定量的液体培养基中分别加入 0. 5 , 1, 1. 5, 2 , 2. 5 g/ dL 明胶, 接种量均为 2%然后放入 50 � 的 �56� 试验研究 � �2010 年第 7 期总第 35 卷 � � � � � � � � � � � � � � � 中 国 调 味 品 CHINA CONDIMENT 培养箱中培养 48 h,于 480 nm 下测定 OD值。 1. 2. 3. 3 � 甘油添加量对菌体存活率影响 在一定量的液体培养基中分别加入 1, 2 , 3 , 4 , 5 mL/ dL甘油,接种量均为 2%然后放入 50 � 的培养 箱中培养 48 h,于 480 nm 下测定 OD值。再根据单因 素试验,采用 L 9 ( 34 )正交试验, 优化合成最佳抗热保 护剂配比,结果见 1。 表 1� 正交试验因素与水平表 Table 1 Factor s and their levels o f ort ho gonal test 水 平 因 � � 素 A 明胶( g/ dL ) B 蔗糖( g / dL) C 甘油( mL / dL ) ) 1 1 2 3 2 1. 5 4 4 3 2 6 5 2 � 结果 2. 1 � 高温驯化结果 高温驯化进行到 50 � 以后, 干酪乳杆菌、鼠李乳 杆菌和3号菌均可以正常生长,但当温度升高至53 � 时,它们完全死亡。所以保留 50 � 所得乳杆菌为菌 种,接种到液体培养基中进行培养。 2. 2 � 单因素试验结果分析 2. 2. 1 � 蔗糖添加量对菌体存活率影响 蔗糖添加量对菌体存活率影响见图 1。 图 1� 蔗糖添加量对菌体存活率的影响 由图 1可以看出, 同一种保护剂因添加量不同对 菌体细胞在湿热条件下保护效果也不同。随着保护剂 添加量增加菌体的存活率不断提高, 而且在相对较低 浓度范围内其菌体存活率随保护剂浓度增加而提高, 但随着浓度的升高这种趋势变慢, 其中干酪乳杆菌在 6 g / dL 时有明显的下降,而鼠李乳杆菌和 3号菌则在 4 g / dL 之后就逐渐的下降。如图 1 中蔗糖的浓度为 4 g / dL时三种菌的 OD值达到最大值。 2. 2. 2 � 明胶添加量对菌体存活率影响 明胶添加量对菌体存活率影响见图 2。 由图 2 可知明胶与蔗糖一样, 明胶的浓度为 1. 0 ~ 1. 5 g / dL 时菌体存活率增加较快, 此后随着浓度的 增加存活率逐渐的降低。根据菌体的存活情况,明胶 的浓度为 1. 5 g / dL 时干酪乳杆菌、鼠李乳杆菌和 3号 菌的 OD值均达到了最大值。 图 2� 明胶添加量对菌体存活率的影响 2. 2. 3 � 甘油添加量对菌体存活率影响 甘油添加量对菌体存活率影响见图 3。 图 3� 甘油添加量对菌体存活率的影响 由图 3可知,甘油浓度由 1 ~ 2 mL/ dL 鼠李乳杆 菌菌体存活率增加较快,随后 3种菌的存活率增加比 较慢。根据菌体的存活情况甘油添加量达 4 mL/ dL 时达到最好。 通过抗热保护剂单因素分析, 得出以下工艺参数 范围:蔗糖添加量 4~ 8 g / dL, 明胶 1~ 2 g/ dL ,甘油 3 ~ 5 mL/ dL。 2. 3 � 抗热保护剂配比正交试验 2. 3. 1 � 干酪乳杆菌抗热保护剂配比正交试验结果与 分析 干酪乳杆菌抗热保护剂配比正交试验结果与分析 见表 2和表 3。 由表 2, 3可看出,影响因素的显著性大小为: 明胶 > 蔗糖> 甘油。根据显著性的结果选择最佳工艺条 件,对显著因素选择最佳水平,不显著因素原则上选择 试验范围内效果较好的一点, OD 值越大说明保护剂 配比效果越佳。根据试验结果与分析, 干酪乳杆菌最 �57� 2010 年第 7 期 总第 35 卷 � � � � � � � � � � � � � � � 中 国 调 味 品 CHINA CONDIMENT 试验研究 � � 佳工艺条件为 A 2B3C1 , 即在基础培养基中添加 1. 5 g/ dL明胶、6 g/ dL 蔗糖、3 mL/ dL 甘油。干酪乳 杆菌能够在最高驯化温度 50 � 生长良好,菌活量可以 达到要求,能达到实际生产中所需的菌量。 表 2� 抗热保护剂配比正交试验结果表 Table 2 The or thogonal test results o f the L . acidop hilus protectiv e agents against heat propor tion 试验号 因 � � 素 A 明胶 ( g/ dL) B蔗糖 ( g/ dL) C甘油 ( mL/ dL) 空白 菌液 OD 值 1 1 1 1 1 1. 118 2 1 2 2 2 1. 153 3 1 3 3 3 1. 268 4 2 1 2 3 1. 150 5 2 2 3 1 1. 195 6 2 3 1 2 1. 360 7 3 1 3 2 0. 973 8 3 2 1 3 0. 969 9 3 3 2 1 0. 992 K 1 1. 180 1. 080 1. 149 1. 102 K 2 1. 235 1. 106 1. 098 1. 162 K 3 0. 978 1. 207 1. 145 1. 129 极差 R 0. 257 0. 127 0. 051 0. 060 � � 注:以上 OD值均为减去空白值后的值。 表 3 � L. casei正交试验方差分析表 Table 3 L. casei Var iance analysis of o rthogonal test 因素 偏差平方和 自由度 F 比 F临界值 显著性 A 明胶 ( g/ dL) 0. 110 2 22. 000 19. 000 * B蔗糖 ( g/ dL) 0. 027 2 5. 400 19. 000 C甘油 ( mL/ dL) 0. 005 2 1. 000 19. 000 误差 0. 01 2 2. 3. 2 � 鼠李乳杆菌抗热保护剂配比正交试验结果与 分析 鼠李乳杆菌抗热保护剂配比正交试验结果与分析 见表 4, 5。 由表 4, 5可看出,影响因素的显著性大小为: 明胶 > 蔗糖> 甘油。根据显著性的结果选择最佳工艺条 件,对显著因素选择最佳水平,不显著因素原则上选择 试验范围内效果较好的一点, OD 值越大说明保护剂 配比效果越佳。根据试验结果与分析, 鼠李乳杆菌最 佳工艺条件为 A 1B2C2 ,即在基础培养基中添加1 g/ dL 明胶、4 g/ dL 蔗糖、4 mL/ dL 甘油。鼠李乳杆菌能够 在最高驯化温度 50 � 生长良好, 菌活量可以达到要 求,能达到实际生产中所需的菌量。 表 4� 抗热保护剂配比正交试验结果表 Table 4 The or thogonal test results o f the L . acidop hilus protectiv e agents against heat propor tion 试验号 因 � � 素 A 明胶 ( g/ dL) B蔗糖 ( g/ dL) C甘油 ( mL/ dL) 空白 菌液 OD 值 1 1 1 1 1 1. 644 2 1 2 2 2 1. 67 3 1 3 3 3 1. 584 4 2 1 2 3 1. 501 5 2 2 3 1 1. 529 6 2 3 1 2 1. 480 7 3 1 3 2 1. 507 8 3 2 1 3 1. 505 9 3 3 2 1 1. 371 K 1 1. 633 1. 551 1. 543 1. 515 K 2 1. 503 1. 568 1. 514 1. 552 K 3 1. 461 1. 478 1. 540 1. 530 极差 R 0. 172 0. 090 0. 029 0. 037 � � 注:以上 OD值均为减去空白值后的值。 表 5 � 正交试验方差分析表 T able 5 Variance analy sis of or thogonal test 因素 偏差平方和 自由度 F 比 F临界值 显著性 A 明胶 ( g/ dL) 0. 048 2 24. 000 19. 000 * B蔗糖 ( g/ dL) 0. 014 2 7. 000 19. 000 C甘油 ( mL/ dL) 0. 002 2 1. 000 19. 000 误差 0. 01 2 2. 3. 3 � 3号菌抗热保护剂配比正交试验结果与分析 抗热保护剂配比正交试验结果与分析见表 6, 7。 表 6� 抗热保护剂配比正交试验结果表 Table 6 The or thogonal test results o f the L . acidop hilus protectiv e agents against heat propor tion 试验号 因 � � 素 A 明胶 ( g/ dL) B蔗糖 ( g/ dL) C甘油 ( mL/ dL) 空白 菌液 OD 值 1 1 1 1 1 0. 712 2 1 2 2 2 0. 810 3 1 3 3 3 0. 817 4 2 1 2 3 0. 866 5 2 2 3 1 1. 195 6 2 3 1 2 1. 164 7 3 1 3 2 0. 507 8 3 2 1 3 0. 840 9 3 3 2 1 0. 803 K 1 0. 780 0. 695 0. 905 0. 903 K 2 1. 075 0. 948 0. 826 0. 827 K 3 0. 717 0. 928 0. 840 0. 841 极差 R 0. 358 0. 253 0. 079 0. 076 � � 注:以上 OD值均为减去空白值后的值。 �58� 试验研究 � �2010 年第 7 期总第 35 卷 � � � � � � � � � � � � � � � 中 国 调 味 品 CHINA CONDIMENT 表 7� 3 号菌正交试验方差分析表 Table 7 No . 3 Va riance analysis of o rtho gonal test 因素 偏差平方和 自由度 F 比 F临界值 显著性 A 明胶 ( g/ dL) 0. 220 2 22. 000 19. 000 * B蔗糖 ( g/ dL) 0. 119 2 11. 900 19. 000 C甘油 ( mL/ dL) 0. 011 2 1. 100 19. 000 误差 0. 01 2 � � 由表 6, 7可看出,影响因素的显著性大小为: 明胶 > 蔗糖> 甘油。根据显著性的结果选择最佳工艺条 件,对显著因素选择最佳水平,不显著因素原则上选择 试验范围内效果较好的一点, OD 值越大说明保护剂 配比效果越佳。根据试验结果与分析, 3号菌最佳工 艺条件为 A 2B2C3 ,即在基础培养基中添加1. 5 g / dL明 胶、6 g / dL 蔗糖、5 mL/ dL 甘油。3 号菌能够在最高 驯化温度 50 � 生长良好, 菌活量可以达到要求,能达 到实际生产中所需的菌量。 3 � 讨论 文章主要研究的是喷雾干燥之前的准备工作, 由 高温驯化到抗热保护剂复合最佳配比。高温驯化 后干酪乳杆菌、鼠李乳杆菌和 3号菌最高适应温度为 50 � ,通过 L 9 ( 34 )正交试验,得出干酪乳杆菌高温驯 化抗热保护剂最佳配比是在 MRS 液体培养基中添加 明胶 1. 5 g/ dL、蔗糖6 g / dL、甘油 3 mL/ dL; 鼠李乳杆 菌的最佳配比为: 明胶 1 g / dL、蔗糖 4 g/ dL、甘油 4 mL/ dL; 3 号菌的最佳配比为明胶 1. 5 g/ dL、蔗糖 6 g / dL、甘油 5 mL/ dL。三种抗热保护剂保护效果比 较研究表明,明胶的抗热保护效果最好,其次为蔗糖、 甘油。得到的结论为进一步开发适宜生产泡椒的乳酸 菌粉发酵剂提供依据, 也为泡椒生产的稳定与缩短发 酵时间提供有力保障。 参考文献: [ 1] FULLERR. 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(上接第 51 页)反应有一定的抑制作用。而加入多少浓 度比的花椒油对油脂的氧化反应抑制效果最好,有待 进一步的研究。 花椒油测定总还原力时, 在波长 700 nm 处有最 大吸收峰出现, 故采用此波长值测定总还原力。而在 不同花椒油浓度下, 总还原力不同,浓度越大还原力越 大,呈现线性相关。花椒对环境适应力极强, 极易生 长,资源丰富,在我国各地普遍栽培,是一种原料广、效 果好、安全可靠、性价比高的新型天然抗氧化食物。 由于花椒油的抗氧化性,若在使用油脂中加入一 定量的花椒油对人体有一定的保健作用, 还能提高产 品的耐藏性。 参考文献: [ 1]邓鹏, 王守经 , 王文亮� 食用油氧化机理及检测方法研究 [ J]� 中国食物与营养, 2002( 8) : 17-18� [ 2]柳红 , 张静� 不同南瓜多糖体外清除羟基自由基作用的研 究[ J]� 植物学研究, 2007, 2( 4) : 357� [ 3]郭雪峰 , 岳永德 , 汤锋, 等� 用清除超氧阴离子自由基评价 竹叶提取物抗氧化能力[ M]� 北京:光谱与光谱分析, 2008: 1823-1824� [ 4]夏其乐 , 陈建初 , 吴丹� 杨梅叶提取物抗氧化活性的研究 [ J]� 食品科学, 2004, 5( 8) : 80-83� [ 5]梅盛华, 张伟忠� 碘量比色法测定食品油脂中过氧化值的 研究[ J]� 海峡预防医学杂志, 2000, 6( 2) : 48� [ 6]豆海港 , 陈文学 , 仇厚援 , 等� 花椒提取物抗氧化作用研究 [ J]� 食品研究与开发, 2006, 27( 7) : 14-16� [ 7]胡天喜. 发光分析[ M ]� 上海: 华东师范大学出版社 , 1990: 48-67� [ 8] Simonian NA , Coy le JT� Ox idativeStress inneurodegenerative disease[ J]� Annu Rev phammcol Tox ico1, 1996( 36) : 83� [ 9]凌关庭� 抗氧化食品与健康[ M ]� 北京 : 化学工业出版社, 2004: 22-47� �59� 2010 年第 7 期 总第 35 卷 � � � � � � � � � � � � � � � 中 国 调 味 品 CHINA CONDIMENT 试验研究 � �