10肽的人工合成

nullnull第 5 章肽 的 人 工 合 成null肽化学合成原理和液相合成法氨基酸保护基肽键生成法液相法合成策略固相合成和自动化肽合成仪酶促肽合成和半合成内 容 提 要（第十讲）null四、在研究蛋白质高级结构中的应用用化学修饰法可以区分某种基团在蛋白质分子中的存在状态。化学修饰可用来测定蛋白质分子中特定基团之间的距离。化学修饰可用来研究蛋白质在溶液中的构象。化学修饰可用于制备含重原子的蛋白质衍生物。五、确定氨基酸残基的功能化学修饰结合保护实验可研究底物或其它配位体对修饰速度和程度的影响。果糖-6-磷酸激酶磷酸吡哆醛修饰酶活力丧失果糖-2，6-磷酸存在保护激酶活力两个Lys被修饰说明了Lys对酶的重要性null若修饰的可逆性与生物功能的改变有对应关系，也能为确定某一残基的可能功能提供有用证据。磷酸甲羟 戊酸激酶修饰一个Cys酶活力全部 丧失用DTT修饰酶活力全部 恢复说明Cys可能是酶活性部位所必需的氨基酸。化学修饰还用于蛋白质变构部位上氨基酸残基的，以及相互作用所必需残基的表征。六、在蛋白质免疫化学研究中的应用放射免疫技术已广泛用于蛋白质、多肽的检测和定量。用化学修饰还可以消除医用酶的抗原性，提高其在体内的寿命。抗体+酶戊二醛产物产物既保留抗体的原有活性又保留酶活性。天冬酰胺酶聚乙二醇修饰酶活性丧失85%但完全消除 了抗原性null七、蛋白质化学修饰在生物中的应用（一）提高酶的稳定性酶固定化技术的基础也是蛋白质化学修饰，所不同的是引入酶分子的不是化学基团，而是大分子载体。酶共价连接在固相载体的固定化，原则上可增加酶分子的构象稳定性。（二）改变酶的专一性黄素的溴酰衍生物可与木瓜蛋白酶的半胱氨酸共价结合，结果将具有水解酶活性的木瓜蛋白酶转变为具有氧化还原活性的黄素木瓜蛋白酶。（三）创造新的酶活性将胰凝乳蛋白酶上的Met-192修饰成亚砜，可使修饰酶在合成Z-L-Tyr-D-Mer-OMe中的催化活性保持92%。null第八节 蛋白质化学修饰的局限性（四）生产实际上的应用用甲醛使细菌毒素和病毒改性，使毒素失活和杀死病毒，从而不能产生毒性作用和致病效应，却保持其免疫性。在食品工业上,用化学修饰可以除去食品中不希望有的杂质和怪味，增加食品的营养价值。化学修饰氨基，可防止蛋白质氨基与食品中各种糖发生羰-胺反应，影响其风味。null影响蛋白质功能基反应性的因素：微区的极性；氢键效应;静电效应;位阻效应。修饰剂反应性的决定因素：选择吸附；静电相互作用；位阻因素；催化因素；局部环境的极性。修饰反应专一性的控制：试剂的选择； 反应条件的选择； 反应的专一性；蛋白质侧链的修饰：氨基的修饰引入正电荷的修饰电荷消失的修饰引入负电荷的修饰null精氨酸胍基的修饰羧基的修饰巯基的修饰组氨酸咪唑基的修饰色氨酸吲哚基的修饰酪氨酸酚基的修饰甲硫氨酸甲硫基的修饰丝氨酸羟基的修饰蛋白质肽链的交联反应的专一性； 交联距离； 可裂解性； 反应活性。交联剂同型双功能试剂异型双功能试剂可被光活化试剂.亲和标记内生亲和试剂外生亲和试剂null1953年，du Vvignedud首次合成了多肽激素—催产素；1963年，R.Svchwyzer合成了含24个氨基酸残基的促肾上腺皮质激素（ACTH）；1965年，中国科学家合成了由51个氨基酸残基组成的牛胰岛素；1979年，矢岛治明等人用液相法合成了含124个氨基酸残基的牛胰核糖核酸酶。第一节 肽化学合成原理和液相合成法多肽合成分三步：1.α-氨基和α-羧基以及侧链基团的保护。2.羧基的活化和形成肽键。3.脱除保护基和纯化。null缩合-H2O脱保护保护基全脱除(三肽)+X、Y分别为α-氨基和α-羧基保护基，Z1、Z2、Z3分别 是侧链基团R1、R2、R3的保护基。null一、氨基酸保护基分为烷氧羰基酰基烷基烷氧羰基保护基可防止消旋化， 常被采用。用得最普遍的是：苄氧甲酰基（Z）、叔丁氧羰基（Boc）、 芴甲氧羰基（Fmoc）Z基可用钯黑、5～20%钯炭催化氢化法脱除。Boc基团易于酸解脱除。Fmoc基团对酸稳定，可被碱解除。尤其适合于合成含有 Trp、Met、Cys等对酸不稳定的多肽。（一）α-氨基保护基null1.2.（二）α-羧基保护基羧基保护基一般以盐或酯的形式加以保护。常用的盐有钾盐、钠盐、三乙胺盐、三丁胺盐等。常用的酯类有：甲酯和乙酯、苄酯、叔丁酯。叔丁酯最 常用，该基团可用酸在温和条件下脱除。Fmoc基团null（三）侧链保护基1.赖氨酸的ε-氨基保护ε-氨基的保护与α-氨基不同，该保护基在肽链合成后才 除去，并且侧链ε-氨基的保护无消旋问题，所以要选择 与α-氨基保护基不同脱除方式的保护基。可选用酰基型保护基，如苄氧甲酰基Z、叔丁氧甲酰 基Boc、芴甲氧羰基Fmoc等。2.侧链羧基的保护在一般情况下，天冬氨酸和谷氨酸的侧链羧基需用苄酯 和叔丁酯保护。在引入保护基前，先对天冬氨酸的α-氨 基和羧基保护，然后引入侧链保护基团。Bocnull为了减少副产物的产生，采用新的保护基。β-环烷醇酯金刚烷醇酯薄荷醇酯3.胍基保护常用的胍基保护基分为硝基、烷氧羰基、磺酰基、和 三苯甲基。近年来常用4-甲氧-2，3，6-三甲基苯磺酰基。4.半胱氨酸的巯基保护巯基常用的保护基有三种用TFA等可脱除的基团用(CF3COO)3Ti/TFA脱除,对酸 稳定的基团是对弱酸稳定的基团（Mtr）null5.丝氨酸和苏氨酸的保护需要对侧链羟基进行保护，常用的保护基为叔丁基和苄 基。6.酪氨酸的保护酪氨酸的酚基可用叔丁基保护。7.谷氨酰胺和天冬酰胺的保护谷氨酰胺和天冬酰胺在肽合成中一般不用保护，在合成 大肽时才加以保护。色氨酸、组氨酸和甲硫氨酸的侧链也需要保护。组氨酸易发生消旋化，用苄氧甲基等保护基，抑制消旋 效果好。null二、肽键生成法X取代基的电负性越强，对羧基的活化能力就越强。肽键缩合法有：氨基被保护的氨基酸对硝基苯酯能与另一个氨基酸氨基 缩合成肽。（一）活化酯法此法特征：1.与混合酸酐法相比，活化酯法的中间体可以分离、 结晶、保存。null2.氨基组分的末端羧基可以不保护。3.活化酯法对谷酰胺、天冬酰胺特别有效。(二）缩合剂法DCCH+null+DCU二肽DCU大部分在有机溶剂中溶解度很小，难过滤，现采用 水溶性碳二亚胺作缩合剂。（三）叠氮法由小肽进一步缩合成大肽时，常用叠氮法。此法不引起 消旋，产物的光学纯度高。+ 碱·HN3碱二肽null（四）混合酸酐法此法简单、纯度高，适合于小肽的合成。+（副反应）null三、脱保护基及纯化（一）TFA法TFA可脱除一些不耐酸的保护基。TFA脱保护的缺点：氨基保护基需要几种精氨酸的侧链保护基Mtr难脱除TFA用量大（二）HF法HF法的缺点：产生副反应HF有强腐蚀性此法温和，副反应少，较多用于固相合成中。人甲状腺激素的合成是用此法脱除的保护基。null（三）有机磺酸法因为磺酸的腐蚀性弱，不需要特殊装置，操作比HF法 简便。（四）含硅试剂法TMSOTf和TMSBr二种保护方法，脱保护效率高，可脱除常用的各种保护基。（五）二硫键的生成1.（CF3COO)3Ti法可脱除半胱氨酸的各种S-保护基团，而且方法简单。但色氨酸和甲硫氨酸需加以保护。2.亚砜介导法用不同的Cys亚砜和酸处理方法，可在需要的位置定点 生成不同的二硫键。null（六）合成肽的纯化合成出的肽是粗产品，需用适当的方法纯化。（七）合成肽纯度鉴定四、肽的液相法合成策略分为逐步延长法片段缩合法（合成小肽常用此法）（合成大肽常用此法）（一）如何划分肽段考虑因素：以不易消旋的Gly、Pro等作为肽段的C末端；氨基酸和 保护基的性质对肽段纯化难易的影响；不超过10个氨基 酸残基等。null（二）以什么顺序连接肽段类型：大片段缩合法较大片段缩合法较小片段缩合法1.大片段缩合法+++2.较大片段缩合法+null3.较小片段缩合法用方法1，大片段缩合反应有时难进行；用方法2，缩合反应较易进行，但纯化困难；用方法3，虽步骤多，但缩合产率高，精制容易。null第二节固相肽合成和自动化肽合成仪一、固相肽合成基本原理将氨基酸的C末端固定在不溶性树脂上，然后在此树脂 上依次缩合氨基酸，延长肽链的固相合成法。（一）Boc固相法基本过程：将目标多肽的C末端羧基以共价键形式与 一个不溶性的高分子树脂相连，然后以这个氨基酸的 氨基为起点，与另一分子的羧基作用形成肽键。不断 重复这一过程，可以得到目标多肽产物。（二）Fmoc固相法Boc固相法不适于合成含色氨酸等对酸不稳定的肽类， 1978年Fmoc固相法开始应用。null（三）液相法和固相法的主要优缺点固相法简单快速，但产品纯度不如液相法，固相法适于 合成10～30肽或纯度不高的肽。液相法适于合成纯度高、较大的肽，合成大量小肽时， 液相法也比固相法经济、有效。null氨基酸保护基α-氨基保护基α-羧基保护基侧链保护基赖氨酸ε-氨基保护侧链羧基保护胍基保护半胱氨酸的巯基保护丝氨酸和苏氨酸的保护酪氨酸的保护谷氨酰胺和天冬酰胺的保护null肽键生成法活化酯法缩合剂法叠氮法混合酸酐法脱保护基TFA法HF法有机磺酸法含硅试剂法二硫键生成(CF3COO)3Ti法亚砜介导法肽液相合成逐步延长法片段缩合法肽固相合成Boc固相法Fmoc固相法null第 6 章蛋 白 质 分子构象null蛋白质结构层次多肽链立体结构原理二级结构超二级结构三级结构四级结构内 容 提 要null  蛋白质结构层次聚合体  蛋白质结构层次图示null二、构象与构型的区别构型：在立体异构体中，取代原子或基团在空间里的 取向。构象：单键旋转时，分子中的基团或原子可能形成的 不同的空间排列。两者区别：构型改变，涉及共价键的断裂和生成。构象 改变，不涉及共价键的断裂和生成。三、研究构象的必要性蛋白质功能，不仅与蛋白质一级结构有关，而且与蛋白 质的空间结构有关。四、蛋白质构象研究进展以1959年为分界线，蛋白质可将结构研究分二个发展 时期：