GENE ENGINEERING基因重组与基因工程

null基因重组与基因工程 Genetic Recombination & Genetic Engineering 基因重组与基因工程 Genetic Recombination & Genetic Engineering nullPauI Berg (保罗.伯格) 1973年发明 重组DNA技术 荣获1980年 诺贝尔化学奖 null台湾动物科技研究所 2003年 null中山大学实验动物中心 陈系古教授null2000年法国科学家，兔子“Alba”null著译者: 黄培堂 出版者：科学出版社 出版时间：2002.09 原著：J.萨姆布鲁克 D.W.拉塞尔 定价：￥168.00 字数：2917千字 页数：1949页 null中译本序/译者的话/第三版前言 第1章 质粒及其在分子克隆中的应用 第2章 λ噬菌体及其载体 第3章 M13噬菌体载体 第4章 高容量载体的应用 第5章 DNA凝胶电泳和脉冲场琼脂糖凝胶电泳 第6章 真核基因组DNA的制备和分析 第7章 真核mRNA的提取、纯化和分析 第8章 聚合酶链式反应体外扩增DNA 第9章 放射性标记DNA探针与RNA探针的制备 第10章 合成寡核苷酸探针 第11章 cDNA文库制备及其基因鉴定null下册 第12章 DNA测序 第13章 诱变 第14章 达文库的筛选 第15章 在大肠杆菌中表达克隆化基因 第16章 哺乳动物培养细胞中导入克隆化基因 第17章 哺乳动物培养细胞的基因表达分析 第18章 蛋白质相互作用研究技术 附录1 分子克隆中使用的缓冲液和试剂的配制 附录2 培养基 附录3 载体和细菌菌株 附录4 分子克隆所用的酶 附录5 酶的抑制物 附录6 核酸 附录7 密码子和氨基酸 附录8 分子克隆中的常用技术 附录9 检测系统 附录10 DNA陈列技术 附录11 生物信息学 附录12 告戒 附录13 供应商 附录14 商标 索引null引言 第一节　基因工程的基本程序 第二节　基因工程常用的工具酶 第三节 基因工程常用的载体 第四节 基因工程在医学和制药 工业中的应用null 目的要求： 1. 掌握重组DNA和基因工程的基本概念； 2. 掌握基因工程的基本程序; 3. 熟悉基因工程在医学和制药 工业中的应用； 4. 了解基因工程常用的工具酶和载体。引 言引 言21世纪核心的科学技术： 现代生物技术(生物工程) 计算器微电子技术 新 新能源 航天技术 现代生物技术： 基因工程（核心技术） 蛋白质工程 酶工程 细胞工程引 言引 言分子克隆(molecular cloning) DNA克隆(DNA cloning) 基因克隆(gene cloning) 重组DNA(recombinant DNA) 分子克隆技术(molecular cloning technique) DNA克隆技术(DNA cloning technique) 基因克隆技术(gene cloning technique) 重组DNA技术(recombinant DNA technique) 基因工程(gene engineering)引 言引 言重组DNA(recombinant DNA) ： 就是对不同生物的遗传物质——目的基因，在体外使用一种工具酶，用人工的方法，进行“剪切”、“组合”、“拼接”，使遗传物质按照我们的意愿重新组合，然后通过运载物质（质粒、噬菌体、病毒等）转入微生物体内或动、植物细胞内（统称载体），进行无性繁殖，并使我们需要的基因在细胞中表达出来，产生出我们所需要的产物或组成新的生物类型。null 重组DNA是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序。null基因工程(gene engineering): 是指重组DNA的产业化与应用，包括上游和下游两大组成部分。上游部分指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA）；而下游部分则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。 实现重组DNA所采用的方法及相关的工艺统称基因工程。 null理论基础： ①不同基因具有相同的物质基础； ②基因是可切割的； ③基因是可以转移的； ④多肽和基因之间存在对应关系； ⑤遗传密码是通用的； ⑥基因可以通过复制把遗传信息传给下一代。null历史： 1973 Cohen第一例成功的克隆实验 1978 Genentech公司 人胰岛素 世界 上第一种基因工程蛋白药物 1982 第一个基因工程药物--重组人胰岛素 在英、美获准使用 1985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊）， 中国 转基因鱼 null1993 基因工程西红柿在美国上市 1997 英国罗斯林研究所 多莉羊 1999.9 中国获准加入人类基因组计 划.负责测定人类基因组全部 序列的1% 2000.6.26 科学家公布人类基因组工 作草图 2001.2.11 公布人类基因组基本信息null胰岛素 人生长激素 干扰素 白细胞介素2 粒细胞集落刺激因子 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 红细胞生成素 EPO 组织纤溶酶原激活剂 生长激素 促生长素 抗血友病因子Ⅷ 脱氧核糖核酸酶 葡糖脑苷脂酶 鼠单克隆抗体null体内-体外第一节　基因工程的基本程序第一节　基因工程的基本程序获得目的基因和载体； 目的基因和载体的连接(体外重组)； 连接产物(重组体)导入宿主细胞； 重组体的扩增、筛选； 目的基因在细胞中的表达、分离、纯化、鉴定等。null载体目的片断酶 切酶 切重组体连接导入细胞筛 选扩增、表 达、纯化等null获得目的基因和载体——切 目的基因和载体的连接(体外重组)——接 连接产物(重组体)导入宿主细胞——转 重组体的扩增、筛选——筛 目的基因在细胞的表达、分离、纯化、鉴定等。 一、目的基因的获得一、目的基因的获得null1、化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。 局限性：短片段、简并性、高费用 null2、基因组DNA文库(genomic DNA library) 存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合。null组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌nullnull 3、cDNA文库： 以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，即获得cDNA文库(cDNA library)。null组织或培养细胞载 体mRNAcDNAcDNA与载体连接导入大肠杆菌鉴定cDNA文库的克隆数与特征null4、PCR方法获取：二、重组DNA导入受体细胞二、重组DNA导入受体细胞null感受态： 指受体(或者宿主)处于最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态。 null将宿主菌在LB平板上划线，37℃培养16-20h。 挑取单菌落转入20ml LB培养基锥瓶中，37℃振荡过夜。 从中取2ml菌液转入50ml LB培养基中37℃振荡培养4-5h， 测OD600达0.4-0.5。 培养物于冰上10min。 转入50ml离心管，于4000rpm下4℃离心10min。 弃上清，倒置离心管1min，流尽剩余残液然后加入10ml冰预冷的 0. 1M CaCl2，置冰上10min。 4000rpm 4℃离心10min，弃上清。 加入2ml，0.1M CaCl2悬浮细胞，于4℃过夜。# 感受态细胞制备null转化(transformation)： 在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新遗传特性的一种方法。 转染(transfection) : 指病毒或以它为载体构建的重组子导入真核细胞的过程。null感染(infection) : 以噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞内扩增。 转导(transduction) : 指以噬菌体为载体，在细菌之间转移DNA的过程，有时也指在真核细胞之间通过逆转录病毒转移和获得细胞DNA的过程。 null1. 重组体导入大肠杆菌 （1）氯化钙法 （2）电穿孔法(electroporation) （3）病毒感染法/体外包装法# 氯化钙转化法# 氯化钙转化法在1.5ml Eppendorf管中加入200 μl感受态细胞和10μl 40ng DNA溶液， 温和混匀，于冰上30min。 于42℃水浴90S。 冰浴2min。 加入800μl LB液体培养基37℃ 45min。 取200μl涂布于含Amp(50μg/ml)琼脂糖平皿，37℃培养12-16h，观察结果。# 电穿孔法# 电穿孔法nullnullDNA MovementDNA Movementnullnull2. 重组体导入哺乳动物细胞 （1）磷酸钙共沉淀法 （2）脂质体介导法：人工细胞膜 （3）病毒感染法 （4）显微注射法三、 DNA重组体的筛选与鉴定三、 DNA重组体的筛选与鉴定null1. 根据重组载体的表型进行筛选 null普通抗菌素平板筛选： 插入失活筛选： nullα-互补——蓝-白斑筛选： 含LacZ基因（编码β半乳糖苷酶）该酶能分解生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)产生蓝色，从而使菌株变蓝。当外源DNA插入后，LacZ基因不能表达，菌株呈白色，以此来筛选重组细菌。称之为蓝-白斑筛选。nullIPTG; X-gal(5- 溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷) null2. DNA限制酶切图谱分析null bp —1534 — 994 — 695 — 515 — 377 — 237 A B C M null3. PCR鉴定 null4. 利用核酸杂交和放射自显影进行鉴定 null ★ 基因工程的基本程序 ★ 基因工程的基本程序获得目的基因和载体——切 目的基因和载体的连接(体外重组)——接 连接产物(重组体)导入宿主细胞——转 重组体的扩增、筛选——筛 目的基因在细胞的表达、分离、纯化、鉴定等。 基因工程技术策略基因工程技术策略分： 基因载体 目的基因 质粒 噬菌体 病毒 直接分离 cDNA 人工合成 基因文库 切： 限制性内切酶 有缺口的载体 目的基因 接： 连接酶 粘端连接 平端连接 尾接法 重组体 转： 转化 转染 体外包装 带重组体的宿主 筛： 表型筛选 电泳法 核酸杂交第二节　基因工程常用的工具酶第二节　基因工程常用的工具酶一、限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶概念：是由细菌产生的一种能识别双链DNA中的特定序列，并以内切方式水解核酸链中磷酸二酯键的核酸内切酶，又叫切割酶或限制酶。 分类：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。以Ⅱ型为主。 命名原则：null常用限制性内切酶的种类： null# 识别和切割位点： 5‘粘性末端： 5‘-GAATTC-3’ 5’-G AATTC-3’ 3‘-CTTAAG-5’ 3’-CTTAA G-5’ 3‘粘性末端： 平端或钝端： EcoRⅠ+二、连接酶与连接二、连接酶与连接连接方式： nullnullnullnull三、DNA聚合酶三、DNA聚合酶分类： DNA聚合酶Ⅰ DNA聚合酶大片段（Klenow片段） Taq DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶： 耐受高温， 70-75℃ 时具有最佳的生 物活性。主要用于 PCR。四、 RNA聚合酶(逆转录酶) 四、 RNA聚合酶(逆转录酶) 作用： RT-PCR RNA DNA 第三节 基因工程常用的载体第三节 基因工程常用的载体载体(vector) ： 装载目的基因的工具。 本质是DNA。 分类： 克隆载体； 表达载体。null常用的载体： 质粒(plasmid)； 噬菌体(phage)； 酵母载体(yeast vector)； 病毒载体(virus vector)。null质粒 (plasmid)： 是细菌染色体以外的遗传物质，是环状闭合的双链DNA 质粒(plasmid)： 质粒(plasmid)： 基本特征： 复制起点 启动子 多克隆位点 加尾信号 筛选标记null载体的选择标准(以质粒为例)： 能自主复制； 具有两个以上的遗传标记物，便于重 组体的筛选和鉴定； 有克隆位点(外源DNA插入点)，常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。质粒(plasmid)： 质粒(plasmid)： 作用：装载小于2kb的目的DNAnull 2. 噬菌体(phage)： 感染细菌的病毒称为噬菌体。 作用：装载大片断DNA，从6-8kb、 10-20kb、30-45kb不等nullnull吸附吸附是噬菌体与菌体表面受体发生特异性结合的过程，其特异性取决于噬菌体蛋白与宿主菌表面受体分子结构的互补性。null毒性噬菌体的复制周期—溶菌性周期null3. 酵母载体(yeast vector)： 酵母人工染色体(yeast artificial chromosome, YAC)：可接受2Mb的外源 DNA插入，是人类 基因组计划物理图 普绘制采用的主要 载体。null4. 病毒载体(virus vector): 作用：在真核细胞或者哺乳动物细 胞中表达外源基因。 种类： 昆虫杆状病毒载体； SV40病毒载体； 逆转录病毒载体； 腺病毒载体； 痘苗病毒载体等。 null第四节 基因工程 在医学和制药工业中的应用第四节 基因工程 在医学和制药工业中的应用一、医学基础研究一、医学基础研究★当今人类疾病的发展趋势： ★研究疾病的分子机制： 二、基因诊断二、基因诊断 1. 基因探针——基因水平的诊断： 亲子鉴定：“爆棚”现象 产前诊断： 个人基因信息身份证： 2. 抗原或者抗体——蛋白质水平： 乙肝核心抗原/e抗原： 三、基因治疗三、基因治疗null1.基因治疗的概念 狭义指将具有正常功能的基因置换或者增补体内缺陷的基因，从而达到治病的目的。 广义指将某遗传物质转移到患者体内，使其在体内表达，最终达到治疗某种疾病的方法，均谓之基因治疗。 2. 基因治疗的方式2. 基因治疗的方式基因修复/矫正(gene correction) 基因置换(gene replacement) 基因增补/修饰(gene augmentation) 基因失活(gene inactivation)： RNA干扰(RNA interference, RNAi) 基因敲除(gene knock-out) 自杀基因(suicide gene) 单纯疱疹病毒胸苷激酶基因HSV- tk(丙氧鸟苷GCV-磷酸化GCV)null1990年，美国科学家成功治愈了患有严重复合型免疫缺陷疾病(S C I D)(腺苷酸脱氨酶缺陷)的4岁女孩艾姗蒂。nullnull用基因治疗血友病四、转基因动物四、转基因动物null GFP nullnull 我国培养的转基因兔，转入的乙型肝炎表面抗原基因已在基因兔体内整合并表达。 兔研人员将乙型肝炎表面抗原基因注入兔受精卵的情形。null美国通过基因工程将人的基因植入牛的体内，由转基因公牛受精的母牛产下5头健壮的牛犊，每头都含有一个人类的基因。null null 1998年，中国人-曹谊林在美国麻省大学查里斯•文森提(Charles Vacanti)的实验室创造该奇迹。null 中科院水生生物研究所培育的转基 因鲤鱼，表现出快速生长效应。null五、生物制药(包括疫苗和抗体)五、生物制药(包括疫苗和抗体)nullnull为什么？ 随心所欲 低成本 剧增效应等null我国第一个实现产业化的生物高技术产品，人α型基因工程干扰素。null1309元/支，14支/盒，21天1个疗程null世界生物技术药品市场：null世界生物技术药品市场：null1——1996年；2——1997年； 3——2000年；4——2003年。中国生物技术药品市场：null 截至目前，我国只有２０个生物技术药品投入市场，而现在世界上可以生产１４０多种。 有资料显示美国对生物技术的投资已超过500亿美元，而我国总投入大约60亿元，还不及国外大公司一个基因药物一年的销售收人。中国生物技术药品市场：null2006年４月２６-２７日“博鳌亚洲论坛国际医药产业大会” 在江苏泰州举行： 在全球中药市场，130多亿美元，日本占80%，韩国占10%，我们只占3%。 六、基因工程与中医中药现代化六、基因工程与中医中药现代化中药品种的改良： 关木通： 清心火，利小便； 马兜铃酸、肾损害； 肾损害 null 秋水仙： 秋水仙碱(毒!) 秋水仙酰胺 (低毒) null基因工程生产中药有效成分： 人参——14肽 蜃麝香——抗炎 白花蛇舌草——催产肽 null中药药理靶基因的研究： “方剂配伍理论”null证的科学本质的研究： 证相关基因群的克隆、功能研究 null☆ 基因工程的危险性“超级动物”已非异想天开； “跨类生物”后果不堪设想； 基因工程对环境的安全性； 基因工程食品对人的影响； 基因组计划对人权的威胁； 种族主义可能复活。null基因工程的安全管理 1993年12月24日，中华人民共和国国家科学技术委员会颁布了《基因工程安全》，由总则、安全等级和安全性评价、申报和审批、安全控制措施、法律责任和附则共六章组成。 1997年7月，中华人民共和国农业部颁布了《农业生物基因工程安全管理实施办法》。1998年，农业部农业生物基因工程安全管理办公室和农业部生物基因工程安全委员会共对2批68项申请进行了评审，同意商品化申请2项、同意环境释放10项，同意和认可中间试验39项，暂不同意或不认可16项。小 结小 结概念：DNA重组和基因工程 基因工程的基本程序 基因工程常用的工具酶 基因工程常用的载体 基因工程在医学和制药工业中的应用nullnull