第 20卷第 4期
2010年 7月 �
江 苏 大 学 学 报 (医 学 版 )
Journa l o f Jiangsu Un ive rsity( M ed icine Ed ition)
� Vo.l 20 No. 4
July 2010
� � � � � �
IL �9在变应性鼻炎患者外周血单个核细胞中的表达水平
吉均祥 1, 钱 � 炜1, 邹 � 晨 1, 马永明1, 林志强 1, 陈建国1, 杨先知 2, 王胜军2
( 1.江苏大学附属人民医院耳鼻咽喉头颈外科, 江苏镇江 212002; 2.江苏大学基础医学与医学技术学院免疫学系, 江苏 镇江 212013 )
[摘 � 要 ] � 目的: 检测变应性鼻炎患者 IL�9的表达水平,探讨 IL�9在变应性鼻炎发生发展中的意义。方法: 收集 49
例变应性鼻炎患者的外周血标本,其中未治疗组 30例, 临床缓解组 19例, 另取 30例健康志愿者的外周血标本作为正
常对照组。采用实时荧光定量 PCR ( QRT�PCR )检测 IL�9基因在外周血中的表达水平, 酶联免疫吸附试验 ( EL ISA )检
测血浆 IL�9含量。结果: 变应性鼻炎未治疗组外周血单个核细胞中 IL�9 mRNA表达水平及血浆 IL�9含量明显高于
变应性鼻炎临床缓解组和正常对照组 (P < 0. 05), 而变应性鼻炎临床缓解组与正常对照组比较差异无统计学意义。
变应性鼻炎未治疗组 IL�9 mRNA表达水平与临床评分呈正相关。结论: 变应性鼻炎患者外周血单个核细胞中 IL�9
呈高表达。 IL�9可能参与了变应性鼻炎的病理过程, 具体机制有待进一步探讨。
[关键词 ] � 变应性鼻炎; 白细胞介素�9; 实时荧光定量 PCR
[中图分类号 ] � R765. 21� � [文献标志码 ] � A� � [文章编号 ] � 1671- 7783( 2010) 04- 0277- 05
� � [基金项目 ] 国家自然科学基金资助项目 ( 30871193, 30972748) ;江苏省卫生厅面上项目 ( BS2007041, 200952) ;江苏省教育厅自然科学基
金资助项目 ( 08K JB320002 );镇江市社会发展项目 ( SH 2008042)
[作者简介 ] 吉均祥 ( 1973� ) ,男,江苏镇江人,硕士研究生;王胜军 (通讯作者 ) ,教授,博士生导师, E�m a i:l s jw js@j u js. edu. cn
Expression of IL�9 in peripheral blood mononuclear cell
w ith allergic rhin itis patients
JI Jun�x iang1, QI AN W ei1, ZOU Chen1, MA Yong�ming1, LIN Zhi�qiang1, CH EN J ian�guo1,
YANG X ian�zhi2, WANG Sheng �jun2
( 1. Departm en t ofOtolaryngology, th eA ff iliated Peop les'H osp ita lof JiangsuUn ivers ity, Zhen jiang J iangsu 212002; 2. Departm ent of Imm unol�
ogy, Schoo l ofM ed ical Science and Laboratory M ed icin e, Jiangsu Un iversity, Zhen jiang J iangsu 212013, Ch ina)
[Abstract] � Objective: To establish a m ethod o f real�t ime fluorescence quantitative PCR for detecting
IL�9 mRNA in human peripheral b loodmononuc lear cell ( PBMC ), and investigate the re lationsh ip betw een
the expression o f IL�9 and allergic rhin it is ( AR) . Methods: ThemRNA levels of IL�9 in PBMC were de�
term ined by quant itat ive rea l�tim e PCR ( QRT�PCR) , and detected the concentrations o f IL�9 in plasma by
enzyme linked immunosorbent assay ( ELISA ) in 49 patients, inc lud ing 30 untreated AR patients and 19
patients in recovering phase, and 30 hea lthy contro l vo lunteers. Results: IL�9mRNA expression and IL�9
concentrations in the g roup of 30AR pa tients w ithou t treatm entw eremarkedly higher than that in the groups
of 19AR pat ients in clin ica l rem ission and 30 hea lthy controls (P < 0. 05). but there w ere no significan t
differences betw een the groups of AR in c lin ical rem ission and norm al contro l (P > 0. 05) . Furthermore,
the result of th is study show s a positive ly correlated betw een IL�9mRNA and c lin ical count in un treated AR
patients. Conclusion: These resu lts indicated that IL�9 w as higher in AR patients w ithout treatmen,t and
suggesting tha t IL�9m ight be involved in the patho log ica l process o fAR. The ro le of IL�9 in process of AR
rema ins further investigation.
[Keywords] � a llerg ic rh initis; IL�9; real�tim e quant itat ive PCR
� � 变应性鼻炎 ( allerg ic rh initis, AR ) 又称过敏性
鼻炎, 是耳鼻咽喉头颈外科的常见病之一,其发病率
有逐渐增高的趋势 [ 1]。 IL�9可通过抑制嗜酸性粒细
胞的凋亡和促进 IL�5介导的嗜酸性粒细胞前体的
成熟来增加组织中的嗜酸性粒细胞 [ 2- 5] ; 另外, IL�9
能增加肥大细胞表面 IgE高亲和受体 �( Fc�R I�)
的表达和产生炎症介质的量, 使得肥大细胞对变应
原做出反应 [ 5] ;并可刺激上皮细胞而导致嗜酸性粒
细胞和 T淋巴细胞的浸润, 诱导上皮细胞表达产生
粘蛋白 [ 3- 6] ;同时, IL�9还可通过作用于平滑肌细胞
来招募嗜酸性粒细胞,进而促进 IL�8的释放来招募
更多的中性粒细胞, 从而在炎症的发生发展中起到
重要作用 [ 7- 9]。本研究通过检测变应性鼻炎患者外
周血单个核细胞 ( peripheral b lood mononuclear cel,l
PBMC)中 IL �9 mRNA的相对表达水平和外周血中
IL�9蛋白的表达水平, 以探讨其在变应性鼻炎中的
表达变化及与变应性鼻炎发生、发展的相关性。
1� 材料与方法
1. 1� 材 � 料
1. 1. 1� 临床
及标本 � AR患者未治疗组为按
照中华医学会耳鼻喉科学分会 2004年兰州会议变
应性鼻炎诊断
[ 10] , 2008年 12月至 2009年 9月
在江苏大学附属人民医院就诊的 30例患者 (男 14
例,女 16例,年龄 13~ 49岁,平均 29岁 ) , 均有 AR
典型症状,经过粉尘螨、屋尘螨、豚草等 20种常见阳
性变应原血清特异性 IgE检测, 至少一种为阳性;临
床缓解组为 AR发作期患者经皮质类固醇激素鼻喷
剂雷诺考特、辅舒良、内舒拿等药物治疗后 (每日 2
次,每次 1~ 2喷 )临床症状缓解 1个月后复诊,并经
疗效评分标准显示为有效或显效的 19例患者 (男 9
例,女 10例, 年龄 14~ 39岁,平均年龄 24岁 )。另
选 30例健康志愿者作为正常对照组 (男 14例, 女
16例, 年龄 18~ 42岁, 平均年龄 27岁 ), 均无 AR
病史及哮喘、特应性皮炎等其他变应性疾病史,吸入
组变应原血清特异性 IgE过筛试验检测阴性。根据
AR症状和体征评分方法筛选 AR临床缓解组患者。
疗效判定标准: (治疗前总分 -治疗后总分 ) /
治疗前总分 100% , ! 66%为显效, 65% ~ 26%为
有效, ∀ 25%为无效。
AR未治疗组的 30例患者经治疗后,其中 20例为
显效, 5例为有效, 5例为无效, 25例有效或显效患者停
药 1个月后有 3例重新出现部分症状且评分低于显效
标准。我们去除无效及症状复发的,取 19例显效和有
效且停药 1个月症状未复发的为临床缓解组。
1. 1. 2� 主要试剂 � 人淋巴细胞分离液 (天津灏洋
生物制剂公司 ) , T rizol ( Inv itrogen公司 ), 逆转录试
剂盒 ( TOYOBO 公司 ) , SYBR Prem ix Ex Taq、
PMD18T�A克隆试剂盒 ( TaKaR a公司 ), 人 IL�9
ELISA试剂盒 ( eB iosience公司 )。
1. 2� 方 � 法
1. 2. 1� 引物
及合成 � 根据基因库中目的基因
序列,用 Prem ier 5. 0软件设计目的基因检测引物,
由上海生物工程技术公司合成,序列见表 1。
表 1� QRT�PCR检测引物序列及扩增范围
Tab 1� Dection prem ier sequence and am plif ied range
引物名称 引物序列 扩增范围
IL�9 5#�CCAGCTTCCAAGTGCCACTGC�3∃
5#�TGCATGGTGGTATTGGTCATCTG�3# 125 bp
�肌动
蛋白
5#�GGGACTATCCACCTGCAAGA�3#
5#�CCTCCTTGGCGTAGTAGTCG�3# 265 bp
1. 2. 2� PBMC的分离 � 用肝素抗凝管收集健康志
愿者、AR患者外周血 2 m ,l PBS以 1 %1稀释,混匀,
沿管壁轻缓移入放有等体积 F ico ll�泛影葡胺 (人淋
巴细胞分离液 )离心管, 1 500 r/m in, 15m in, 离心半
径 10 cm, 吸取分层液的云雾层, PBS洗涤, RPM I�
1640完全培养基 ( 10%小牛血清、100U /m l青霉素、
100 U /m l链霉素 )重悬, 计数, 以 1 106个细胞 /m l
加 1m lTrizo,l置 - 70 & 冰箱冻存。
1. 2. 3� 构建目的基因质粒标准品 � 以上述制备的
cDNA为模板, 选取下列最佳的特异性扩增条件: ∋
反应体系: 10 PCR缓冲液 2 ! ,l dNTP 1. 6 ! ,l上下
游引物各 0. 3 ! l( 10 pmo l/L ) , cDNA模板 1. 0 ! ,l
Taq DNA聚合酶 ( 5 U /!l) 0. 2 ! ,l M gC l2 ( 25 mmo l/
L ) 0. 8 ! ,l ddH2O 13. 3 !l。 ( 反应条件: 变性,
94 & 30 s; 退火, IL�9 58 & ( �肌动蛋白 56 & )
30 s;延伸, 72 & 30 s, 35个循环。将目的基因 PCR
扩增产物 T�A克隆,转化 DH5�感受态,挑取阳性克
隆质粒,并送上海生物工程公司测序鉴定。所选阳
性质粒倍比稀释至 108 ~ 104拷贝数 /! ,l备用。
1. 2. 4� Ro tor�G ene 6000荧光定量 PCR仪检测目的
基因表达 � 采用绝对定量法检测目的基因 mRNA
的表达水平, SYBR Green )法检测荧光。所有样本
的检测值都用 �肌动蛋白进行校准。
1. 2. 5� 统计学处理 � 所有数据应用 SPSS17. 0统计
软件中 K ruska l�Wallis H检验, 3组数据进行两两比
278 � � � � � � � � � � � � 江 苏 大 学 学 报 (医 学 版 ) � � � � � � � � � � � � � � � � � 第 20卷
较利用 N emeny i法检验, 采用 Spearman秩相关分
析,以 P< 0. 05为差异有统计学意义。
2� 结 � 果
2. 1� IL �9和 �肌动蛋白基因 PCR扩增产物
以 AR患者外周血 cDNA为模板, PCR扩增 IL�
9和 �肌动蛋白基因, 2%琼脂糖凝胶电泳鉴定,结
果见图 1。
1: DL2000标准参照物; 2: IL�9; 3: �肌动蛋白
图 1� AR患者外周血 IL�9和 �肌动蛋白
PCR扩增产物鉴定
F ig 1� Iden tif ication of amp lif ication of IL�9 and �actin
by PCR in patients w ith AR
2. 2� 实时荧光定量 �PCR法建立 �肌动蛋白和 IL�9
标准曲线
以 �肌动蛋白各梯度浓度标准质粒为模板,
定量 PCR扩增 �肌动蛋白,重复 3次。图 2a为熔
解曲线, 未见杂峰, 表明扩增特异性较好; 图 2b为
QRT�PCR扩增动力学曲线, 呈典型的 S形, 平台期
汇于一条直线上, 指数区明显, 斜率大且固定 (平
行线 ) ;图 2c为定量结果, 显示标准品浓度梯度对
应的扩增后的拷贝数; 图 2d中标准曲线的斜率为
3. 371; 截距为 40. 703; 相关系数为为 0. 99; 扩增
效率 0. 98。以不同浓度梯度 IL�9标准质粒为模
板, QRT�PCR扩增 IL�9, 重复 3次。图 3a为熔解
曲线, 峰尖在同一中轴上, 表明扩增特异性较好;
图 3b为 QRT�PCR扩增动力学曲线, 平台期集中同
一直线上,指数区明显, 斜率固定; 图 3c为定量结
果,显示与标准品浓度梯度相对应的扩增后的拷
贝数; 图 3d中标准曲线的斜率为 3. 513; 截距为
34. 214;相关系数为 0. 999; 扩增效率为 0. 93。
图 2� �肌动蛋白标准品实时荧光定量 PCR扩增效果
F ig 2� Expre ssion of �actin standard sam ple by rea l tim e quan titative�PCR
279第 4期 吉均祥, 等. IL�9在变应性鼻炎患者外周血单个核细胞中的表达水平
图 3� IL�9标准品实时荧光定量 PCR扩增效果
F ig 3� Expre ssion of IL�9 standard sam ple by real tim e quan titative�PCR
2. 3� AR患者未治疗组、AR临床缓解组与健康对
照组 IL �9 mRNA表达比较
实时荧光定量 PCR方法检测 3组 IL �9 mRNA
相对表达。结果显示, AR未治疗组、AR临床缓解
组和正常对照组之间 IL �9 mRNA相对表达水平比
较差异有统计学意义 (P < 0. 05)。其中, AR未治疗
组 IL�9 mRNA的相对表达水平明显高于临床缓解
组和正常对照组 ( P < 0. 01) ; 而临床缓解组 IL �9
mRNA的相对表达水平与正常对照组比较差异无统
计学意义 (P > 0. 05)。见图 4。
图 4� IL�9mRNA在 AR未治疗组,缓解组和
健康对照组的表达水平
F ig 4� Expression of IL�9mRNA in AR untreated,
clin ica l rem ission and healthy control
2. 4� AR患者 IL �9mRNA相对表达水平与症状、体
征记分相关性
结果表明, AR患者未治疗组 IL �9 mRNA相对
表达水平与症状、体征记分呈正相关 ( n = 30, r =
0. 602, P < 0. 001)。见图 5。
图 5� AR患者 IL�9mRNA相对表达水平与症状、
体征记分相关性
Fig 5� Correlation betw een IL�9mRNA and
c lin ical count
2. 5� AR患者血浆 IL�9表达水平
30例 AR未治疗患者、19例 AR临床缓解者和
30例健康志愿者的血浆严格按 IL�9 ELISA试剂盒
操作说明检测,采用非参数秩和检验统计分析,结果
以箱图表示 (图 6) , AR未治疗患者血浆 IL�9的含
量高于 AR临床缓解者和健康志愿者 (P < 0. 05 ),
AR临床缓解者和健康志愿者之间比较差异无统计
学意义 (P > 0. 05)。
3� 讨 � 论
在哮喘病患者体内, IL�9作用于炎症细胞和组
织细胞,使淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞的量
增多,提高了 IgE的分泌量,增强了肥大细胞对变应
原的反应,诱导黏蛋白的表达,并促进炎症细胞分泌
280 � � � � � � � � � � � � 江 苏 大 学 学 报 (医 学 版 ) � � � � � � � � � � � � � � � � � 第 20卷
图 6� IL�9在 AR未治疗组, 缓解组和健康
对照组的表达水平
F ig 6� Expression of IL�9 in AR untrea ted, c lin ical
rem ission and healthy con trol
一些细胞因子参与炎症反应。随着研究的进一步发
展,还认为 IL�9在气道高反应性和哮喘表型中起了
重要的作用 [ 11, 12 ]。
本研究检测了 AR患者外周血单个核细胞中
IL�9的 mRNA和蛋白表达水平, 结果发现 AR患者
未治疗组 IL�9的表达水平高于 AR患者临床缓解组
和健康对照组,而 AR患者缓解组与健康对照组 IL�
9的表达水平无显著性差异, 提示 AR患者体内存
在着 IL�9的高表达, 进一步研究表明 IL�9的表达水
平与疾病的临床评分呈正相关。提示了 IL�9在 AR
的发生发展中可能起着重要的作用。
N ico laides等 [ 12]的体外试验已经证实 IL�9的产
生与 Th9的数量密切相关, 而 IL�9又可促进 Th9细
胞分泌 IL�9,并具有维持 Th9表型的功能,因而,有
可能在变应性疾病免疫内环境 IL�9促进了 Th9细
胞的分化,而 Th9的增多使得 IL�9的分泌又增多,
从而形成一条正反馈的效应。这一机制的存在还有
待于进一步探讨。
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[收稿日期 ] � 2010- 05- 09� � [本文编辑 ] � 郭 � 欣
281第 4期 吉均祥, 等. IL�9在变应性鼻炎患者外周血单个核细胞中的表达水平