g_HA_PLA复合材料的细胞反应和血液相容性研究

中国科学: 生命科学 2010年 第 40卷 第 8期: 745 ~ 750 SCIENTIA SINICA Vitae www.scichina.com life.scichina.com 英文版见: Li J, Zheng W, Zheng Y F, et al. Cell responses and hemocompatibility of g-HA/PLA composites. Sci China Life Sci, 2010, 53, in press 《中国科学》杂志社 SCIENCE CHINA PRESS 论 文 g-HA/PLA 复合的细胞反应和血液相容性研究 李佳①②, 郑卫①, 郑玉峰①*, 娄峡①③ ① 哈尔滨工程大学材料科学与化学工程学院生物医学材料与工程研究中心, 哈尔滨 150001; ② 哈尔滨理工大学化学与环境工程学院, 哈尔滨 150040; ③ Nanochemistry Research Institute, Department of Chemical Engineering, Curtin University of Technology, Bentley WA9102, Australia * 联系人, E-mail: yfzheng@hrbeu.edu.cn 收稿日期: 2010-04-12; 接受日期: 2010-05-09 高等学校博士学科点(批准号: 20060217012)和哈尔滨工程大学中央高校基础科研业务费专项基金(批准号: HEUCF101003)资助项目 摘要 将表面改性后的羟基磷灰石颗粒同聚乳酸复合得到新型复合材料可望用于骨替代领 域, 本文旨在研究此种复合材料的血液相容性和细胞反应. 将 L-乳酸低聚物接枝到羟基磷灰石 表面, 得到接枝羟基磷灰石颗粒. 之后, 将 g-HA颗粒同 PLA进行共混获得 g-HA/PLA复合材料. 先前研究表明, 由于提高了聚合物基体和 HA 颗粒之间的界面黏附力, 这些材料的拉伸性能得 到了明显提高. 为进一步考察这些材料在骨修复及其他整形外科方面的潜在应用, 进行了一系 列体内和体外实验来测试其细胞反应及血液相容性. 体外实验表明, g-HA/PLA复合材料有利于 L-929 细胞的生长. 复合材料的溶血率低于纯 PLA. 皮下植入实验表明, g-HA/PLA 复合材料的 软组织反应比较合适. 以上结果提示, g-HA/PLA 复合材料是一种安全的材料, 有望用于组织工 程研究. 关键词 聚乳酸 羟基磷灰石 复合物 生物相容性 细胞毒性 由于羟基磷灰石(hydroxyapatite, HA)在结构和 组成上与成骨矿物类似, 并且具有优异的生物活性 和骨传导活性, 因此目前已是临床上重要的陶瓷材 料之一[1]. 然而, 由于 HA 的力学性能较差、脆性大、 对负荷承载性差, 从而限制了它的临床应用. 为了改 善 HA 的力学性能, 一些 HA/聚合物复合材料受到了 许多研究人员的关注 [2,3]. 其中 , 聚乳酸(poly lactic acid, PLA)常被用作可生物降解的骨修复复合材料的 基体[4,5]. 由于HA和PLA具有明显不同的化学特性, 使得 作为填料的 HA 和 PLA 基体之间缺乏较强的黏附力. 在植入人体后, 颗粒和基体间的界面会逐渐被破坏, HA 粒子容易从聚合物基体上脱离下来, 从而导致材 料力学强度迅速降低. 因此, 提高 HA 颗粒与 PLA 基 体之间的界面黏附性成为制备 HA/PLA 复合材料的 关键[6]. 制备了 L-乳酸低聚物接枝改性的 HA(g-HA)/PLA 复合材料 [7]. 同普通的 HA/PLA 复合材料相比 [8,9], g-HA 颗粒同 PLA 基体的黏附力得到了提高 , g-HA/PLA 复合材料的拉伸强度和模量也得到了明显 增加[7]. 进一步考察这些材料在骨修复及临床方面的 应用. 本实验探讨了 g-HA/PLA 复合材料的体外细胞毒 性和体内生物相容性. 其中体外细胞毒性采用 L-929 细胞作为模型细胞. 血液相容性采用溶血率来评价. 将材料植入兔皮下组织 8 周后, 进行组织学观察. 李佳等: g-HA/PLA 复合材料的细胞反应和血液相容性研究 746 1 材料与方法 1.1 g-HA/PLA 复合物棒材的制备 g-HA 颗粒的制备方法见本实验室先前报道 [7]. 其改性过程如图 1 所示. 为了使 HA 颗粒能够均匀地 分散在四氢呋喃中, L-乳酸要逐滴加入. 加入甲苯后, 将混合物加热至 85℃并保温 6~8 h. 反应结束后, 将 所得产物用乙酸乙酯反复清洗, 然后加入 L-丙交酯, 以辛酸亚锡为催化剂, 于 130℃下聚合 24 h. 之后将 产物溶解于三氯甲烷中, 于 5000×g 下离心, 再用过 量的三氯甲烷反复清洗, 真空干燥后得到 L-乳酸低 聚物接枝改性的 HA(g-HA). 将 g-HA 和 PLA 放置在 10 cm×8 cm×1.1 cm 的模 具中, 于 6.0 MPa, 160℃压制 20 min, 压成片状, 将 其切削并磨成直径为 2.5 mm、长 1 cm 的棒材. 用相 同的方法加工获得 PLA 棒. 1.2 SEM 观察 测试前将所需测试的材料断面进行喷金处理 , 利用飞利浦公司生产的热场发射扫描电子显微镜FEI Sirion 200 型观察材料的断面形貌. 1.3 体外细胞反应 采用鼠纤维原细胞(L-929)研究 g-HA/PLA 复合 图 1 改性羟基磷灰石(g-HA)制备示意图 中国科学: 生命科学 2010 年 第 40 卷 第 8 期 747 物的细胞反应. 将 L-929 细胞用 DMEM 培养液(10% 牛血清, 100 U/mL 青霉素, 100 μg/mL 链霉素)进行培 养(37℃, 5%CO2). 实验采用间接接触方法进行测试. 浸提采用 DMEM 无血清培养基作为浸提介质. 参照 ISO 10993-5: 1999[10]和 ISO 10993-12: 1996[11], 按 1.25 mL/cm2(培养基 /样品 )的比例 , 在 37℃, 5%CO2的条件下将试样浸泡于 DMEM 培养基中浸提 72 h, 然后用 0.22 μm 无菌滤膜过滤. 保证所用浸提 液的保存时间不超过 24 h. DMEM和含 10%二甲基亚 砜(DMSO)的培养液分别作为阴性对照组和阳性对照 组. 细胞在 96 孔培养板中于 37℃下培养 24 h(5×103 个/孔), 将培养介质除去, 加入 100 μL 浸提液. 在 37 , 5%CO℃ 2 的条件下分别培养 1, 2 和 3 天后, 在光 学显微镜下观察细胞变化情况. 每孔加入 10 μL 无菌 3-(4, 5-二甲基-2-噻唑)-2, 5-二苯基溴化四唑(MTT), 37℃培养 4 h 后, 每孔再分别加入 100 μL 的甲臜, 放 置过夜. 在 Elx-800 酶标仪(bio-Tek instruments)上读 取 570 nm 波长吸光度. 1.4 统计学处理 细胞培养实验至少进行 3 次 . 所有数据都以 x ±SD 表示, 采用 Microsoft Excel 软件进行分析. 用 Student’s t-test 评估统计显著性, 以 P<0.05 示差异有 统计学意义. 1.5 溶血测试 取健康新西兰白兔血 , 按比例加入草酸钾(1.0 mg/mL), 然后加入生理盐水进行稀释(体积比 4︰5). 取实验材料 0.5 g(30 mm×8 mm×1 mm)浸入 10 mL 生 理盐水中(之前于 37℃保温 30 min), 之后加入 0.2 mL 稀释血液, 并于 37℃保温 60 min. 阴性对照和阳性对 照组分别采用生理盐水和蒸馏水. 然后在 1000 ×g 下 离心 5 min, 取上清液在 545 nm 用 721 紫外可见分光 光度仪测量其吸光度(A). 每组取 5个, 计算平均 值. 溶血率按下式计算: 溶血率= ×100% 1.6 体内植入 将棒状的 5% (重量百分比, 下同)g-HA/PLA 复 合物与 PLA 分别用 70%的乙醇和磷酸缓冲液(PBS) 各洗 3 次, 灭菌干燥后待用. 选用 18 只体重在 2.5~3.5 kg 之间的新西兰大白 兔作为植入实验动物. 静脉注射戊巴比妥(30 mg/kg) 麻醉, 手术在无菌条件下进行. 选择兔背部对称 4 点作为植入点, 每个点做 1.5 cm 的切口, 之后将消毒的棒状样品, 或是纯 PLA 或 是 5% g-HA/PLA 复合材料植入皮下肌肉内(图 2(A)), 缝合皮肤. 术后将兔子放于笼中饲养, 保持正常饮食. 分别于手术后 1, 4 和 8 周注入过量的戊巴比妥处死动 物, 将材料 5 mm 周围的组织一起取出(图 2(B)~(D)), 进行组织观察. 1.7 组织学检查 取出的组织于 10%(体积比)缓冲福尔马林中固 定, 在乙醇中脱水后, 石蜡包埋切片, 经伊红-苏木素 (H&E)染色后, 观察组织细胞核和细胞质. 2 结果与讨论 2.1 SEM 图 3 为 5% HA/PLA 和 5% g-HA/PLA 复合材料 断面的 SEM 图. 可见, 同未改性的 HA 相比, 改性后 的 g-HA 颗粒在 PLA 基体当中分散的更加均匀, 团聚 程度减弱. 图 2 g-HA/PLA 复合材料棒的植入 (A) 将复合材料棒植入皮下肌肉组织; (B) 植入 8 周后打开植入部 位; (C) 植入 8 周后将复合材料棒取出, 材料棒保持最初形状; (D) 植入 8 周后在复合材料棒周围取出的组织 实验组(A)−阴性对照组(A) 阳性对照组(A)−阴性对照组(A) 李佳等: g-HA/PLA 复合材料的细胞反应和血液相容性研究 748 图 3 5% HA/PLA(A)和 5% g-HA/PLA(B)表面的 SEM 图 2.2 g-HA/PLA 复合材料的体外细胞反应 图 4显示, 纯 PLA和 g-HA/PLA复合材料的浸提 液在不同培养时间(1, 2, 3 天)鼠纤维原细胞 L-929 的 细胞增殖率(以阴性对照组细胞增殖率的百分比表 示). 虽然同阴性对照组相比, 纯 PLA 和 g-HA/PLA 复合材料浸提液的细胞增殖率均有轻微下降, 但纯 PLA 和 g-HA/PLA 复合材料之间并没有明显区别. 纯 PLA的细胞增殖率是 89.1%~98.6%, 而复合材料的细 胞增殖率为 90.8%~97.0%. 表明, 同纯 PLA 一样, g-HA/PLA 复合材料也有利于鼠纤维原细胞 L-929 的 增殖和黏附. 同时表明, g-HA/PLA 复合材料对鼠纤 维原细胞 L-929 无细胞毒性. 图 5 显示, 鼠纤维原细胞 L-929 在阴性对照组、 阳性对照组、纯 PLA 和 g-HA/PLA 复合材料的浸提 液中培养 3 天后的细胞形态. 在纯 PLA 和 g-HA/PLA 图 4 在纯 PLA 和 g-HA/PLA 复合材料的浸提液中培养 1, 2 和 3 天后的细胞增殖率 复合材料的浸提液和阴性对照中, 细胞均呈现出健 康细胞扁平的梭形生长形貌(图 5(A)~(E)). 同阴性对 照样品(图 5(A))一样, 在复合物中也可见细胞明显增 长(图 5(C)~(E)). 对于 PLA 来说, 细胞的增殖受到限 制(图 5(B)). 而对于阳性对照组(图 5(F)), 细胞的生 长受到有毒基质的抑制. MTT 和光学显微镜观察结 果都表明, g-HA/PLA 复合材料能够有利于 L-929 细 胞的生长. 2.3 g-HA/PLA 复合材料的血液相容性 图 6显示, 纯 PLA和 g-HA/PLA复合材料的溶血 率. 同纯 PLA 相比, 所有 g-HA/PLA 复合材料的溶血 图 5 L-929 细胞在各组中培养 3 天后的光学显微镜观察 (A) 阴性对照组; (B) 纯 PLA; (C) 5% g-HA/PLA; (D) 10% g-HA/PLA; (E) 20% g-HA/PLA 的浸提液; (F) 阳性对照组 图 6 纯 PLA 和 g-HA/PLA 复合材料的溶血率 中国科学: 生命科学 2010 年 第 40 卷 第 8 期 749 率都有所下降. 随着 g-HA 含量由 5%增加到 10%再到 20%时, 复合材料的溶血率则从 2.05%降到 1.87%再到 1.66%. 上述结果表明, g-HA 颗粒具有良好的血液相 容性, 它的加入不会破坏 PLA 的相容性. 此外, 纯 PLA 和 g-HA/PLA 复合材料的溶血率都低于 5%. 2.4 复合材料的体内研究 体内研究表明, 植入体内 8周后, 直径为 2.5 mm 的复合材料棒材外观形貌没有太大变化(图 2(C)). 组 织学观察表明, 植入 1 周后, 5% g-HA/PLA 复合材料 和纯 PLA 周围肌肉组织纤维发生变性坏死, 肌纤维 结构模糊(图 7(A)和(B)). 肌纤维之间可见大量淋巴 细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞等炎性细胞浸润 . 炎症反应区存在大量的纤维素样渗出物. 炎症反应 可能与材料植入操作过程所导致肌纤维损伤有关 . 这些炎性细胞在植入 4 周后消失(图 7(C)和(D)). 因 此, 可以推断其炎症反应可能是由于材料植入时操 作所导致肌纤维发生变性坏死. 植入 4 周后, 5% g-HA/PLA 复合材料和纯 PLA 周围肌纤维排列整齐、结构完整, 肌纤维间不可见巨 噬细胞及嗜中性粒细胞, 仅有少量淋巴细胞存在于 肌纤维之间. 与植入 1 周时相比, 炎症反应明显变弱. 植入 8 周后, g-HA/PLA 复合材料包埋材料周围未见 炎症细胞出现(图 7(E)和(F)). 可见肌纤维结构完整, 其中均匀分布着纤维细胞和胶原纤维. 就肌纤维结 构而言, 4 周与 8 周差异不大. 总之, g-HA/PLA 复合材料和纯 PLA 分别植入动 物皮下时, 其周围软组织反应无明显差别(图 7(A)~ (F)), 因此可以确认 PLA 和 g-HA/PLA 复合材料在植 入生物体内后, 其体内生物相容性没有明显不同. 在 植入 8 周后, 组织学观察未发现巨噬细胞和炎症细胞 出现, 从而表明在实验期内, g-HA/PLA 复合材料具有 很好的生物相容性, 并且不会诱发组织反应. 3 结论 本文研究了 g-HA/PLA 复合材料的细胞毒性、血 液相容性和植入炎性反应. 结果表明, g-HA/PLA 复合 材料无细胞毒性. g-HA 颗粒具有很好的血液相容性, 不会破坏 PLA 基体的生物相容性. 组织学观察表明, 材料植入 8 周后未引起炎症反应, 表明 g-HA/PLA 复 合材料具有良好的生物相容性. 虽然对于这些材料的 长期降解还需进一步研究, 但通过上述结果, 此种材 料很有希望应用于临床研究. 图 7 材料植入皮下肌肉组织不同时间的组织学观察(20×) (A) 1 周后 PLA; (B) 1 周后 5% g-HA/PLA; (C) 4 周后 PLA; (D) 4 周后 5% g-HA/PLA; (E) 8 周后 PLA; (F) 8 周后 5% g-HA/PLA. ly: 淋巴细胞; mac: 巨噬细胞; neu: 嗜中性粒细胞 李佳等: g-HA/PLA 复合材料的细胞反应和血液相容性研究 750 参考文献 1 Viswanath B, Ravishankar N. 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