小鼠睾丸发育全过程中cyclin B1和Bax基因的表达

小鼠睾丸发育全过程中cyclin B1和Bax基因的表达 “大学生创新性实验”项目表 二、项目简介 精子发生是一个极特殊的生殖细胞分化过程。在精子发生中，众多相关基因调控着细胞的增殖和凋亡，因此，研究细胞周期调控基因及细胞凋亡相关基因在精子发生过程中的表达既可以进一步探讨生殖细胞的发育机制，又可以从另一个角度揭示细胞周期调控及凋亡的分子生物学机制;同时对阐明细胞周期调控基因和凋亡相关基因在睾丸发育过程中的生理功能具有重要的实践意义。 有研究结果表明，精子细胞中大量存在的cyclin B1 蛋白是作为一种细胞分裂完成的信号 ,为启动精子细胞变态所必需,另一种可能的解释是精子细胞的核骨架和核基质中有cyclin B1蛋白的作用底物,而cyclin B1蛋白可能参与精子变态时的核骨架变化。调节核浓缩和核包装，cyclin B1基因的这种转录后贮存以及在精子细胞变态时瞬时表达的特点，无疑对生精过程的正常进行具有重要意义。 Bcl-2 和Bax是与凋亡密切相关的基因，二者具有同源性，Bcl-2是最为熟悉的抑凋亡基因，而Bax则是促凋亡基因，Bcl-2抑制凋亡必须通过与Bax形成异源二聚体来实现，二者的比例决定精子细胞凋亡趋势。有研究结果表明，Bax基因的缺失导致生精细胞大量凋亡。就此确定《小鼠睾丸发育全过程中ClclinB1和Bax基因表达》相关研究计划。 本实验为了探求cyclin B1和Bax在精子和卵子发生过程中的作用机制，根据前期研究基础选取值得深入研究的切入点，有的放矢制订小鼠睾丸的取材时段，以昆明种正常小鼠的睾丸为材料，从出生后第1天开始，此后每3天取材一次，直至出生后第58天(此间共取材20次)，上一次取材和下一次取材之间的间隔很短，可以完全覆盖小鼠睾丸发育全过程，选取两个值得研究的基因，在小鼠睾丸发育过程中采用免疫组织化学方法从蛋白质水平全程探讨生精细胞的增殖与凋亡情况，综合实验结果讨论基因表达与凋亡之间的相关性，有望明确某些前期研究 中很难解释的问题，以进一步明确这两个基因在小鼠睾丸发育全过程中的表达过程和组织定位，从而进一步阐明cyclin B1及Bax基因在小鼠睾丸发育过程中的生理功能，为男性睾丸发育及调控机制提供理论及动物实验的依据。 三、研究目标 (简要陈述所申请研究项目最后要达到的目标) 1.从蛋白质水平明确cyclinB1和Bax基因在小鼠睾丸发育全过程中的表达 过程和组织定位。 2. 通过研究进一步阐明小鼠睾丸发育过程中cyclinB1和Bax基因的生理 功能。 3. 成果以论文形式提交，并在核心期刊上发表论文1-2篇。 3. 为男性睾丸发育及调控机制提供理论及动物实验的依据。 4. 通过研究锻炼团队各成员的科研思维能力，提高实验设计和动手能力， 为以后的研究工作打下基础。 四、立论依据 (包括项目研究意义、国内外研究现状、请附主要参考文献及出处) 精子发生是一个极特殊的生殖细胞分化过程，历经有丝分裂期、减数分裂期及精子形成期。这一过程受多种因素的调控，涉及多个基因的参与。同时，精子发生也是一个极特殊的细胞周期运行过程。在这一过程中，既有生殖细胞本身及其相关细胞(如睾丸中的支持细胞)的频频分裂增殖，又有它们不断的发育分化和死亡。在精子发生中，众多相关基因调控着细胞的增殖和凋亡。因此，研究细胞周期调控基因及细胞凋亡相关基因在精子发生过程中的表达既可以进一步探讨生殖细胞的发育机制，又可以从另一个角度揭示细胞周期调控及凋亡的分子生物学机制;同时对阐明细胞周期调控基因和凋亡相关基因在睾丸发育过程中的生理功能具有重要的实践意义。 细胞周期调控的主要机制是蛋白活性的磷酸化调控。这种调控机制的核心是多种细胞周期蛋白(cyclin, Cyc)与周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase, Cdk)的周期性相互作用，两者结合成Cyc-Cdk复合物才具有激酶活性。调节生精细胞周期的各种细胞周期素，根据其在细胞周期中发挥功能的时间，分为A~H型，它们与其所依赖的激酶相互作用，共同调节生殖细胞的周期性有丝分 ,1, 裂和减数分裂活动。这些基因的突变必然引起精子/卵子发生障碍。 Cyclin B1在细胞周期调控中具有非常重要的作用。cyclin B是有丝分裂蛋白激酶的一个亚单位，Cyclin Bl蛋白在整个细胞周期中的表达呈时相性变化。在G期，cyclin Bl蛋白表达量极低，S期明显增加，在G期达到最高。Cyclin 12 Bl蛋白作为激酶CDC2的调节亚基，与CDC2形成活性复合物即细胞促分裂因子(mitosis-promoting factor, MPF)或M期促进因子( M phase-promoting factor, MPF )，主要参与G/M期转变的调节;另外它还通过磷酸化多个蛋白(如微管生发2 相关蛋白CENP-E,Eg5等)，调节它们的活性与分布，从而参与纺锤体的形成和染 [2] 色体的分离。 有研究结果表明，精子细胞中大量存在的cyclin B1 蛋白是作为一种细胞分裂完成的信号 ,为启动精子细胞变态所必需,另一种可能的解释是精子细胞的核骨架和核基质中有cyclin B1蛋白的作用底物,而cyclin B1蛋白可能参与精子变态时的核骨架变化。调节核浓缩和核包装. cyclin B1基因的这种转录后贮存以及在精子细胞变态时瞬时表达的特点，无疑对生精过程的正常进行具有重要 意义。在大鼠的生精上皮细胞分裂和分化的正常进行中，同样也需要cyclin B1 [3]蛋白的合成和降解.还有研究发现由于cyclin B2 缺失的小鼠发育基本正常 可以生育，而cyclin B1缺失的小鼠却死于胚胎期，可见对cyclin B1的研究显得 [4]尤为重要. 对于cyclin B1在各种组织中在药物作用下的表达机制和水平有大量研究，但对其认识有部分不统一，特别是在生殖细胞过程中的机制和有关组织定位有待进一步探讨。 Bax基因的概述:Bcl-2 和Bax是与凋亡密切相关的基因，二者具有同源性，Bcl-2是最为熟悉的抑凋亡基因，而Bax则是促凋亡基因，Bcl-2抑制凋亡必须通过与Bax形成异源二聚体来实现，二者的比例决定精子细胞凋亡趋势，如果Bcl-2表达水平下降将使细胞无法平衡促凋亡基因Bax的作用，从而使细胞走 [5]向凋亡。Bax基因蛋白表达增强;与此同时机体为平衡Bax基因的作用，抑凋亡基因也被启动，然而，当病理刺激持续的情况下，Bcl-2和Bax相互竞争，通 [6] 过某种信号使Bcl-2基因蛋白占据了优势，其结果使凋亡趋势被抑制。 Knudson等利用基因剔除技术培育出Bax纯合性缺失的小鼠，发现此种雄性小鼠的睾丸萎缩，无生育。其曲细精管不能根据生精上皮周期进行分期;生精细胞大都停留在前减数分裂期，这些细胞既无典型的精原细胞也无典型的前细线期精母细胞的表现，附睾和输精管内没有精子。这些结果表明，Bax基因的缺失导致生精细胞大量凋亡，这可能是由于Bax的缺失形成不同二聚体对之间的不平衡 [7]所致. 对于Bax在各种组织中在药物作用下的表达机制和水平有大量研究，但对其认识有部分不统一，特别是在生殖细胞过程中的机制和有关组织定位有待进一步探讨 因此，为了探求cyclin B1和Bax在精子和卵子发生过程中的作用机制，我们将以出生后不同阶段的小鼠睾丸为研究对象，免疫组织化学方法研究细胞周期调控基因cyclin B1及细胞凋亡相关因子Bax基因在不同发育时期小鼠睾丸组织切片上蛋白质水平的表达，以明确这两个基因在小鼠睾丸发育过程中的表达过程和组织定位。从而进一步阐明cyclin B1和Bax基因在小鼠睾丸发育过程中的生理功能,从而为男性睾丸中生殖细胞的发育及其调控机制提供理论及动物实验的依据。 参考文献: [1] 李丹 卢光琇，细胞周期调控基因在精子发生中的作用，国外医学遗传学分 册2005年2月15日第二十八卷第1期:25-26 [2]孔维华 ，颜 山 ，顾 正 ,左嘉客,兔精子发生过程中cyclin B1基因表达 和蛋白定位的发育阶段依赖性。生理学报 ，Oct(2002，54(5):400—4O4 [3] Gromoll.J,Wessels.J,Rosiepen.J,et al,Expression of mitotic cyclinB1 is not confined to proliferation cells in the ratlestis,Biol Reprod ,1997,57:1312-1319 [4]Branders.M,Rosewell.L,Carington.M,CyclinB2 null mice develop normally and are fertile where as cyclnB1 null mice die inutero ,Proc Natl Acad Sci USA ,1998,95:4344-4349 [5]严云勤等. 发育生物学原理与胚胎工程[M ]. 哈尔滨: 黑龙江科学技术出 版社, 1995: 13- 16 [6] Masui Y，Markert CL(Cytoplasmic control of nuclear behavior during meiotic maturation of frog oocytes(J ExpZool，1971，177:129—146( [7] Knudson CM,Tung KSK,Tourtellotte WG,et al.Bax-deficient mice with lymphoid hyperplasia and male germ cell death.Science,1995,270(5233)? 96-99. 五、研究 1.研究内容和拟解决的问题 , 以昆明种正常小鼠的睾丸为材料，从出生后第1天开始，此后每3天取其 睾丸组织一次，直至出生后第58天(此间共取材20次)。 , 采用免疫组织化学方法研究细胞周期调控基因cyclin B1及细胞凋亡相关 因子Bax基因在不同发育时期小鼠睾丸组织切片上蛋白质水平的表达，以 进一步明确这两个基因在小鼠睾丸发育过程中的表达过程和组织定位。从 而进一步阐明cyclin B1和Bax基因在小鼠睾丸发育过程中的生理功能。 2(拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析 1) 组织切片制备 , 昆明种正常小鼠，从出生后第1天开始，每隔3天，直至出生后第58天(即生 后1、4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、 49、52、55、58天组)，每组选3只小鼠。小鼠断颈处死后取其睾、附睾或 卵巢组织,10% 中性甲醛固定,常规石蜡包埋. 切片厚7μm,用甘油蛋白粘片 剂贴于预先用APES (3- 氨基丙基三乙氧基硅烷) 处理过的载玻片上,37 ? 温育24h 后,室温干燥备用。 2) 进行免疫组织化学检测(每组随机取5张切片) , 石蜡切片脱蜡至水，HO水溶液室温孵育以消除内源性过氧化物酶活性。 22 , 山羊血清封闭后，滴加适当比例稀释的一抗37?孵育。PBS液冲洗后滴加 适当比例稀释的相应生物素标记二抗37?孵育。PBS冲洗后滴加适当比例 稀释的辣根酶标记链霉卵白素37?孵育，PBS冲洗后显色剂显色(DAB或 AEC)。光镜下观察显色至适当深浅后终止显色。 , 复染，乙醇逐级脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，Olympus显微镜观察 并拍照。 3(本项目的创新之处 , 根据前期研究基础选取值得深入研究的切入点，有的放矢制订小鼠睾丸的取 材时段，从出生后第1天,出生后第58天每三天取材一次，此间共取材20 次。上一次取材和下一次取材之间的间隔很短，可以完全覆盖小鼠睾丸发育 全过程。 , 选取两个值得研究的基因，在小鼠睾丸发育过程中从蛋白质水平全程探讨生 精细胞的增殖与凋亡情况，综合实验结果讨论基因表达与凋亡之间的相关 性，有望明确某些前期研究中很难解释的问题，以进一步阐明这两个基因在 小鼠睾丸发育过程中的生理功能。 4(年度研究计划和预期进展 2010年11月-2011年2月 购置实验所需药盒、物品、试剂、消耗品 等。饲养小鼠，完成不同阶段小鼠睾丸的取材 工作。 2011年3月-2011年9月 cyclinB1和Bax蛋白免疫组化分析，明确 它们在小鼠睾丸发育过程中蛋白质水平的表 达过程和组织定位。 2011年9月-2011年12月 研究结果的整理、分析和总结工作;撰写论 文、发表文章。 5(预期研究成果与提交成果方式 1) 从蛋白质水平明确cyclinB1和Bax基因在小鼠睾丸发育过程中的表达过 程和组织定位。 2) 通过研究能进一步阐明小鼠睾丸发育过程中cyclinB1和Bax基因的生理 功能。 3) 成果以论文形式提交，在核心期刊上发表论文1-2篇。 4) 为男性睾丸发育及调控机制提供理论及动物实验的依据。 5) 通过研究能锻炼团队成员的科研思维能力，提高实验设计和动手能力， 为以后的研究工作打下基础。 六、研究基础 1.与本项目有关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩(包括发表的论文论著等) 本课题指导教师多年从事生殖分子生物学研究，特别是在小鼠睾丸发育领域有深入研究，其主持课题“小鼠睾丸发生过程中细胞周期调控及凋亡相关基因的表达(云南省应用基础研究计划面上项目)已对PCNA、cyclinD1、RB、caspase 3、p53基因在小鼠睾丸发育过程中的表达进行过系统研究。同时对Si1基因已完成前期研究。这些工作为本课题设计时选择所要研究的候选基因提供了一定的前期研究结果，奠定了良好的基础。 在相关研究中已取得较好的工作成绩，作为前期研究工作成果，发表本课题相关论文8篇(7篇发表于核心期刊上)。 1. 罗兰，余敏，赖建华，江燕，谭德勇，昝瑞光，5种细胞周期调控基因在 小鼠生殖细胞发育过程中的表达研究 云南大学学报，2002，24(2):125, 129 2. 罗兰，李水冰，谭德勇，Si1基因在小鼠睾丸发育过程中的表达 云南大学 学报，2007，29(2):208,212 3. 罗兰，张彦，杨芳等 小鼠睾丸发育全过程的组织学观察 实验动物科 学,2010,27(3):10,13 4. 罗兰，何云刚， 舒坤贤，赖建华，谭德勇，张虹，血清对人脑胶质瘤细 胞株U251基因表达的影响 云南大学学报，2000，22(2):144,147 5. 罗兰，小鼠精子发生过程中原癌基因和抗癌基因的表达 东陆学林 ，1998 年，第八辑:497,501 6. 谭德勇，罗兰，赖建华，舒坤贤，李鹂，昝瑞光，PCNA等5种基因在小鼠 睾丸发育过程中的表达 遗传，2000，22(3):149,152 7. 谭德勇，罗兰，赖建华，舒坤贤，李鹂，昝瑞光，5种细胞周期调控基因 在怀孕早期小鼠卵巢中的表达研究 云南大学学报，1998，20(4):477, 480 8. 谭德勇，罗兰，赖建华，舒坤贤，昝瑞光，HCG对U251细胞中p53基因表 达抑制作用的初步研究 云南大学学报，1998，20(4):488,490 2. 工作条件 , 本实验室现有条件可以满足本课题所涉及的基因、动物实验等的要 求，为完成课题提供保障。 , 其次，对课题所涉及的全部技术均已通过前期研究较好掌握。 3. 尚缺少的条件和拟解决的途径 , 作为本科生，我们尚缺乏实验研究的基础与经验，缺少系统的专业知 识。 , 为此团队成员可在校选修分子生物学、分子生物学实验技术、细胞培 养等课程，掌握分子生物学的基本方法，以具备完成该项研究知识和 技能。 , 并向老师请教，勤于动手，以充实和增加知识经验。 七、经费预算 编号 预算支出项目 支出金额(万元) 实验用小鼠的购置、养 殖费;课题所需试剂 1 3.6 盒、探针、试剂、药品、 耗材等购置费。 2 实验结果的拍照、整 理、分析等费用;成果0.4 鉴定费。 3 4 5 备注:经费主要用于项目研究所需的费、实验材料费、调研费、差旅费、会议费、论文 版面费等必要开支～不得用于支出劳务费等人员经费。 八、完成课题所在实验室的意见* 实验室意见: 同意汪瑞琪等同学来我室完成大学生创新性实验计划《小鼠睾丸发育全过程中ClclinB1和Bax基因表达》相关研究计划。本研究罗兰教授具有丰富研究经验和完善的研究设备可保证研究计划按期完成，同意汪瑞琪等同学使用实验室相关设备，该研究计划具有创新性和可完成性，建议立项资助。 实验室主任(签章):陈元晓 2010年9月28日 *研究项目若系调查分析研究，不需要实验仪器设备者，不需填写该项。 九、审核意见 指导老师意见: (签名): 年 月 日 申请人所在学院审核意见: (请对本《申请书》中各项内容的真实性、经费预算的合理性及本学院 所能提供的支持条件等签署具体意见) (签章): 年 月 日 昆明医学院大学生创新性实验计划评审专家委员会意见: (请就是否同意立项及理由、具体资助额度签署具体意见) 组长(签名): 年 月 日 校大学生创新性实验计划工作领导小组意见 ?同意 ?不同意 该项目为昆明医学院大学生创新性实验计划资助立项项目～资助金额 元。 昆明医学院大学生创新性实验计划领导小组办公室(教务处代章) 年 月 日