【word】 脊髓分级缺血再灌注损伤模型的建立与病理学评价

【word】 脊髓分级缺血再灌注损伤模型的建立与病理学评价 脊髓分级缺血再灌注损伤模型的建立与病 理学评价 四川I动物2007年第26卷第3期SichuanJournalofZoologyVo1.26No.32007 脊髓分级缺血再灌注损伤模型的建立与病理学评价 方华,王泉云,李昌熙,刘进 (四川大学华西医院麻醉科,成都610041) 摘要:目的建立兔脊髓分级缺血再灌注损伤模型和探讨受伤脊髓病理变化可能机制.方法采用肾下腹主 动脉阻断法,分别阻断腹主动脉30min,45min和60min后开放,再灌注48h观察神经功能变化以及病理学评价脊 髓缺血再灌注损伤程度.结果脊髓缺血时间越长,后肢运动功能损害越明显.伤后2天发现受损脊髓出血,水 肿,变性坏死,明显的白细胞浸润以及I-KBa,NF—KBp65,ICAM一1表达增加,脊髓灰质的病理损害严重.再灌注脊髓 病理损伤程度依次为缺血60min组>缺血45min组>缺血30min组>假手术组.结论该模型是一种较好的脊 髓缺血再灌注损伤模型,阻断.肾下腹主动脉血流30min,45min,60min ,重不同程度 后开放可以较好地反应轻,中 缺血再灌注损伤脊髓的病理变化特点. 关键词:脊髓;缺血;再灌注损伤;病理学;模型 中图分类号:Q95—33文献标识码:A文章编 号:1000—7083(2007)03—0689一o4 AGradedSpinalCordIschemia/ReperfusionInjuryModelbyClamping InfrarenalAorticandHistopathologicalEvaluation FANGHua,WANGQuan—yun,LIChang—xi,LIUJin (DepartmentofAnesthesiology,WestChinaHospital,SichuanUniversity,Chengdu610041) Abstract:ObjectiveArabbitmodelofgradedspinalcordisehemia/reperfusioninjurywasmadetoinvestigatehis— topathologicalchangesofspina1.MethodsThespinalcordisehemia/reperfusioninjurymodelwasmadebydeelampingafter 30min,45minand60mininfrarenalaorticcross?clampingrespectively.Thedegreesofspinalcordisehemia/reperfusioninju? rywereevaluatedbyhistologicalanalysisandtheextentoffunctionchangesofbehaviorwasinvestigatedafterreperfusion48 hours.ResultsThemotorfuntionofrabbithindlimbswassignificantlyworsenedduetoprolongingtheischemictime.Hem— orrhage,swelling,degenerationofthelumbarspinalcordtissueandtheremarkableleukoeytesinfiltrationandtheexpression ofI-KB(x.NF?KBp65.ICAM?1occurredinreperfusion2days.Thepathologicaldamagetothegraymatterofspinalcordwas serious.Theextentofpathologicaldamageinthelumbarspinalcordafterreperfusionwasintheorderofischemia60min group>ischemia45mingroup>ischemia30mingroup>thesham?operationgroup.ConclusionItisabettermodelfor simulatingthepathologicalcharacterswithmild,moderateandseverespinalcordisehemia/reperfusioninjurybydeelamping after30min,45minand60mininfrarenalaorticcross?clampingthanothermodels. Keywords:spinalcord;isehemia/reperfusioninjury;pathology;model 脊髓缺血再灌注损伤(spinalcordischemic reperfusioninjmy,SCIRI)是造成运动功能丧失的主 要原因之一?一.SCIRI防治与再生修复是现代神 经科学的重大难题和研究热点,其突破的基本前提 是根据具体研究目的需要做出科学合理的实验动物 模型.阐明SCIRI引起的病理机制.脊髓的病理改 变特征及其变化规律直接影响到SCIRI程度及损伤 机制,导致不同程度的运动功能障碍,因此有必要建 立以运动损害为主的分级SCIRI模型.本研究拟通 过建立分级SCIRI模型,了解脊髓在不同损伤程度 的情况下,观察后肢行为学的变化,从神经病理学人 手,初步探讨缺血再灌注过程中脊髓组织的病理学 变化可能机制. 1材料与方法 11脊髓缺血再灌注损伤模型的建立 1.1.1动物及分组健康新西兰大白兔40只(四 川I大学实验动物中心提供),手术当日晨禁食,禁水, 雌雄兼用,体重2—2.5kg,随机分为假手术组 (CO),缺血30min组(C30),缺血45min组(C45) 和缺血6Omin组(C60),每组1O只. 1.1.2动物模型的制备1.5%戊巴比妥钠(30 mg/kg)耳缘静脉麻醉动物后,采用左肾动脉下方腹 主动脉阻断法建立脊髓缺血再灌注损伤模型.c0 只进行手术操作,不阻断腹主动脉;证实钳夹点以下 腹主动脉搏动完全消失后,各缺血组分别阻断30 收稿日期:2006—09—20修回日期:2006—12—26基金项目:国家教育部高等学校博士学科点专项科研基金资助(20030610087) 通讯作者 689 四川动物2007年第26卷第3期SichuanJournalofZoologyVo1.26No.32007 min,45min和60min后松夹,逐层关腹,均再灌注 均48h.术中用温盐水纱布敷盖腹腔脏器,肛温维 持在36,37?. 1.2试剂 鼠抗兔核转录因子一KBp65(NuclearFactor—Kap— paBp65,NF.KBp65)多克隆抗体,抑制蛋白.KBot (Inhibitor.KappaBet,I.KBot),细胞间粘附分子(In— tercellularAdhesionMolecule,ICAM.1)多克隆抗体 (Sigma公司)及SABC试剂盒,二氨基联苯胺 (DAB)显色试剂盒(武汉博士德生物公司). 1.3术中监测 动物麻醉后即监测平均动脉压(MAP),心电图 (ECG),经皮脉搏氧饱和度(SpO2)及肛门温度.i— STAT血气分析仪(美国)测定动脉血气. 1.4神经功能观察 再灌注48h分别采用Johnson评分,改良Rivlin 斜板试验及Reuter法对动物后肢运动感觉功能进行 综合评价. 1.5组织病理学观察 1.5.1取材与固定再灌注48h后,各组动物再 次麻醉,背部消毒铺巾,咬骨钳咬除棘突,打开L2, L5椎板暴露脊髓,分离并取出L3节段脊髓组织,在 保证脊髓完整性的情况下剥去脊髓神经根及大部脊 膜,脊髓组织于10%福尔马林中固定,留做病理组 织学和免疫组织化学研究. 1.5.2石蜡切片的制作及HE染色按常规方法 进行. 1.5.3I-KBet,NF.KBp65和ICAM-1的表达采 用SABC免疫组织化学法,DAB显色,空白对照以 PBS替代第一抗体.显微镜下观察阳性表达位置及 强度,I.KBot,NF.KBp65和ICAM.1蛋白表达阳性的 细胞特征定义为胞浆胞膜着色,呈黄色或棕黄色,摄 片结果传人OlympusBX51图像采集分析系统进行 I.KBot,NF.KBp65和ICAM.1表达的定量分析,结果 自动输入SPSS13.0,分别统计各时间点阳性细胞 数,作为此片的阳性细胞计数. 1.5.4组织病理学观察及前角正常神经元计数 观察脊髓损伤后的一般病理学改变,神经元形态变 化及分布,并根据Rexed的脊髓灰质分区标准,采用 OlympusBX51图像采集分析系统并参照正常运动神 经元和异常运动神经元标准形态学特征的判别标准 对脊髓前角(?,?区)正常运动神经元和异常运 动神经元计数.前角运动神经元异常率计算公式参 照文献如下:运动神经元异常率(%)=每张切片的 所选视野中的异常运动神经元数/该视野中运动神 经元总数X100. 1.6统计学处理 数据资料以均数?标准差(?S)表示,多组间 ICAM.1,I.KBot和NF.KBp65表达变化采用单因素方 差分析和q检验,神经行为学评分和神经元计数评 分采用Kruska1.wallis检验,神经元异常率的比较采 用卡方检验.统计软件为SPSS13.0. 2结果 2.1生理参数,血糖和血气变化 手术过程中肛温,MAP,心率,SpO2,呼吸频率, 血糖和血气均无明显变化,与阻断前比较差异均无 统计学意义(P>0.05). 2.2后肢行为学变化 各组随着脊髓缺血时间的延长,再灌注48h兔 的后肢行为学变化显示出较明显的差别(P< 0.01),后肢感觉和运动功能障碍逐渐加重.见表 1 表1后肢行为学变化(?s.n=10) 注:与同期c0比较,#P<0.05,VP<0.0l;与同期C30比 较,?P<0.01;与同期C45比较,?P<0.0l 2.3脊髓组织I-KBot,NF-KBp65和ICAM-1的表 达 C0I—KBot蛋白的表达呈强阳性,NF—KBp65蛋白 的表达均呈弱阳性,未见有细胞ICAM.1蛋白表达阳 性着色.再灌注48h,随着腹主动脉阻断时间延长, 690 NF—KBp65和ICAM一1蛋白表达的细胞胞浆胞膜染 色逐渐增强,I.KBot蛋白表达逐渐减弱,组间比较差 异均有统计学意义(P<0.01).见表2. 四川动物2007年第26卷第3期SichuanJournalofZoologyVo1.26No.32007 表2I-KBd,NF-KBpaS和ICAM?1的表达(?s,n=10) 注:与同期c0比较,丫P<0.01;与同期C30比较,?P<0.01; 与同期C45比较,?P<0.01. 2.4组织病理学变化 损伤脊髓组织外观苍白,脊髓表面可视血管网 变细.C0脊髓腹侧前角?,?区神经元异常率为0, 正常运动神经元数目均值为25.564-2.31(个/视 野),运动神经元轮廓清晰,多极形,核仁清楚,可见 清晰的树突和轴突,整个组织结构完整,清楚,无中 性粒细胞(polymorphonuclearneutrophils,PMN)浸润, 出血,水肿等异常现象.C30神经元周围间隙增加, 神经细胞轻度肿胀,神经元周围间隙增加,部分神经 元核仁不清,组织中有少量PMN浸润,可见出血灶. C45神经元肿胀,神经元周围问隙增加明显,极性变 钝,核仁不清,少量神经元变性坏死或空泡形成少, 组织中可见散在PMN,出血灶明显,有较多异常神经 元.C60大量神经元变性坏死,广泛空泡形成,组织 中可见大量PMN浸润,出现大片状出血灶,残存神 经元稀疏.L3节段损伤情况归纳如表3.各组随着 脊髓缺血时间的延长正常运动神经元计数逐渐降 低,而神经元异常率逐渐上升,组问比较差异均有统 计学意义(P<0.01)(见表4). 表3再灌注48h脊髓组织损伤情况 注:”一”为未见坏死灶,”?”表示可凝,”+”表示坏死灶占灰质 区10%以下或较轻病理改变,”++”表示坏死灶占灰质区10%, 40%或中度病理改变,”+++”表示坏死灶占灰质区40%以上或严 重病理改变. 表4正常运动神经元计数及运动神经元异常率(个/视野,?S,n=10) 注:与同期c0比较,丫P<0.01;与同期C30比较,?P<0.01;与同期C45比较,?P<0.01. 3讨论 脊髓缺血再灌注损伤(SCIRI)的程度及其变化 规律直接关系到脊髓继发损伤程度及损伤机制E5], 其中动物模型的选择对研究结果的意义具有重要的 影响.许多致脊髓缺血的因素仍未建立起满意的损 伤模型,目前SCIRI模型繁多,常见包括腹主动脉阻 断法和腰动脉阻断法建立的脊髓缺血再灌注模型, 但尚无统一的分型和分级,而应用单一SCIRI模型 进行研究,显然不能满足临床治疗的需要.目前, SCIRI的研究主要以腰段脊髓为研究对象,且倾向于 选择兔作为实验研究对象J.腰段脊髓的血液供应 主要来自肾下腹主动脉,兔腹主动脉及腰动脉的壁 相对较厚,内径粗,游离时不易出血,腰动脉系腹主 动脉的直接分支,常与静脉伴行,且血管压力高,血 管壁薄,容易误伤,一旦误伤血管,因腹膜后问隙较 小而止血困难,加之不同种属兔子的腰动脉解剖差 异较大,腰动脉多为3支以上,其腰动脉分支的数 目,走行和直径的明显变异可能直接影响模型的稳 定性和研究结果.此外,由于腹膜后问隙较小,逐 一 寻找各腰动脉并将其全部结扎,尤其是结扎肾动 脉上分支和髂总动脉下分支时,手术难度更大,延长 了手术时间,这种高选性的完全结扎节段动脉的手 术方法操作过程比较复杂,虽然不影响其他区域的 血液供应,但造成脊髓永久性缺血损伤,且无再灌注 过程,因此不符合本研究目的.鉴于以上原因,本研 究在肾动脉分支下阻断腹主动脉,通过控制夹闭时 间长短而引起脊髓组织不同程度损伤,手术简便易 行,损伤程度易于控制. 研究显示,腹主动脉阻断和开放期问,动物生命 体征平稳,循环稳定,在保留动物自主呼吸的情况 下,血气和血糖监测与术前比较无明显改变,术后1 , 2h动物苏醒,再灌注48h存活率100%.观察到 兔脊髓对缺血再灌注损伤的反应十分敏感,肾下腹 主动脉阻断法可导致腰段脊髓神经元损害,缺血再 灌注损伤48h即可见神经元肿胀,染色质溶解,核固 缩等变性坏死病理改变.随着脊髓缺血时问延长, 再灌注48h时各组脊髓灰质神经元表现为稀疏,崩 溃,溶解,轴突肿胀,扩大,消失等不同程度的变性或 坏死,神经元异常率逐渐上升.C60脊髓?,?区正 常神经元数目明显减少或细胞结构不清,神经纤维 排列紊乱,运动神经元异常率高达87.75%,脊髓灰 质出现神经元广泛性坏死或溶解甚至海绵状空泡样 结构等脊髓重度病理学变化;C45表现为神经元肿 胀及核固缩等脊髓中度病理学改变,C30则为神经 元轻度肿胀,周围间隙增加等脊髓轻度病理学改变, 691 四川I动物2007年第26卷第3期 SichuanJourn~ofZoologyVo1.26No.32007 提示肾下腹主动脉血流阻断30min,45min及60 min后再灌注早期运动神经元即受到不同程度损害, 分别引起脊髓轻,中和重度缺血再灌注损伤,说明成 功建立脊髓分级缺血再灌注损伤模型,具有良好的 可重复性,可用于进一步研究药物治疗对不同程度 损伤脊髓的疗效观察和判定. 脊髓的主要功能包括分析,整合和传递信息,运 动神经元主要集中在脊髓?区和?区,SCIRI后运动 功能障碍的产生可能与神经元和神经纤维的变性坏 死等病理改变密切相关,提示病理学的形态改变决 定功能障碍的程度.Johnson评分标准能够准确 反映后肢运动功能,Rivlin斜板试验代表后肢负重能 力,Reuter分值可以综合评估动物的感觉,运动,反 射,肌张力,后肢运动等功能,是评价脊髓损伤程度 轻重的可靠指标.本研究联合采用Johnson,Riv- lin斜板试验及Reuter等制定的标准来综合判断后 肢神经功能,根据不同程度脊髓损伤的动物的行为 学状态来评定,本实验建立的分级SCIRI模型同样 表现出良好的重复性,每组受试动物的组内差异较 小,显示本模型能较好地反应SCIRI后动物的基本 伤情及特点. 白细胞,尤其是PMN浸润缺血脊髓组织是脊髓 再灌注损伤的重要特征,但PMN引起SCIRI的病理机 制尚未彻底阐明.本研究观察到脊髓缺血再灌注后 伴有大量的PMN浸润,PMN浸润数目随缺血时间延 长再灌注后增加,其中C60脊髓组织中可见大量的 PMN浸润;CA5脊髓组织可见明显PMN浸润;C30脊 髓组织中有少量PMN浸润;CO未见PMN浸润.说明 PMN活化,穿越血管内皮细胞向损伤部位移行是SCI— RI后炎性病理学改变的重要特征,组织炎性反应可能 与SCIRI关系密切.I.KBo【是一种阻遏蛋白,能够掩 蔽NF.KB的核定位信号,I.KBo【和NF—KBp65炎性信 号转导系统具有多元性调节作用,以同源或异源二聚 体非活性形式普遍存在于中枢神经系统等各种组织 细胞中的转录因子,通过调控编码细胞因子,生长因 子,细胞粘附分子和一些急性期蛋白的基因,在生物 体的免疫应答,炎性反应,细胞应激,细胞增殖分化及 凋亡等的调控中具有重要作用J.NF.KBp65在静息 情况下大部分与I.Bd结合成复合物形式被锚定于 细胞浆内处于失活状态,只有当I.KBo【磷酸化后NF— KBp65/I—KBo【复合物解离,NF.KBp65才能恢复活 性.研究表明,鼠脊髓损伤中NF.KBp65表达增 强,应用NF—KB抑制剂吡咯烷二硫氨基甲酸酯(Pyrro— lidineDithiocarbamate,PDTC)能够调节NF.KB065和 ICAM一1mRNA的表达下降.PMN的活化及对组织 692 的损伤程度的分子基础在于其与内皮细胞表面粘附 分子的相互作用,其中,ICAM.1等能与活化PMN表面 的配体相应地结合,在介导内皮细胞和PMN粘附,聚 集,浸润及释放炎性细胞因子过程中的起到重要作 用….本研究中,C0I.KB蛋白的表达呈强阳性,NF— KBp65蛋白表达呈弱阳性,ICAM.1表达阴性.而脊髓 组织I.Bd蛋白表达随脊髓缺血时问延长逐渐减弱, NF-KBp65和ICAM.1蛋白表达随脊髓缺血时问延长 逐渐增加,与此同时,大量PMN浸润脊髓组织,提示 SCIRI过程可能引起I.KBo【降解,NF.KBp65/I.KBo【复 合物解离后NF.KBp65活化迅速诱导靶基因的转录, 启动炎性信号转导系统,诱导损伤组织表达ICAM.1 表达增加,在炎性反应早期ICAM.1介导PMN游出, 并向损伤部位聚集,说明NF.KBp65和ICAM-1的高表 达可能导致PMN浸润增加…,加重了缺血脊髓组织 的损伤 4参考文献 [1]JimlgX,ShiE,NakajimaY,SatoS.PostcondiIi0nIng,aseriesof briefinterruptionsofearlyreperfusion,preventsneurologicinjuryafter spinalcordisehemia[J].AnnSurg.2006,Jul;244(1):148,153. 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