慢性阻塞性肺病患者肺内细胞增殖与凋亡的研究

慢性阻塞性肺病患者肺内细胞增殖与凋亡的研究 ?细胞凋亡研究? 慢性阻塞性肺病患者肺内细胞 增殖与凋亡的研究 陶清国 张珍祥 徐永健 ( ) 【摘要】 目的 研究细胞增殖 、凋亡及其调节基因在慢性阻塞性肺病 CO PD继发肺动脉高压中的作用 。方法 应用免疫组化及原位缺口末端 DNA 碎片标记技术检测 CO PD 患者肺内细胞增殖 及凋亡 ,并用 Nort hern 杂交检测 CO PD 患者肺内 c2myc 、bcl22 及 p53 基因达 。结果 CO PD 患者及 () 对照组肺内 包括肺小血管壁均存在着一定比率的增殖及凋亡细胞 。两组相比 , CO PD 组增殖指数 增高而凋亡指数减少 ,增殖与凋亡比值显著增高 ,约为对照组 4 倍 。在 CO PD 患者肺内 ,增殖细胞绝 大部分位于肺小血管壁 , 而凋亡细胞在肺小血管壁上较对照组少见 。c2myc 、bcl22 及蛋白表达在 CO PD 肺内比对照组明显增高 ,主要在肺小血管壁 。c2myc mRNA 表达量约为对照组 3 倍 ,bcl22 mR2NA 三条带表达量约为对照组 215,315 倍 ,p53 基因 mRNA 表达量比对照组显著减少 ,约为 1/ 3 倍 。 结论 可能由于 c2myc 、bcl22 及 p53 基因异常表达所致的细胞增殖与凋亡异常参与了 CO PD 时的肺 血管结构改建的调节 ,亦即参与了 CO PD 继发的肺动脉高压过程 。 脱噬作用基因表达【关键词】 肺疾病 ,阻塞性 Apoptosis versus prol if eration activities and relative mechan ism in chron ic obstructive pul monary disease T ao Q i n gg uo , Zhan g Zen x i an g , X u Yon gji an . Res pi ratory Disease Resea rch L aboratory , Ton gji Hos2 pi t al , Tongji M edical U ni versi ty , W u han 430030 【Abstract】 Objective To st udy t he roles of apop tosis and p roliferatio n and relative genes exp ressio n ( ) in chro nic obst ructive p ulmo nary disease CO PDand p ulmo nary hypertensio n. Methods Immuno his2 tochemical technique was used for t he detectio n of cell p roliferatio n and exp ressio n of relative genes. In sit u end labeling technique was used for t he detectio n of nucleoso mal DNA f ragmentatio n of apop totic cells , and Nort hern blot for t he detectio n of exp ressio n of c2myc , bcl22 and p53 genes in t he lungs wit h CO PD. Re2 sults Bot h p roliferative cells and apop totic cells were found in t he lungs wit h CO PD or wit hout CO PD. In lung tissue wit h CO PD. The p roliferatio n index was increased significantly , whereas t he apop tosis index was decreased significantly. Co mpared wit h co nt rols , t he ratio of p roliferatio n to apop tosis in lungs wit h CO PD was increased by 4 folds , and t he exp ressio n of c2myc or bcl22 mRNA was significantly increased by 2 . 5,3 folds in lungs tissue wit h CO PD. The exp ressio n of c2myc and bcl22 p rotein was also increased sig2 nificantly in lungs wit h CO PD , t he t wo antigen were p redo minantly localized in small p ulmo nary vessels. The exp ressio n of p53 mRNA was significantly decreased by 3 folds in lung tissue wit h CO PD. Conclusion The abnormality of apop tosis versus p roliferatio n activities induced by c2myc , bcl22 and p53 genes may co nt ribute to p ulmo nary vascular st ruct ural remodeling in CO PD. Apop tosis Gene exp ressio n 【Key words】 L ung disease ,Obst ructive ( )N at l M ed J Chi n a , 1998 , 78 :574 2577 ( ) 肺血管结构改建是慢性阻塞性肺病 CO PD继细胞增殖与凋亡双重调节 。为探讨细胞增殖与凋亡 机制是否亦参与 CO PD 时的肺血管结构改建的调 发肺动脉高压的最重要环节之一 ,它给肺动脉高压 节 ,本研究对 CO PD 患者肺内细胞进行增殖与凋亡 治疗带来了极大困难 ,已被引起高度重视 。肺血管 综合 ,同时研究与细胞增殖 、凋亡密切相关的 c2 ( 结构改建的病理特征是肺小血管壁细胞 平滑肌及 myc 、bcl22 及 p 53 基因表达 ,以进一步明确肺血管结 1 ) 纤维细胞增殖及合成胞外基质增多, 对其发生 构改建的发生机制 。 2 的细胞及分子机理的认识还很不清楚 。Cho 等研 ( ) 究认为 ,新生羊出生后体内动脉发育 改建过程受 对象与方法 一 、对象作者单位 :430030 武汉 ,同济医科大学附属同济医院呼吸病研 究室 14 例在武汉同济医院胸外科因肺部肿瘤行肺 4 叶切除术患者 。其中 CO PD 患者 9 例 ,男 6 例 ,女 3 出。具体步骤 , 石蜡切片脱蜡至水 、37 ?下蛋白例 ,年龄平均 62 岁 。所有患者均有慢性咳嗽咳痰病 ( μ) 酶 K 消化 15 分钟 浓度 10 g/ ml ,p H714 、013 %史 ,经胸片 、心电图 、超声心动图检查符合 CO PD 、肺 HO甲醇液灭活内源酶 、PB S 洗 、加末端转移酶与2 2 3 () 荧光标记的核苷酸反应混合液 37 ?,1 小时、PB S 心病诊断标准;肺功能检查均有不同程度的阻塞 性通气功能障碍 。非 CO PD 患者 5 例为对照组 ,男( ) 洗 、过氧化物标记的抗荧光抗体 37 ?, 30 分钟、4 例 ,女 1 例 ,平均年龄 55 岁 。检查除肺部有肿块 PB S 洗 、DAB 显色 、苏木素核复染 、脱水透明封片 。外 ,余正常 。 3 . 组织化学染色 :c2myc 及 bcl22 抗原分析因石 二 、方法蜡切片效果差 , 选用冰冻切片 。Ki267 染色选用石 1 . 免疫组织化学分析 :手术切除肺叶后 ,立即切 蜡切片 。切片经胰蛋白酶消化或微波抗原修复预处 取一小块尽量远离肿瘤部位的肺组织 ,放入 PB S 缓 理后 , 按常规 SABC 法进行染色 。c2myc 及 bcl22 、 冲液中快速漂洗数次以去掉组织块中的血液 。其中 Ki267 鼠或兔抗人单克隆抗体及 SABC 试剂盒购自 1 块立即置于液氮中快速冷冻 ,用 OC T 包埋后行冰 北京中山生物技术公司 。 冻切片 ,再置于 10 %中性甲醛液中固定 30 分钟 ,吹 4 . 阴性对照 :凋亡染色加反应混合液 ,一步混合 干 ,置冰箱中备用 。另一小块立即固定后行常规石 液中不含末端转移酶 ,组织化学染色用 PB S 代替一 蜡切片 。 抗 。 2 . 凋亡检测 :采用细胞凋亡原位缺口末端 DNA 5 . 细胞增殖及凋亡指数统计 : 每例标本取 4 张 ( ) 碎片标记技术 TU N EL 。原理为凋亡细胞核内切片 ,每张切片任取 5 个视野进行细胞计数 ,至少计 DNA 断裂为含 3’2O H 末端的碎片 ,通过缺口末端转 数 1 000 个细胞 。增殖指标是以与细胞增殖密切相 移酶催化连上带荧光标记的脱氧核苷酸 ,再用过氧 关的 Ki267 抗原染色表示 。增殖或凋亡指数是以明 化物酶标记的抗荧光抗体作二抗通过底物显色而检 显的增殖或凋亡阳性染色细胞占同一视野细胞总数 图 1 CO PD 患者肺内凋亡细胞原位末端标记染色 ,示肺小血管壁上凋亡阳性染色细胞 TU N EL ×300 图 2 CO PD 患者肺内 Ki2 ( ) 67 抗原染色 ,示肺小血管壁上阳性染色细胞 ABC ×300 图 3 CO PD 患者肺内 c2myc 抗原染色 ,可见肺内主要在肺小血管壁上大量阳 ( ) 性染色细胞未复染核ABC ×150 图 4 CO PD 患者肺内 bcl22 抗原染色 ,示肺小血管壁上阳性染色 ABC ×300 215,315 倍 。p 53 表达检出 212 kb 条 约为对照组 的百分比表示 ,为排除细胞固定不及时造成的早期 () 细胞自溶及非特异着色形成的弱阳性染色 ,凋亡细 带图 5,CO PD 组较对照组表达量显著减少 ,约为 胞只计数核深棕色染色者 。 对照组 1/ 3 倍 。 ( 61No rt her n 杂交 :取新鲜的肺组织 尽量远离肿 ) 瘤部位,用异硫氰酸2酚2氯仿一步提取法提取组织 中总 RNA 。杂交参照“分子克隆”第二版 :取每样品 μ 20 g RNA ,在 1 %琼脂糖甲醛凝胶中电泳后转移至 32 硝酸纤维素膜上烤干 。经预杂交后 ,与P 标记的 c2 (myc 的探针 114 kb ,人 cDNA 片段 ,内切酶 Eco R I/ ) ( CL a I, 或 bcl22 探 针 018 kb , 人 cDNA 片 段 , ) ) ( ( Bam H I/ Sac I,或 p 53 野生型探针 118 kb ,人 cD2 ) βNA 片段 ,Bam H I,或2actin 探针杂交 ,洗膜后放射 自显影 ,用图像分析系统测定各杂交带总吸光度值 。 β实验内参照以同一样品的2actin mRNA 杂交量显 示 。c2myc 、bcl22 或 p 53 mRNA 相对表达量是以每 β个杂交带总吸光度值除以相应的2actin mRNA 杂 交带的总吸光度值而得 。 、71 统计学处理 : 实验数据以 ?x ?s 表示 ,采用 t 检验分析 结果 一 、细胞增殖与凋亡分析 CO PD 组及对照组肺内均存在着一定比率的增 殖或凋亡细胞 ,增殖或凋亡阳性染色细胞在肺组织 中呈散在分布 , 有些区域相对集中 。在 CO PD 肺 ( ) 内 ,增殖阳性细胞绝大部分位于肺小血管壁 图 1, ( 凋亡阳性染色细胞肺小血管壁上较对照组少 图 ( ) () 2。增殖指数 CO PD 513 ?117%比对照组 213 ? ( ) ) 018% , 显 著 增 多 P < 0101 。凋 亡 指 数 CO PD () ( ) ( 116 ?017%比对照组 217 ?017% ,显著减少 P ) < 0105。增殖与凋亡比值 CO PD 为对照组的 4 倍 。 图 5 c2myc 、bcl22 和 p53 mRNA 基因表达 二 、c2myc 、bcl22 免疫组织化学染色 讨论 c2myc 抗原阳性染色为胞核棕黄色 , 对照组肺 内仅少许弱阳性表达 , CO PD 组肺内可见大量阳性 细胞凋亡即程序性细胞死亡是普遍存在的一种 细胞死亡的生理形式 。与坏死不同 ,它不引起机体 (或强阳性表达 ,阳性细胞主要定位于肺小血管壁 图 ) 3。bcl22 阳性染色为棕黄色 ,主要分布于肺小血管 局部或全身的炎症反应 ,是细胞悄悄进行的“自杀”。壁上 , 对照组肺内仅少许弱阳性表达或不表达 , 与细 胞 增 殖 一 样 , 它 也 可 以 调 节 组 织 结 构 的 改 5CO PD 肺内可见绕肺小血管壁全层的强阳性或阳性 建。诱导细胞凋亡可作为各种增殖疾病的治疗 () 表达 图 4。( ) 手段 。CO PD 时发生的肺血管结构改建 PV SR实 三 、No rt her n 杂交质上是肺小血管壁的一种增殖性疾病 。本研究结果 c2myc mRNA 表达检出 212 kb 条带 ,表达量显 表明 ,在非 CO PD 患者 , 肺血管壁发生较低的增殖 著高于对照组 ,约为对照组 3 倍 ; bcl22 mRNA 检出 水平可被同时发生的相应的自发性凋亡水平所平 ( 315 、615 、815 kb 三条带 因 bcl22 基因转录产物剪切 衡 ,以保持血管壁细胞数的相对稳定 。而在 CO PD ) 修饰后为三条 mRNA, 三条带 CO PD 表达量分别 组 ,肺血管壁细胞由于增殖加强而凋亡相应减少 ,造 c2myc 、bcl22 及 p 53 基因表达异常 ,细胞增殖与凋 胞 成细胞增殖凋亡失衡 ,无法维持细胞数稳定 ,这种失 衡长期进行 ,最终造成细胞累积而形成 PV SR 。 细亡比增高 ,引起了 PV SR ,促进了肺动脉高压进程 。 胞增殖与凋亡的调节与相关基因的表达密切 参 考 文 献 相关 。c2myc 基因产物是决定细胞命运即增殖 、静 6 1 Vender RL . Chro nic hypo xic p ulmo nary hypertensio n : cell biology 止 、分化 、凋亡的中心调节子,bcl22 表达产物是细 to pat hop hysiology. Chest , 1994 , 106 :23622431 胞凋亡的强力抑制剂 。p 53 基因产物是一种细胞凋 ( 2 Cho A , Co urt man DW , L angille BL , et al . Apopto sis p ro2 7 ) grammed cell deat h in arteries of t he neo natal lamb. Circ Res , 亡促进剂 。Bisso nnet te 等研究发现 , 用 c2myc 及 1995 , 76 :16821751 bcl22 基 因 转 染 的 细 胞 表 现 出 极 强 的 增 殖 活 性 。 3 蔡如升 1 慢性肺原性心脏病 1 见 :朱贵卿主编 1 呼吸内科学 1 北 京 :人民卫生出版社 ,1984 ,40624081 8 Bennet t 等报道 ,c2myc 基因诱导的大鼠动脉血管 4 Wijsman J H , Jo nker RR , Kerjzer R , et al . A new met ho d to delect apopto sis in paraffin sectio ns : In sit u end2labeling of f ragmented 平滑肌细胞发生的凋亡依赖 p 53 基因表达的增强 。 DNA. J Histochem Cytochem , 1993 , 41 :72121 本研究结果显示 ,c2myc 及 bcl22 基因在 CO PD 肺内 5 Wyllie A H. Apopto sis and t he regulatio n of cell numbers in no r mal and neoplastic tissue : an overview . Cancer Metastasis Rev , 1992 , 表达显著增多 ,而 p 53 基因表达显著减少 。可以推 11 :9521031 测在 CO PD 患者 , 由于慢性缺氧等刺激 , 引起肺血 6 Evan GI , Wyllie A H , Gilbert CS , et al . Inductio n of Apopto sis in fibro blast s by c2myc p rotein . Cell , 1992 , 69 :19921281 管壁细胞 c2myc 基因表达增强 , c2myc 本身都有促 Bisso nnet te RP , Echeverri F , Mahbo ubi A , et al . Apoptotic cell 7 6 deat h induced by c2myc is inhibited by bcl22 . Nat ure , 1992 , 359 : 进细胞增殖与凋亡两种互相矛盾的趋势,但由于 55225561 同时 bcl22 基因表达增加及 p 53 表达减少 ,凋亡趋势 Bennet t MR , Evan GI , Schwartz SM . Apopto sis of rat vascular 8 smoot h muscle cells is regulated by p532dependent and2independent 被抑制 ,细胞生长总体上表现出增殖效应 ,因而促进 pat hway. Circ Res , 1995 , 77 :26622731 了肺血管结构改建的进程 。( )收稿 :1997207228 修回 :1998205221 由于 CO PD 缺氧等病理因素刺激 ,肺血管壁细 ()本文编辑 :李群 ??病例报告 病毒相关性吞噬血细胞综合征二例 何秀兰 张晓光 李奇玉 王绍绅 9 1 女 , 9 岁 。因发热 , 咳嗽 4 天: 粒红巨三系受抑制 , 淋巴细胞0145 ,血小板 28 ×10/ L 。网织红细胞例 骨髓象 () ( ) 入院 。体检 :体温 39 ?,意识清 ,巩膜轻 成熟型比值增高为 0159 ,组织细胞占 0103 ,血培养 - , 骨髓象 : 有核细胞增 度黄染 ,浅表淋巴结均可触及 , 无触痛 , 2218 % ,以吞噬样细胞为主 ,未见到多核 生活跃 , 组织细胞 2112 % , 并可见少量 ( ) 颅神经检查 - ,心肺叩听无异常 ,腹平 样网状细胞 , EB 病毒抗体测定 : 住院后 的淋巴样网状细胞及吞噬细 胞 现 象 。软 ,肝肋下 310 cm , 质中等 , 脾已切除 。 20 天 IgM 1 ?10 , 40 天后测 IgM1 ?40 , EB 病毒抗体 IgM1 ?40 ,胸片 : 双侧肺门 旁可见絮状密度增高影 ,边缘不清 。 讨710 cm , 并出现腹 住院一周后肝肿大 Ig G1?80 。嗜异凝集 1 ?7 , 胸片 : 两肺纹论 :病毒相关性吞噬血细胞综合 水 ,巩膜 、皮肤黄染加重 , 皮肤可见散在 理加深 ,模糊 。 征 ,在任何年龄均可发病 , 发病前 2 ,6 针尖大小之出血性皮疹 。给予抗感染及 例 2 男 , 7 月 。发热 、皮疹 2 天入 周有病毒感染史 ,此病多因疱疹病毒 ,腺 院 。40 天前曾因贫血 , 出血 , 肝脾肿大 保肝治疗 ,静滴白蛋白 10 g/ 隔日 ,共 50 病毒 , EB 病毒引起 ,小儿多继发于 EB 病 诊断为雅克综合征住院 20 天 , 贫血改 g ,同时静注地塞米松 3 mg/ 隔日 , 治疗 毒。主要临床症状为发热 ,皮疹 ,贫血 ,肝 善 ,肝脾回缩出院 。 40 天病愈出院 。 脾及淋巴结肿大 ,且有肺浸润 ,神经系统 体检 : 体温 3815 ?,贫血貌 ,双耳后 μ辅助检查 :总胆红素 105mol/ L ,间 损害或肾功能衰竭症状。诊断主要根据 淋巴结肿大 ,双肺可闻及小水泡音 ,肝肋 μ()接胆红素 70mol/ L ,谷丙转氨酶 AL T 临床症状及骨髓象可见良性的组织细胞 下 610 cm ,脾肋下 410 cm ,质中等 。入 () 45 IU/ L 正常 < 20 IU/ L。凝血酶原时 增生及吞噬血细胞现象。此病发病形式 院 6 天后出现皮肤 、巩膜黄染 ,给予抗感 () 间 38 秒 正常 18 秒,血浆蛋白 45 g/ L , 染及保肝治疗 9 天后病情渐好转 。 多种多样 ,有时鉴别诊断困难较大。 白蛋白 25 g/ L 。肝功五项均阴性 。血常 μ辅助检查 :总胆红素 227mol/ L ,间 本病需与恶性组织细胞增生症及家 ( ) 规 :血红蛋白 Hb93 g/ L ,白细胞 710 × μ接胆红素 169 mol/ L ,凝血酶原时间 22 族性嗜血细胞增生相鉴别 。 9 10g/ L , 淋巴 细 胞 0159 , 血 小 板 64 × 9 ( ) 10/ L ,网织红细胞 0122 , 血培养 - 。 () 秒 正常对照 15 秒,血浆蛋白 52 g/ L , ( )收稿 :1997203203 修回 :1997206205 白蛋白 32 g/ L 。肝功五项均阴性 , Hb 699 ()g/ L , 白 细 胞 1310 ×10/ L , 淋 巴 细 胞 本文编辑 :李群 作者单位 :110005 沈阳军区 202 医院