植物基因组DNA提取

【实验目的】 掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。学习根据不同的植物和实验要求和改良植物总DNA抽提方法。 【实验原理】 通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。 十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。 【仪器、材料、试剂】 (一) 仪器 1．高速离心机 2．烘箱 3．冰箱 4．水浴锅 5. 高压灭菌锅 （二）材料 1．十六烷基三甲基溴化铵(CTAB) 2. 三羟甲基氨基甲烷（Tris） 3．乙二胺四乙酸（EDTA） 4. 氯化钠 5．2-巯基乙醇 6. 无水乙醇 7. 氯仿 8. 异戊醇 （三）试剂 1. CTAB抽提缓冲溶液: 250ml 配制方法：称取CTAB 4g，放入200 ml的烧杯，加入5 ml的无水乙醇，再加入100ml的三蒸水，加热溶解，再依次假如56 ml的5mol\l NaCl、20 ml 的1 mol\l Tris-HCl 20ml( PH8.0)、8ml 的0.5 mol/l EDTA定容至250 ml摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温, 冷却后加入2ml的1% 2-巯基乙醇（400ul），4℃保存。 2. 氯仿:异戊醇=24：1（配制方法如实验二） 3．TE缓冲液: PH8.0（配制方法如实验二） 【实验步骤】 (一) DNA的提取 1. 2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热； 2. 取少量叶片置于试管中，用小杵磨至粉状； 3. 加入700ul的2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动摇匀； 4. 置于65℃的水浴槽或恒温箱中，每隔10 min轻轻摇动，40 min后取出； 5. 冷却2 min后，加入氯仿-异戊醇(24:1) 至满管，振荡2~3 min，使两者混合均匀； 6. 10000 rpm离心10 min，与此同时，将600 μl的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中； 7. 10000 rpm离心1 min后，移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙醇的离心管内，将离心管慢慢上下摇动30s，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物； 8. 10000 rpm离心1 min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出 9. 加入800 μl 75%的乙醇，将DNA洗涤 30 min； 10. 10000 rpm离心30s后，立即倒掉液体，干燥DNA（自然风干或用风筒吹干）； 11. 加入50 μl 0.5 × TE缓冲液，使DNA溶解； 12. 置于-20℃保存、备用。 【注意事项】 1. 叶片磨得越细越好。 2. 注意移液器的正确使用。 3. 由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。