饱和转铁蛋白和凝血酶在脑出血后早期脑损伤中的作用
饱和转铁蛋白和凝血酶在脑出血后
早期脑损伤中的作用
朱丹化叶盛曾博诸葛启钏
【摘要l 目的探讨脑出血后早期脑组织中铁的来源及其损伤机制,观察是否存在另一种铁相关血液成分如饱和转铁蛋白
(holo—Tf),它和凝血酶也可能参与脑出血后早期的脑损伤。方法在雄SD大鼠右侧大脑基底核分别注入holo—Tf、游离转铁蛋白
(apo—Tf)、小剂量凝血酶、凝血酶与apo—Tf复合物以及凝血酶与holo—Tf复合物。24h后观察脑水肿情况,鉴定DNA破坏(免疫组
化测定8一羟基一2一脱氧鸟苷)和铁分布(三价铁染色测定)情况。结果h...
饱和转铁蛋白和凝血酶在脑出血后
早期脑损伤中的作用
朱丹化叶盛曾博诸葛启钏
【摘要l 目的探讨脑出血后早期脑组织中铁的来源及其损伤机制,观察是否存在另一种铁相关血液成分如饱和转铁蛋白
(holo—Tf),它和凝血酶也可能参与脑出血后早期的脑损伤。方法在雄SD大鼠右侧大脑基底核分别注入holo—Tf、游离转铁蛋白
(apo—Tf)、小剂量凝血酶、凝血酶与apo—Tf复合物以及凝血酶与holo—Tf复合物。24h后观察脑水肿情况,鉴定DNA破坏(免疫组
化测定8一羟基一2一脱氧鸟苷)和铁分布(三价铁染色测定)情况。结果holo—Tf、apo—Tf和1U凝血酶单独注射都不能导致脑水
肿。而holo—Tf和凝血酶复合物能导致明显脑水肿(P<0.05)、DNA破坏和同侧基底核铁的蓄积。结论在脑出血后早期(24h内)的
确存在铁介导的脑损伤,它与血红素降解产物之一的铁离子无关。主要作用机制可能是holo—Tf和小剂量凝血酶导致脑出血后脑损
伤。而凝血酶可能通过促进细胞内铁摄取来加重脑损伤。
【关键词】脑水肿铁氧化应激凝血酶转铁蛋白
HoIo—transferr呐andthrombinareinvolvedinbraindamageafterintracranialhemorrhageZHUDanhua,YESheng。ZENGBo,eta1.
DepartmentofNeuroaurgery。theFirstAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalCollege。Wenzhou325000。China
【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheinvolvementofhoIo—transfeⅢn(holo-If)inbraintissuedamageafterintracranial
hemorrhage(ICH).MethodsMaleSprague-Dawleyratsreceivedanintracerebralinfusionofholo-Tf,apo(noniron—Ioaded)一Tf,
thrombin.oracombinationofTfwithlhrombinintotherightbasaIganglia.Theratswereeuthanized24hlaterformeasurementof
brainedemaandassessmentofDNAdamage(by8一hydroxyI一2一deoxyguanos;neimmunohistochemistry).Irondistributionwas
examinedbyirondyeing.ResultsHolo—Tf。apo-Tf。or廿1rOmbindidnotinducebrainedemawhenadministeredalone.The
combinationofholo—Tfwiththrombincausedbrainedema(P<0.05).DNAdamage,andintracellulariFORaccumulationjnthe
ipsilateralbasalganglia.ConclusionResultssuggestthatTf-boundironmaycontributetoICH-inducedbraininjuryandthrombin
mayfacilitatecellularironuptake.
【Keywords】BrainedemaIron0xidativestressThrombinTransferrin
许多研究已证实脑出血后第3天血红素降解产物
开始缓慢释放,包括铁离子、胆红素和一氧化碳,其中
铁的释放在脑出血3d后介导的脑损伤中起重要作用。
然而有研究发现脑出血后早期(24h内)也出现铁介导
的脑损伤。那么脑出血早期的铁来源于哪里呢?是否可
能存在一种铁相关成分,它能导致脑损伤并且与血红
素的降解产物无关。因此,本实验观察在血浆中正常存
在的饱和转铁蛋白(holo—Tf)是否能导致脑损伤。将
holo—Tf或游离转铁蛋白(apo—Tf)单独或加入凝血酶分
别注人大鼠脑内观察脑水肿、DNA破坏和铁分布情况,
现将结果报道如下。
1
和方法
1.1动物准备和脑内注射实验使用雄性SD大鼠34
只,体重300~4009,由温州医学院提供。将大鼠用水合
作者单位:325000温州医学院附属第一医院神经外科
氯醛(4ml/lOOg)麻醉后放在立体定向仪架上,在右冠状
缝旁开中线3.5mm处颅骨上钻Imm4,;fL,用微量进量
器26号针头穿刺右侧基底核(前后肉水平位,前肉向右
旁开3ram,硬脑膜向下6mm),分别注入apo—Tf(Sigma
公司)0.4mg,holo—Tf(Sigma公司)0.4mg,凝血酶(Sigma
公司)1U,apo—Tf+凝血酶(0.4mg+1U),holo—Tf+凝lIIL酶
(0.4rag+1U)。上述药物分别用50斗l0.9%氯化钠溶液溶
解,并用微泵以10¨l/min速度注射。注射完后停针
5min缓慢拔出针头,骨蜡封闭颅骨小孑L后缝合皮肤。Tf
的剂量根据正常血浆水平(约3。5ng,ITll)选择【11。holo-Tf
的百分比取决于铁的水平,大鼠一般为30%~40%。选
择凝血酶的剂量时考虑:(1)该剂量单独使用不会导致
脑损伤I:I,便于观察其是否能加剧holo—Tf导致的脑损
伤。(2)大脑内注入凝血酶能增量调节脑内Tf受体的表
达I,I,说明凝血酶和Tf有潜在关联。
1.2实验分组实验分2大组。第1大组共5小组,每
23
万方数据万方数据
组5只大鼠,右基底核分别注入apo—Tf、holo—Tf、凝血
酶、apo—T“凝血酶、holo—T“凝血酶。24h后处死并测定
脑组织水含量。第2大组共3小组,每组3只大鼠,右基
底核分别注入holo—Tf、apo—Tf+凝Il『L酶、holo—Tf+凝血
酶。24h后处死并用免疫组化法测定脑组织中8一羟基一
2一脱氧鸟苷(8一OHdG)及三价铁染色测定铁分布。
1.3脑组织水含量测定立体定向仪下大鼠脑内注射
药物后24h,将大鼠用水合氯醛(4ml/1009)腹腔内注射
麻醉,然后断头取脑,快速沿额极后4mm冠状位取3ram
后脑组织块,并分离成左右基底核和皮层4组织块,同
时取小脑作为对照。取出立即用电子分析天平称其湿
重,然后用100℃烘干机24h烘干后测其干重,最后计
算脑组织水含鼍(%)=(湿重一干重/湿重)×100%。
1.4免疫组化和组织化学大鼠麻醉后心内注射4%
多聚甲醛溶液(溶解于磷酸盐缓冲o.9%氯化钠溶液,pH
=7.4)固定后,取出脑组织,放人4%多聚甲醛溶液12h,
常规脱水,透明,将脑组织石蜡包埋,切片厚度为4斗m。
用免疫组织化学(EliVision法)测定8-OHdG。显微镜观
察细胞核染色显示棕黄色颗粒为免疫组织化学染色阳
性。改良Perl’s染色技术测定Fe“浓度。显微镜观察含
铁血黄素旱蓝色,胞核呈红色为Perl’s阳性细胞。
1.5统计学处理所有数据通SPSSl0.0软件包处理,
计量数据均以牙拯表示,组间比较采用方差分析(Scheffe
事后多重比较检验)。
2结果
2.1脑组织水含量见表1。
表1各组脑组织水含量(%)
组别 n 对侧皮层 同侧皮层 对侧基底核 同侧基底核 小脑
凝血酶
holo一7rf
atm--Tf
al'0-Tf+凝IffL酶
hoIo-7rf.+凝血酶
78.9±0.08‘
78.5±0.09‘
78.6±0.08‘
78.8±0.10+
78.7±0.04
79.0±0.19’ 77.7±0.05‘
79.1±0.17+
78.9±0.17‘
79.0±0.17‘
80.2±O.02
77.9±0.04‘
77.6±O.10+
77.8±O.09.
77.74-0.05
78.2±0.3r
78.1±0.06‘
78.1±0.10‘
78.2±0.40‘
81.0±O.1l
77.9±0.10‘
77.8±0.08.
77.7±0.07’
77.8±O.03‘
77.9±0.09
注:与hoIo-Tf+凝血酶组比较,’P<0.05
表1提示,脑内注射holo—Tf、apo—Tf或凝m酶24h
内均不能导致同侧基底核区和皮层的脑水肿,而注射
holo—T“凝血酶导致同侧基底核区和皮层明显脑水肿
(与其它组比较,均P<0.05)。
2.2注射holo—Tf后铁染色注射holo—Tf(图la)或
apo—Tf+凝IfIL酶(图1d)均不能导致Perl阳性细胞出现,
然而注射holo—T“凝血酶能导致同侧脑组织Perl阳性
细胞】}{{现(图lb),但对侧没有}l{现(图1c)。
2.3 DNA损伤注射hoio—Tf(图2a)或apo—Tf+凝血酶
(图2d)后同侧基底核8一OHdG免疫反应缺失。注射
holo—Tf+凝血酶后同侧基底核测到大量8-OHdG免疫
反应(图2b),但对侧没有测到(图2c)。
24
万方数据万方数据
3讨论
出血后铁主要来源于红细胞的裂解。脑内注射已裂
解红细胞能导致急性脑损伤【4j,与之对照,脑内注射完整
红细胞所产生的脑损伤时间为3d,与红细胞正常裂解
的时间相同。因为铁能导致自由基形成从而导致脑损
伤【蚓,所以在大鼠脑出血模型中观察铁螯和剂对脑出血
后脑损伤的影响发现它能减轻急性脑损伤,而且它在脑
出血后6h使用有效,24h后使用效果较差161。这些结果
说明脑出血早期也存在铁介导的脑损伤。
转铁蛋白是铁从组织运输到血浆的重要物质,转铁
蛋白以holo—Tf和apo一"If的形式存在于血浆中。通常
holo—Tf占30%一40%。与apo—Tf相比,holo一"If和Tf受
体结合力更好。通过Tf受体来实现铁的细胞内摄取和
释放m。脑内Tf受体一般在上皮细胞上浓度较高,而在
脑实质细胞上较少表达。脑l叶J血能增加Tf受体水平Isl。
凝血酶是一种多功能丝氨酸蛋白酶,由无活性的凝
血酶原产生,催化纤维蛋白原转变为纤维蛋白,在凝血
级联反应中起关键作用。脑出血后凝血酶在脑内产生的
时间是一个持续的过程,直至凝m酶原的耗竭。动物模
型已经证实铁和凝血酶在脑出血介导脑损伤中的作用
191。凝血酶产生于m肿形成的过程中,脑实质组织的凝血
酶能导致急性脑损伤f101。凝血酶抑制剂能减轻脑出血后
脑水肿和肢体功能缺失⋯】。有人已经发现少剂量的凝血
酶通过各种抑制脑损伤途径对脑组织有保护作用㈨01,
本实验发现单独注射1u凝血酶并不能导致明显脑损
伤与以上结论相符。而腩内注射大剂量(5或10U)凝血
酶就会产生脑损伤。在某些特定条件下小剂量凝血酶也
能致腩损伤,比如同时注射lu凝血酶和活化的组织型
纤维蛋白溶酶原或脑缺吼时注射低剂量凝血酶【121会加
剧脑损伤。以上这些表明凝m酶的作用随着剂量改变和
细胞环境变化而变化,其具有潜在的诱导细胞损伤的功
能。最近发现腩内注射1U凝m酶1d或3d后能导致同
侧基底核Tf受体水平明显增加口1,所以它在一定条件下
可能会通过增量调节转铁蛋白受体来促进铁摄取从而
导致局部铁浓度增加。但是脑出血后凝血酶介导的脑损
伤是否通过铁初始介导尚未明确。Wagner等15I最近报道
在白种人血浆中存在一种成分能快速诱导氧化应激。
本实验开始观察holo一"If和apo—Tf能否导致脑损
伤(通过脑水肿来评价)。注射转铁蛋白剂量的选择相当
于它在100“l血浆中的浓度11I,结果holo—Tf,apo—Tf和
凝IfIL酶均不能导致脑水肿;而注射holo—T“凝血酶能导
致明显脑水肿(约81%)这恰好能证明脑}f;血24h内不
仅存在脑损伤并且与铁有关。
实验中单独注射holo—Tf不能增加细胞内铁水平
(通过Perl’s染色法来评估),这可能表明在正常脑组织
中低浓度的Tf受体阻止转铁蛋白结合铁转移铁到细胞
内;注射holo—T“凝血酶能提高细胞内铁染色表明通过
凝血酶对Tf受体的增量调节导致铁结合转铁蛋白进入
脑实质细胞增加。
脑内铁增高可导致脂质过氧化和自由基形成,自由
基的一个靶点之一就是DNA。在本实验中注射holo一11f+
凝血酶能导致DNA的氧化损伤(通过测定8-OHdG来
评估),这也能证明脑出血24h内存在与铁相关的脑损
伤。
所以本实验所涉及的3个内容(脑水肿检测、细胞内
铁水平检测和DNA损伤指标)相辅相成,表明大鼠模型
脑内注射holo—Tf.+凝血酶24h内能导致脑水肿,增加细
胞内铁水平和导致DNA损伤;而单独注射holo—Tf或
apo—Tf+凝血酶却不能。机制町能因为凝血酶能增量调
节神经元上的Tf受体I”,促进铁从holo一"If转移到脑细
胞内,从而导致细胞内铁水平增加。因此在脑内血肿形
成时,h01n_Tf和凝血酶的同时存在可能导致脑损伤,这
也可以解释为何铁螯和剂能减轻脑m血后急性脑损伤。
总之,本实验表明注射holo—T“凝血酶能导致细胞
内铁水平增加可能与凝m酶通过增量调节转铁蛋白受
体来促进铁摄取和氧化应激有关。这=fill是脑}l;血后早
期脑损伤的主要途径,它对提供治疗策略有重要价值。
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(下转第29页)
25
万方数据万方数据
LWBV、HWBV、PV和Fi含量的判定界值,对预测重型
颅脑外伤术后外伤性脑梗死有较高的灵敏度和特异度。
血浆Fi含量和MCAVm的AUC显著大于LWBV、
HWBV和PV的AUC,且灵敏度和特异度均较高。TCD
检测MCAVm联合血浆Fi含量测定预测外伤性脑梗死
的灵敏度是97.8%,特异度是53.1%。因此,两者联合应
用可早期预测外伤性脑梗死,指导临床早期采取措施,
有助于降低颅脑外伤的病死率和致残率。
综上所述,脑血管痉挛和血液流变学异常是颅脑外
伤继发性脑损伤的重要危险因素,参与外伤性脑梗死的
病理生理机制,TCD检测MCAVm联合血浆Fi含量测
定可明显提高预测外伤性脑梗死的灵敏度。
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(本文编辑:沈叔洪)
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