成人前脂肪细胞的原代培养

成人前脂肪细胞的原代培养 罗盛康!席菁乐"南方医科大学南方医院整形科!广东 广州 !"#!"!# 摘要$目的 探索人前脂肪细胞的原代培养方法% 方法 取成人的腹部纯脂肪颗粒!采用原代消化细胞培养法培养出梭 形细胞!对培养细胞进行形态学研究!测定生长曲线并用油红 $ 脂肪染色法进行染色及定性%结果 培养出的梭形细胞 成分均一!增殖旺盛!分化率高!经动态形态学观察&生长曲线测定及油红 $ 脂肪染色法测定!证明是功能活跃的前脂 肪细胞%结论 在成熟的脂肪组织中存在着可以增殖并分化成熟&形成脂肪组织的前脂肪细胞%组织化的脂肪组织 是修复软组织缺损的最佳填充材料!该实验为脂肪组织工程的发展和应用打下了一定的基础% 关键词$前脂肪细胞’原代培养’脂肪组织 中图分类号$%&’’()%*++))))))))文献标识码$,))))))))文章编号$"###&+!--"+##!(#’&#+.#&#/ !"#$%"& ’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因先天性畸形&外伤及肿瘤切除等各种原因所引 起的全身各部位组织器官的缺损在临床上很常见!这 不仅造成了外形上的缺陷!而且会引起不同程度的功 能障碍)"*%自体脂肪组织应该是修复此类软组织缺损 的最佳选择% 然而临床上成熟脂肪组织的移植!无论 是脂肪块移植还是脂肪颗粒注射移植!效果都不尽如 人意% 组织工程化人工脂肪的种子细胞!即前脂肪细胞 是一种能够增殖并向脂肪细胞分化的特异性的前体 细胞!其对外界机械损伤的抵抗力较强!可望成为软 组织缺损的有益填充物% 国外已建立了来源于鼠的 前脂肪细胞的细胞株! 如 ’S’&0"!’S’&V//+,!DT". 系列等 )+9)’*!但到目前为止尚未见报道有关人前脂肪 细胞株的构建%我们从人脂肪组织中培养出了前脂肪 细胞!如下% "))材料与方法 "U"))组织来源 选取于本院行切疤植皮术的正常体质量患者!年 龄 +#[/# 岁!平均 +- 岁!无其他急慢性疾病!切取腹 部正常皮肤下皮下脂肪组织% "U+))主要试验用品和化学试剂 V"+ 培养基!青&链霉素原液!!型胶原酶!L4@4G 均购自 P=THD公司’胎牛血清购自杭州四季青生物有 限公司’胰蛋白酶&胰岛素&地塞米松均购自 2=6C8 公司’细胞培养板&培养皿购自 \DA5=56公司% "U’))方法 "U’U"))原代培养 术中切取皮下脂肪组织!F]2 洗涤! 去除脂肪组织中肉眼可见的纤维及血管成分!剪切约 +#)C=5!使之成为约 #U![")CC’的小组织块!以 ")###) !^C=5 离心 "#)C=5!取上层纯脂肪颗粒!加入 "_胶原 酶+体积约为脂肪组织的 ’[/ 倍(!置于 ’.)!&体积分 收稿日期$+##/&""&#- 基金项目$ 广东省自然科学基金 +##"#’-(’ 广东省卫生厅医药基金 +,+##’//+( 2I@@DAB4N) TJ) K8BIA8>) 2H=45H4) VDI5N8B=D5) DE) PI85ND56) FADO=5H4) ‘##"#’--a )85N)M4N=H8>)%4G48AH3)VDI5N8B=D5)DE)FIT>=H)L48>B3)]IA48I)DE) PI856ND56)FADO=5H4)‘,+##’//+a 作者简介$罗盛康+"Z*’&(!男!"Z-* 年毕业于第一军医大学!+### 年 获瑞士洛桑大学医学院博士学位 ! 副教授 ! 副主任医师 ! 电话 $ #+#&*"*/"-*!!X&C8=>$>IDbG34567856c3DBC8=>UHDC ))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))第一军医大学学报‘<)V=AGB)M=>)M4N)15=Oa)))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))+##!(+!‘’a+.#, , 图 !""原代培养前脂肪细胞的形态学观察 !"#$% &’()*’+’#",-+ ’./0(1-2"’3 ’4 ,5+25(06 )(7-8")’,920/ #$"%&’(&)*+",-)"./0"+1234"5$"%&’(&)*+",-)"67+1234"%$"%&’(&)*+",-)".89":**;3 # 5 % 数 <=%>.培养箱内消化 !<7?!间断振荡!使消化液可 以和脂肪组织充分接触" 再以 !7<@@7)ABCD 离心 9E<7 BCD!弃去上层漂浮的脂肪细胞和培养液!沉积的细 胞用基础培养基制成细胞悬液!反复吹打使之混合均 匀!!<@7!F尼龙网过滤!G5H洗涤并离心! 沉积的细 胞仍用少量基础培养基制成细胞悬液! 吹打均匀!接 种于 9<7BB 培养皿内! 接种密度为每平方厘米 !! !@0E.!!@0个细胞" 培养皿内加入适量含 .@I胎牛血 清!青#链霉素浓度均为 !@@7JAB’ 的 K!. 培养基!混 合均匀!置于 9L7"!<=%>.孵箱内孵育" 每天观察! .E97+换液" !M9M.77细胞传代 当细胞生长接近单层汇合 <@=时即 进行常规传代培养 " 以 @M.<=胰蛋白酶N@M@9I OPQ#进行消化!于室温下消化约 !RBCD!在倒置显微 镜下观察见胞质回缩#细胞间隙增大!立即吸出消化 液!加入适量培养基!用吸管将细胞吹打下来!按 ! 传 . 的比例进行传代" 当传代细胞生长接近单层汇合 L@=时!可继续传代" !M9M977细胞活力测定 原代培养时吸取混匀后的细胞 悬液 6 滴及 @M0=锥虫蓝溶液 ! 滴于小试管内!混匀! 在 9分钟内用血球计数板观察计数!可见死细胞被蓝 染" 计数活细胞占细胞总数的比例!即为活细胞率" !M9M077细胞生长曲线的绘制 将细胞悬液混匀!计数! 调整细胞浓度为 9!!@0E 染色定性 细胞生长至一定时间后!以 油红 >染色法进行化学染色!观察并拍照"油红 >染 色提取法可简便#快速地对体外培养的前脂肪细胞转 化率进行定量"文献报道其准确性和敏感性与测定前 脂肪细胞分化过程中的酶磷酸甘油脱氢酶相似" 因此常用来作为对体外培养的前脂肪细胞进行鉴 定 $<%" !M9MS77油红 > 染色提取法测定细胞内脂肪含量 接种 方法同 !M9M0!隔日取 9 孔!根据 U1BC)*V $<%等的方法 测定!以 PW!X值表示细胞内相对脂肪含量" .77结果 .M!77原代培养前脂肪细胞的形态学观察 接种细胞在数小时后贴壁!初为类圆形!细胞大 小不等!核 A 质比例较大!细胞核几乎充满胞质" .E0 天即逐渐伸展开!大多数细胞为长梭形!两端尖细!尖 端可延伸很长!有的细胞为多角形!立体感较强"核椭 圆形!较大!有的细胞内可见双核&应处于分裂相’!核 仁较清晰&图 !#’"L7+左右细胞大量繁殖!67+左右生 长接近单层汇合 !A. 后细胞内开始积聚脂肪颗粒!细 胞由梭形渐变为椭圆形#圆形&图 !5’!脂肪颗粒先在 细胞核周围出现!逐渐增多#增大!直至遍布细胞内! 将核挤至细胞边缘!.E9 周可形成内含大小不等脂滴 的多脂滴脂肪细胞!脂滴更可汇合形成单脂滴脂肪细 胞&图 !%’" 含脂滴细胞逐渐增多!最终可达到 Y@Z 以上" .M.77前脂肪细胞的传代培养 当原代培养细胞生长接近单层汇合 !A. 时即可 进行常规传代培养" 传代后可见前脂肪细胞多呈梭 形!均匀分布!形态大小较一致!细胞紧密平行排列或 呈漩涡状!细胞内见不到脂滴" 细胞增殖迅速!一般 .E07+ 即可达到单层汇合约 Y@=! 可再次进行传代" 传代后细胞不能自发向脂肪细胞分化!单层汇合形成 后细胞内长时间不出现脂滴而保持梭形形态"加入胰 岛素 !@!![AB’和的塞米松 !!!B-’A\ 后则向脂肪细胞 旺盛分化" 一般可传代至 LEY 代!细胞增殖迅速!分 化率高!与原代相当!往后则细胞衰退!增殖及分化能 力下降" .M977活细胞率 活细胞率均在 6@=以上! 酶消化法所得细 第 9 期 罗盛康]等M成人前脂肪细胞的原代培养 .L!( ( 图 !""前脂肪细胞油红 # 染色 !"#$% &"’ ()* & +,-"."./ 01 ,23 4(356"4078,)+ 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.1 0 1 3 5 7 9 11 13 15 图 $%"前脂肪细胞生长曲线 9"/$: ;(0<,2 7=(>) 0? ,2) 4()56"4078,)+ !&’() 图 *""前脂肪细胞生长过程中细胞内脂 肪含量变化曲线图 9"/$@ A25./)+ 0? ".,(578,04’5+B"7 ’"4"6 ". ,2) 7=’,=()6 4()56"4078,)+ 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 ¡¢£¤ OD¢ +,- +,. +,/ +,0 +,1 +,! +,* +,2 +34 + 4 * 1 / - 4*44 41 4/ 4- 24 !&’() 胞活力较高! 2,!%%前脂肪细胞的生长曲线 细胞数量逐渐增多" 第 1 天左右进入指数增长 期"第 -天左右到达平台期! 其倍增时间约为 0+%5左 右#图 2$% 2,1%%前脂肪细胞生长过程中细胞内脂肪含量变化 细胞内脂肪含量于培养第 -天开始迅速增加"4. 天左右达到高峰&图 *$% 2,0%%油红 #染色观察 油红 # 染色后前脂肪细胞内出现红染颗粒"证 明镜下所见细胞内颗粒确为脂滴&图 !$% *%%讨论 临床上各种原因所引起的软组织缺损是很常见 的"它不仅会造成外形上的缺陷"而且会引起不同程 度的功能障碍%整形外科医生们一直致力于寻找一种 最佳的组织填充物%自体脂肪组织应是修复软组织缺 损的最佳填充物"但目前临床上所采取的脂肪块移植 或脂肪颗粒移植效果都不佳" 移植后体积会减少 !+670+6’08"/("如何保持移植脂肪组织的生物活性一 直是整形外科学界及所有修复外科面临的难之 一% 组织工程学是近 4+ 多年提出的新概念" 它是应 用细胞生物学和工程学的原理"研究开发修复)改善 缺损组织结构和功能的生物替代物的一门科学"标志 着医学将走出器官移植的范畴"步入制造组织和器官 的新时代%但目前有关组织工程化人工脂肪构建的报 导极少"均处于探讨)摸索阶段% 9(:;<=>’.74+(曾报导应 用 ?@ 大鼠附睾部前脂肪细胞作为种子细胞吸附于 9ABC于大鼠侧腹部构建成熟脂肪细胞%前脂肪细胞 是一类能够增殖并向脂肪细胞分化的特异性的前体 细胞% 它是一种类成纤维细胞"在演变的过程中不断 吸收脂质"最终成为成熟的脂肪细胞% 前脂肪细胞对 外界机械损伤的抵抗力较强"可望成为软组织缺损的 有益填充物’-(% 本实验通过酶消化法获得了成分均一"增殖和分 化均旺盛的梭形细胞"并经生长曲线测定和脂肪染色 证明其确为前脂肪细胞"具有文献中提出的 * 个典型 特征’44("即*D4E来自脂肪组织"形态为梭形"胞浆内无 或很少有脂肪颗粒+#2$增殖迅速"与成纤维细胞在倍 增时间上接近+#*$ 在形成单层汇合后能变为脂肪细 胞"胞质内会出现脂肪颗粒"为建立人的前脂肪细胞 株打下了基础% 本实验的细胞来源为经典的血管基质组分细胞 #F:;GH(I% J(F=KI(;% L;(=:. /?’;./!" #$0/Y/EDN’NG);/G;/OG<;’H/JKJNGQK/)I/ (’N/(KOGONG;/D’;NGb’NG);/)I/’QGJ)OK/C);SK(OG);/ ’;Q/ N(GZ. /ZG;/9X0 /XDE’;/J(K’QGJ)C[NK/CDHND(K/’;Q/ N:K/ KON’FHGO:EK;N/)I/:[JK(JH’OG’/’;Q/:[JK(N()J:[/E)QKH #3$0 /&:G;/ 3/ ^H’ON/#D(