正骨通痹丸抗骨质疏松的药理作用及机理研究

长春中医药大学 硕士学位论文 正骨通痹丸抗骨质疏松的药理作用及机理研究 姓名：周成刚 申请学位级别：硕士 专业：中医骨伤科 指导教师：李跃飞 20090201 长春中医药大学2009届硕士学位论文 英文缩略语 4 英文缩略语 英文缩写 英文全称 中文名词 ALP StrACP HOP OC TNF-a IL-6 Alkaline phosphatase Tartaric acid phosphatase Hydroxyproline Osteocalcin Tumor necrosis factor-a Interleukin-6 碱性磷酸酶 酒石酸抗酸性磷酸酶 羟脯氨酸 骨钙素 肿瘤坏死因子-a 白介素-6 长春中医药大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是个人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。 除文中已经特别加以注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发或撰写过的作品 成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明并致谢。本人完全意 识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名 年 月 日 关于学位论文成果归属权的声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下自选课题，是本人承担的国家立项资 助的计划课题的一部分，系本人在导师指导下独立进行研究工作所取得的成果，归属权非长春中医 药大学和本人导师所有。特此声明，本声明的一切法律责任由本人承担。 论文作者签名 指导教师签名 年 月 日 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解长春中医药大学有关保留使用学位论文的规定，同意学校保留并向中国科学技术 信息研究所及中国学术期刊（光盘版）电子杂志社送交论文的复印件和电子版，允许被查阅和借阅。 本人授权长春中医药大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入《中国学位论文全文数据库》及 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》进行检索，可以采用影印、缩印或其他复印手段保存和汇 编本学位论文。 （保密论文在解密后应遵守此规定） 论文作者签名 指导教师签名 年 月 日 长春中医药大学2009届硕士学位论文 中文摘要 1 中 文 摘 要 目的：探索正骨通痹丸对大鼠骨质疏松的影响，以明确其疗效并探讨其作用机制。 ：使用Wistar大鼠，分别采用肌注地塞米松 8周及双侧去卵巢手术的方法建立 糖皮质激素骨质疏松动物模型及去卵巢骨质疏松动物模型。模型成立后，连续灌胃给药 治疗 11～12 周后处死，分离股骨，进行骨密度、骨含量及骨力学等方面的检查；采血 及尿液，进行血清碱性磷酸酶（ALP）、血清酒石酸抗酸性磷酸酶（StrACP）、尿羟脯氨 酸（HOP）、血清骨钙素（OC）、血钙、血磷、血清肿瘤坏死因子-a（TNF-a）及血清白 介素-6（IL-6）含量的测定。 结果：糖皮质激素骨质疏松模型：与正常对照组相比，模型组大鼠股骨的骨密度、 骨矿含量、最大弯曲力、抗弯强度及断裂挠度均显著下降，尿 HOP 含量显著升高，血 清 StrACP显著增加,同时血清 ALP显著下降。正骨通痹丸剂量依赖性地对抗地塞米松所 致的血清 ALP 的降低及血清 StrACP 的增加。与模型组相比，正骨通痹丸 5.4g·kg－１剂 量组可显著对抗地塞米松所致骨密度的降低，正骨通痹丸 5.4g·kg－１剂量组生物力学性能 显著增加，且正骨通痹丸 2.7g·kg－１及 1.35g·kg－１剂量组断裂挠度显著增加；正骨通痹丸 5.4g·kg－１剂量组尿 HOP 含量显著降低。去卵巢骨质疏松模型：与假手术组相比，去卵 巢组大鼠股骨的骨密度、骨矿含量、抗弯强度、最大弯曲力及断裂挠度均显著下降；血 清 ALP 、血清 StrACP 及 OC 显著升高；血钙、血磷没有显著性变化；血清 TNF-a 及 IL-6含量均显著升高。与去卵巢组相比，正骨通痹丸各剂量组骨密度、骨矿含量显著增 加；正骨通痹丸 5.4g·kg－１剂量组骨钙、骨磷、最大弯曲力、抗弯强度及断裂挠度均显著 增加；正骨通痹丸剂量依赖性的对抗去卵巢所致的血清 StrACP及血清 ALP的增加，且 各剂量组 OC 含量显著下降；正骨通痹丸各剂量组剂量依赖性地降低大鼠的 TNF-a 及 IL-6含量。 结论：正骨通痹丸可有效地升高糖皮质激素及摘卵巢所致骨质疏松大鼠骨密度，并 改善其生物力学性能，增强抗骨折能力，其机制与抑制白介素-6及肿瘤坏死因子表达， 抑制骨吸收，促进骨形成，维持骨转换平衡有关。 关键词：骨质疏松症；正骨通痹丸；骨密度；骨代谢；骨生物力学；细胞因子 长春中医药大学2009届硕士学位论文 英文摘要 2 ABSTRACT Purpose: study the influence of Zheng Gu Tong Bi Pills (Zheng Gu Tong Bi Wan) on the rat’s osteoporosis so as to determine its curative effect and discuss its action mechanism. Method: choose the Wistar rats to form the animal models of glucocorticoid induced osteoporosis and ovary removal induced osteoporosis with the methods of eight weeks’ injection of Dexamethasone and two-side ovary removal resection respectively. After modeling, continuously administrate drug by drenching for 11 or 12 weeks, then put them to death and get the thigh bone to do the tests of bone density, bone content, bone mechanics and etc; sample blood and urine, and determine the content of serum ALP, serum StrACP, urine HOP, serum OC, blood Ca, blood P, serum TNF-a and IL-6. Result: glucocorticoid induced osteoporosis model: compared with the normal reference group, the thigh bone density, bone mineral content, max. bending capacity, bending strength and break deflection of the rats in the model group all reduce obviously; the urine HOP content rises obviously; the serum StrACP increases obviously and the serum ALP reduces obviously at the same time. The dosage of Zheng Gu Tong Bi Pills dependently antagonizes the reduction of serum ALP and increase of serum StrACP caused by Dexamethasone. Compared with the model group, the group with 5.4g·kg－１ dosage of Zheng Gu Tong Bi Pills may obviously antagonizes the reduction of bone density caused by Dexamethasone, the biomechanical performance of the group with 5.4g·kg－１ dosage of Zheng Gu Tong Bi Pills obviously strengthens, and the break deflection of the groups with 2.7·kg－１ and 1.35g·kg－１ dosage of Zheng Gu Tong Bi Pills both increases obviously; and the urine HOP content of the group with 5.4 g·kg－１ dosage of Zheng Gu Tong Bi Pills obviously reduces. Ovary removal osteoporosis model: compared with the sham-operation group, the thigh bone density, bone mineral content, bending strength, max. bending capacity and break deflection of rats in ovary removal group obviously reduce; serum ALP, serum StraACP and OC rise obviously; blood Ca and P have no obvious change; the content of serum TNF— a and serum IL-6 rises obviously. Compared with the ovary removal group, the bone density and bone mineral content of each group of different dosage of Zheng Gu Tong Bi Pills increase obviously; The bone Ca, P, max. bending capacity, bending strength and break deflection of the group with 长春中医药大学2009届硕士学位论文 英文摘要 3 5.4g·kg－１ dosage of Zheng Gu Tong Bi Pills obviously increase. The dosage of Zheng Gu Tong Bi Pills dependently antagonizes the increase of serum StraACP and serum ALP caused by ovary removal, and the OC content of each dosage group reduces obviously; the dosage of each group with different dosage of Zheng Gu Tong Bi Pills can dependently reduces the content of TNF— a and IL-6 in rats. Conclusion: Zheng Gu Tong Bi Pills can effectively increase the bone density of the rats with the glucocorticoid induced and ovary removal induced osteoporosis, improve the biomechanical performance and strengthen the anti- fracture capacity, whose mechanism has relation with the inhibit of IL-6 and TNF— a expression, the inhibit of bone absorption, the promotion of bone formation, and the maintenance of bone turnover balance. Key words : osteoporosis; Zheng Gu Tong Bi Pills; bone density; bone metabolism; bone biomechanics; cell factor 长春中医药大学2009届硕士学位论文 前 言 5 前 言 骨质疏松是一种严重危害中老年人身体健康的临床常见多发病，该病的严重后果是 骨质量的下降，导致骨折的发生。绝经后骨质疏松症，因其发病缓慢，常被人们忽视， 故有人称之为无声无息的流行病，但它的后果严重，给人体带来驼背、骨折或致残及由 于血钙和细胞内钙含量增高，引起动脉硬化和高血压、结石症、老年性痴呆等老年病， 成为威胁中老年妇女健康的一个重要问题。长期或大剂量使用糖皮质激素后发生的骨质 疏松称为糖皮质激素性骨质疏松症，它是最常见的药物性骨质疏松，其发病率仅次于绝 经后及老年性骨质疏松而居第三位，长期使用糖皮质激素者可引起明显的骨量丢失，导 致骨折的发生增加，糖皮质激素对骨代谢影响受多种因素调节，可能通过影响钙离子的 代谢、内分泌系统、各种骨组织细胞功能及细胞因子活性等多方面的途径导致骨形成和 骨吸收失衡，进而骨量丢失。因此治疗骨质疏松的重点在于保护和提高骨质量。为能进 一步客观评价纯中药制剂正骨通痹丸的治疗作用，本实验运用切除大鼠卵巢和肌注地塞 米松建立骨质疏松病理模型，随后进行药物干预，观察正骨通痹丸对骨质疏松模型鼠骨 质量、骨力学及多项生化指标的影响，同时对其作用机理进行了探讨。 长春中医药大学2009届硕士学位论文 文献综述 6 文 献 综 述 骨质疏松实验研究现状及进展 骨质疏松症是老年人的常见病、多发病，是一种以骨量减少、骨组织微细结构破坏、 骨脆性增加和易发生骨折为特征的疾病，随着人类寿命的延长和老龄化社会的来临，该 病的防治越来越受到人们的重视。然而要研究其发病机理，研制各种治疗和预防疾病的 新药并保证试验药物的药效学和毒理学结果的正确性和可靠性，以及研究骨置换术治疗 骨质疏松性骨折，都需要通过动物实验来进行，所以实验动物的选择、模型的建立、观 察指标的选择是进行骨质疏松病因研究和药物研究的关键。本文就近年来骨质疏松实验 研究的动物模型、观察指标加以综述。 一、 骨质疏松实验模型动物的选择[1] 1.1 大鼠 大鼠是骨质疏松研究中最常用的模型动物。但因成年雄性大鼠在30个月时骨骺端仍 有持续生长，这种骨状态的不稳定性可能会干扰实验结果，因此，雄性大鼠不适合做各 种成人骨骼研究的模型。而雌性大鼠在6— 9个月时就进入骨生长静止期，骨骺开始封闭， 10个月达峰值骨量．出现一个骨代谢相对稳定的阶段，与人类相似，雌性大鼠广泛用于 骨质疏松研究中，但是大鼠作为骨质疏松的模型动物仍有其缺点，主要是因其骨缺乏脆 性而导致骨折及哈佛氏重建不明显而影响皮质骨的观察。 1.2 小鼠 小鼠是医学实验中用途最广泛和最常用的动物．然而能够验证小鼠作为骨质疏松研 究模型的数据目前并不多。沈薇[2]等研究发现小鼠去卵巢后，骨皮质变薄，骨髓腔扩大， 骨小梁稀疏或断裂，骨小梁宽度变窄，间距变宽，骨小梁占视野面积降低，表明骨质疏 松病理模型是成功的，但造模时间不宜太短，对Balb／c小鼠而言，作为绝经后骨质疏 松动物模型制作成功至少需10周以上的时间。因小鼠的基因易于控制，现成为研究峰值 骨量基因控制方面的有用动物。 1.3 狗 狗是用于研究废用性骨质疏松较为成功的模型动物。而不适用于骨代谢研究[3].在骨 代谢和方面，成年狗是与人类骨骼相似的可靠模型。但狗的卵巢和子宫切除不 会诱发明显的骨丢失，限制了雌性狗在骨质疏松研究中的应用。 长春中医药大学2009届硕士学位论文 文献综述 7 1.4 兔 兔是研究骨质疏松很有前途的模型动物。方忠、杨琴等[4]的研究表明，5月龄雌兔， 双侧卵巢切除6个月后，家兔的BMD明显降低，弯曲强度、比例载荷、最大挠度和弯曲 破坏载荷明显下降，骨质丢失明显增加，骨小梁形成明显减少，骨吸收明显升高。但因 兔的松质骨含量少，给骨计量学检测带来一定困难[5]。 1.5 羊 羊是一种有潜力的骨质疏松模型动物，成年羊具有自动排卵以及与成年妇女相似的 排卵周期，但没有自然绝经期。羊的一个明显缺点是其有与人类相异的胃肠道系统，为 反刍类动物，不适合于口服给药。目前以绵羊作为研究骨质疏松的动物模型不多，切除 双侧卵巢的雌性山羊是一种有效的研究绝经后骨质疏松的中等大小动物模型。 1.6 猪 猪曾被成功用于氟化物和运动对骨骼影响的研究。用猪作骨质疏松模型有明显的骨 骼生长期和成年期；骨骼能接受人工装置的植入；有层状骨，皮质骨重建和松质骨丢失 与沉积的发生率与人类相似，但其骨量重，骨小梁网比人致密，并且小型猪子宫的血管 容易破裂，因而其卵巢子宫切除术很困难[5]。 1.7 非人类灵长类 非人类灵长类与人类在进化树中最近。由于非人类灵长类的组织形态学结构与人类 极为相似．有学者认为把非人类灵长类与鼠类结合起来进行基因调控峰值骨量研究是最 佳的选择。而非人类灵长类动物饲养困难，费用昂贵，还有试验周期长等这些不利因素 限制了其应用。 1.8 其它动物 有研究者采用鸟、豚鼠、白鼬、猫等作为骨质疏松的模型动物。由于这类动物骨骼 行为不能很好地模拟成年人的骨质疏松变化特征，与人类骨质疏松相关性较小，因此对 这类动物的研究资料较少[5]。 动物模型在各个方面完全与人类骨质疏松症的临床表现一致是很困难的，因此动物 模型根据研究的不同，侧重表现其某一阶段、某些症状或一些病理生理变化，作为观察 特定阶段和指征的病理模型是较为可行的方法。研究者应知道每一种动物模型的优点和 限制，才能更好地设计和进行动物实验，得到可靠地研究数据，准确评价实验的结果[6]。 二、骨质疏松实验动物模型 1 切除双侧卵巢（去势）造成骨质疏松 长春中医药大学2009届硕士学位论文 文献综述 8 去卵巢动物模型应用最广泛，雌性动物在卵巢切除后，造成动物雌激素分泌不足， 达到模拟绝经后状态，其松质骨的变化和给予雌激素替代治疗后的反应与人类相似，可 造成典型类似临床绝经后高转化型骨质疏松动物模型，可广泛用于骨质疏松症病因、发 病及防治研究。 1.1 切除双侧卵巢实验模型的建立： 雌性动物，麻醉后，在下腹部正中部位除毛，然后消毒，用医用剪刀横切口，分别 切开皮肤、浅筋膜和深筋膜，到达肌肉层，剥开肌肉寻找输卵管，沿输卵管在其末端找 到卵巢，用丝线在输卵管峡部结扎，用剪刀剪去卵巢，之后缝合肌肉、深浅筋膜，最后 缝合皮肤，包扎伤口。术后动物饲养于温度20－25 ℃ 、相对湿度40一70％的达标动物 房内，饲以常规饲料，自由饮水[7] [8]。 1.2 去势动物骨缺损及骨折修复实验模型建立 1.2.1 去势大鼠颅骨缺损[9] 经大鼠双侧腰背部侧切口进入腹腔切除双侧卵巢(经组织学证实)，60 d后行颅顶纵 切口，显露颅骨并剥除部分骨膜，流水降温下用牙科钻制备一直径8 mm全层骨缺损， 生理盐水冲洗后植入自体骨，并关闭伤口。 1.2.2 去势大鼠拔牙创骨 大鼠双侧卵巢,术后8周对所有大鼠行左侧上颌第一磨牙拔除术，观察骨质疏松对拔 牙创口愈合期骨形成的影响[10]。 去势组大鼠全麻下摘除双侧卵巢，饲养8周后，在全麻下采用自制的开口器及牙挺 拔除所有大鼠左侧上颌磨牙[11] [12]。 1.2.3 骨质疏松骨折[13] [14] 双侧卵巢切除手术。饲养后８－12周，再手术截断大鼠右侧股骨中下段，髓内针内 固定，建立骨质疏松骨折愈合模型。 1.2.4 下颌骨骨折[15] 摘除双侧卵巢骨质疏松建模成功后，全麻下于双侧下颌骨角前切迹处，用薄金刚砂 片作頬舌侧骨皮质纵向切开，形成一0.3cm宽2cm深的骨折线，骨折线两端0.5cm处用裂 钻打孔，钢丝结扎。 2 糖皮质激素性骨质疏松 糖皮质激素可引起药源性骨质疏松症，激素性骨质疏松是一个骨吸收大于骨形成的 过程，这个过程涉及到了激素对很多因素的影响。研究表明，糖皮质激素长期大剂量应 长春中医药大学2009届硕士学位论文 文献综述 9 用可引起大鼠负重骨的骨质明显丢失，同时使松质骨结构发生明显变化，呈现骨质疏松 状态。糖皮质激素长期使用可造成骨质成分比例不协调，导致骨的脆性增高而韧性下降， 可引起体内脂质代谢紊乱，造成骨髓脂肪细胞增多，引起骨髓腔内压增高而使血流减慢， 从而影响了骨内血供而抑制骨代谢[7]。 模型的建立（1）泼尼松按1、3、9 mg·kg－１ 灌胃，每日1次，连续12 周[16]。 (2) 甲泼尼龙3．5 mg·kg－１·d－１，皮下注射，每日1次，干预9周,引起大鼠骨质疏松的发生[17]。 （3）每周2次在大鼠大腿内侧肌肉注射地塞米松1mg·kg－１，5周后建立骨质疏松模型[18]。 3 维甲酸诱导大鼠骨质疏松[19] 维甲酸灌胃制作骨质疏松模型的主要特点是维甲酸损伤大鼠卵巢，从而使雌激素分 泌减少，当雌激素对破骨细胞抑制作用减弱后，破骨细胞活性增强。另一方面，维甲酸 可影响骺板软骨的软骨内成骨，使软骨代谢障碍。维甲酸方法模型时间短，在国内相关 研究中被普遍采用。该模型在发病症状、组织形态表现以及对雌激素的骨反应上与人类 骨质疏松有较大的相似性；通常维甲酸诱导的大鼠骨质疏松模型近期效果典型。 模型建立：(1)维甲酸(70mg·kg－１·d－１)每天上午8：00左右按维甲酸混悬液lmL·100g－ １比例灌胃给予维甲酸，连续给大鼠灌胃14天。(2)昆明种小鼠，每天上午灌胃维甲酸(105 mg．kg－１ )，连续15 天[20]。 4 脊髓损伤致骨质疏松[21] 脊髓损伤早期，破骨细胞活性增强，成骨细胞活性降低，导致骨吸收增强，骨形成 减弱。损伤平面上下骨质均受累，但不同部位的骨骼继发骨质疏松的程度不同，骨质疏 松后骨细胞亏微结构改变显著。脊髓损伤可导致骨胶原含量减少，为骨矿化提供框架的 机械支持能力降低，使钙盐等无机质无法沉积矿化，致骨量丢失和骨生物力学强度降低， 最终导致骨质疏松，骨质疏松使骨的力学强度降低，骨脆性增加，骨质疏松骨折的危险 性亦增加 模型建立：(1)大鼠于Ｔ１０椎体水平切除椎板，行Ａllen’s法损伤脊髓。(2)大鼠以咬 骨钳将其椎板咬开，不破坏硬膜和脊髓人为造成脊髓损伤后继续饮食饲养，复制骨 质疏松模型[22]。 5 废用性骨质疏松 废用性骨质疏松属继发性骨质疏松，是由于肌肉不活动和负重减少引起的骨量丢 失，依原因和环境因素不同可影响整个或部分骨骼系统[23]。 模型建立：兔适应饲养l周后，随机石膏固定兔的右后肢作为实验侧，左侧后肢作为 长春中医药大学2009届硕士学位论文 文献综述 10 自身对照侧，使用聚氨酯石膏绷带(韩国友三牌，Woosan)缠2— 3层，至髋关节并保持膝 关节和踝关节于伸直位，然后继续放养，自由活动。每两周更换石膏，避免石膏松动和 肢体压疮。将实验动物一侧后肢用石膏管型固定并缚于躯干上，负重减少。而且由于该 肢体用石膏管型固定后无法活动，肌肉就不能产生有效的生理性收缩，相应的骨在生理 上最主要的应力刺激就会明显减少，骨所处的生物力学环境就发生了变化。根据Wolff 定律，骨量就要相应的进行调整，其生物力学性质就要发生变化[24]。 日本研究人员通过动物实验发现，如果骨细胞遭到破坏，实验鼠就容易患上骨质疏 松症。人类和动物体内都存在分解骨质的破骨细胞和形成骨骼的成骨细胞，正常情况下 两种细胞的作用保持着平衡。一旦破骨细胞占了上风，骨细胞的形成就会受到影响。骨 质疏松症就会找上门来[25]。 三、 骨质疏松实验观察指标 1 骨生物力学指标 骨生物力学基本特性的综合表现特性就是应力和应变的关系。在外力的作用下，骨 的应变是随应力变化而改变的。它们的关系可分为两个阶段：弹性阶段和塑性阶段。在 弹性阶段，应力-应变曲线的斜率称为弹性模量，用来测量骨组织的内硬度[24]。 骨生物力学指标的检测包括骨长度、直径和厚度的测定，骨弹性极限载荷、断裂载 荷和刚度测量，长骨抗弯力、最大挠度、扭力矩、抗扭转强度极限及线应变参数等。生 物力学指标能反映骨骼的物理特征和结构变化，能从各个不同方面定量的反映动物的骨 质疏松是否出现、程度如何。但这些方法均有一定的局限性，需要对多种指标进行综合 分析，才能得到关于骨质疏松情况的全面判断。 2 骨组织形态学及骨量变化 骨量的变化是衡量骨质疏松程度的重要指标，可以通过单光子或双光子骨密度仪、 双能X线骨密度仪，定量CT等仪器对动物全身或局部进行骨密度检测来获得．也可以通 过X光片上骨皮质骨厚度和骨小梁密度来粗略估算骨量变化[1]。 近年来随着扫描和显像仪器的快速发展，对骨量和骨结构测定的方法也不断更新。 邹丽宜等[17] 采用半自动图像数字化分析仪对大鼠胫骨上段不脱钙骨切片测定并计算出 骨的静态参数，以观察骨量和骨结构的变化及了解其可能原因。其中有主要反映骨量的 指标骨小梁面积百分数(％TbAr)、骨小梁数量(Tb．N)、骨小梁厚度(Tb．Th)和骨小梁分 离度(Tb．Sp)，和主要反映破骨细胞活性的指标单位骨组织破骨细胞的个数(Oc．N／BV) 和吸收周长百分数(％OC．Pm)，其值越大，则破骨细胞越活跃。同时测量骨小梁荧光 长春中医药大学2009届硕士学位论文 文献综述 11 周长百分率(％L．Pm)、矿化沉积率(MAR)、骨形成率(BFR／BS、BFR／BV和BFR／TV) 等骨动态参数，以了解骨表面矿化的量和速率，并解释静态参数变化的可能原因。吴子 祥[26]等用MicroCT扫描与重建分析骨小梁三维微观结构，并采集骨小梁的空间结构参 数。 PET-CT是将PET提供的组织细胞代谢显像及在大分子、蛋白质、核酸基础上进行的 分子影像和CT提供的反映组织解剖结构、血流灌注的显像有机地结合在一起的最先进的 影像设备。F-NaF是PET— CT研究中有用的显像剂，F-F在骨骼中的摄取程度与骨骼的代 谢活性有关。 F— F随血流迅速扩散到骨细胞间隙，在成骨细胞活动活跃的区域，F与骨 组织有亲和力，因此F-F被大量的摄取，而且骨骼的摄取与骨血流和成骨细胞的活性成 比例，PET— CT显像可用以判断成骨细胞的改变[7]。 3 反映骨质疏松的生化指标 骨转换的生化指标分为骨形成指标和骨吸收指标两大类，这些指标无论是对于代谢 性骨病的病生理学．还是其治疗的选择及疗效的监测都很重要。 3.1 骨形成指标[27] 3.1.1 血清总碱性磷酸酶和骨碱性磷酸酶 总碱性磷酸酶是最常用的、经典的用以评价骨形成和骨转换的指标，但对骨组织而 言缺乏特异性和敏感性。为了鉴别肝胆疾病与成骨细胞活性增高的骨病，最好做碱性磷 酸酶同工酶测定。当ALT正常时，血清总碱性磷酸酶也能反映成骨细胞的功能。骨碱性 磷酸酶是总碱性磷酸酶的同工酶，骨碱性磷酸酶的定量测定与动态观察是反映成骨细胞 活性和骨形成的特异及敏感的指标。 3.1.2 骨钙素和未羧基化骨钙素 血清骨钙素亦称作依赖维生素K的骨?－羧基谷氨酸蛋白，是骨中含量十分丰富的非 胶原蛋白，大部分沉积于骨组织细胞外基质，部分进入血液循环。因此，血液中血清骨 钙素含量源于成骨细胞新合成的蛋白质。血清骨钙素的主要生理功能是维持骨的正常矿 化速率，抑制异常的羟基磷灰石结晶的形成，抑制软骨矿化速率，参与骨转换调节，是 反映成骨细胞活性和骨代谢状态的敏感而特异的指标。 未羧基化骨钙素水平是反映机体维生素K营养状态的敏感指标，也与骨转换，骨密 度和髋部骨折有关，未羧基化骨钙素可作为预测髋部骨折危险性的生化指标。 3.1.3 血I型胶原羧基前肽 血I型胶原羧基前肽又称血I型前胶原延长肽，测定1型胶原分子N一端前肽和C一端 长春中医药大学2009届硕士学位论文 文献综述 12 前肽可反映1型胶原的合成状况和骨转换情况，进入血循环的I型胶原分子N一端和C一端 前肽由肝脏分解代谢，所以易受ALT的影响。在某些骨代谢性疾病中，I型胶原分子N－ 端前肽作为检测指标比Ｃ一端前肽敏感。 3.1.4 护骨素 护骨素为肿瘤坏死因子受体的超家族成员，又称破骨细胞形成抑制因子，成骨细胞 分泌护骨素通过旁分泌作用对破骨细胞的形成和活性进行调节，抑制前体破骨细胞分化 和成熟，并诱导破骨细胞捌亡，拮抗促骨吸收因子引起的骨吸收，血清护骨素水平反映 高骨转换状态。雌激素可刺激护骨素的产生，绝经后妇女早期骨量丢失的主要原因是雌 激素缺乏导致护骨素下降，骨吸收增加最终导致骨质疏松。 3.1.5骨涎蛋白 骨涎蛋白是由成骨细胞分泌的一种非胶原蛋白，约占骨细胞外基质非胶原蛋白的5 ％～10％ 。骨涎蛋白的作用是刺激羟磷灰石的合成和促进破骨细胞介导的骨吸收过程。 3.1.6 骨连结蛋白 骨连结蛋白是一种磷酸化糖蛋白，约占骨非胶原蛋白的25％ ，除骨以外，在基质 膜内皮细胞里也有分布，但在骨组织中浓度高于其他组织, 骨连结蛋白与I型胶原形成非 可溶性复合物，诱导钙磷沉淀，与羟磷灰石有较强的亲和性，与类骨质的形成有关，可 作为骨发生的标志。 3.2 骨吸收指标[27] 3.2.1 羟脯氨酸 羟脯氨酸(HOP)是骨胶原中的特殊成分，在骨胶原中含量比较稳定，约占12．5％。 因此根据骨HOP的含量可推算出骨有机质的相对含量，故HOP含量减少是骨中有机质减 少的标志[17]。尿HOP的排泄反映机体的胶原代谢状况，是一项常用的骨吸收指标。但由 于其是多种胶原的降解产物，既不敏感也不特异，已逐步被更多特异性的标志物所替代。 HOP只对骨吸收严重的疾病如甲状旁腺功能亢进症、Paget骨病等或骨转换很快的儿童生 长期，才是一项有用的标志物，对于骨更新率低的原发性骨质疏松症则缺乏敏感性。 3.2.2 骨I型胶原降解产物 在骨的有机质中，90％以上为骨I型胶原。骨吸收增加时，释放至血液或排泌到尿 中的骨I型胶原降解产物增加。已逐步应用于临床评价骨吸收的骨I1型胶原降解产物有羟 赖氨酸糖苷、吡啶啉和脱氧吡啶啉、骨I型胶原分子C-末端交联顶端肽、I型胶原分子N- 末端交联顶端肽等。 3.2.3 I型胶原分子a１链螺旋区肽 长春中医药大学2009届硕士学位论文 文献综述 13 该肽由破骨细胞骨吸收时降解I型胶原产生，是骨I型胶原的特异性降解产物，反映 破骨细胞活性。 3.2.4 血清或血浆抗酒石酸酸性磷酸酶 血清抗酒石酸酸性磷酸酶主要来源于破骨细胞，正常人血清中存在抗酒石酸酸性磷 酸酶同工酶5a与抗酒石酸酸性磷酸酶同工酶5b，第2代骨吸收生化标志物血清抗酒石酸 酸性磷酸酶同工酶5b是目前鉴别快速骨量丢失、诊断骨质疏松的可靠指标，同时也是一 项较好的抗骨吸收治疗的监测指标。 4 骨代谢调节激素 许多激素和细胞影响骨的重建过程，通过促进或抑制破骨细胞的发育及提高或抑制 其活性，对骨转换起加速或阻滞作用。这些指标对骨转换有明显作用，但对于成骨或破 骨作用的直接效果则受多种因素影响。这类常用指标如甲状旁腺激素、降钙素、雌激素、 1，25一二羟维生素D 、甲状腺素、肾上腺皮质激素、前列腺素等都属全身性骨代谢调 节激素[27]。 5 细胞因子 许多实验研究表明，一些细胞因子与骨质疏松有着密切的关系，如转化生长因子、 胰岛素样生长因子、血小板衍化生长因子、成纤维细胞生长因子、骨形态蛋白、成骨生 长肽等，以及一些与骨吸收有关的因子如白介素一1、白介素一2、白介素－4、白介素 －6、白介素－11、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、骨桥蛋白、前列腺素等，这些都构 成观察骨代谢间接实验指标，对大鼠的骨代谢有一定的影响[28]。近年来的研究发现，遗 传因素对获得骨量和骨强度起着重要的作用。 6 蛋白和受体 王松等[13]研究发现在骨组织中，CD44主要在骨细胞和破骨细胞中表达，介导细胞 与细胞外基质问的相互作用。在骨痂组织中，FN可能与CD44结合调节软骨细胞的分化 而不仅仅是与整合素受体结合，CD44与FN结合，通过细胞骨架传导细胞信号，参与调 节细胞的分化。在骨折愈合过程中，骨痂软骨细胞表达CD44、FN，CD44可能通过与FN 结合调节骨痂软骨细胞的分化成熟。 张磊等[29] 研究骨质疏松与晚期糖基化终末产物(AGEs)及其受体(RAGE)是否相关， 结果表明，糖尿病大鼠血清AGEs明显升高，骨密度则明显降低，胫骨及股骨骨皮质菲 薄，部分吸收，骨髓腔增宽，松质骨骨纹理稀疏、变细。糖尿病大鼠骨组织RAGE蛋白 表达强烈且广泛，染色深，RT-PCR显示骨组织中RAGE的表达上调。 郑洪新等研究发现，去卵巢所致肾虚骨质疏松症大鼠模型呈现小肠黏膜CaBP— D9k mRNA、CaBP— D28k mRNA表达水平明显下降，CaBP— D28k 的蛋白表达亦有同样趋势 [30]。 长春中医药大学2009届硕士学位论文 文献综述 14 BMPs是惟一能够单独诱导骨组织形成的局部生长因子。在生理条件下，BMP主要 是由成骨细胞表达和分泌，能诱导间充质干细胞向成骨细胞和软骨细胞方向转化，刺激 成骨细胞和骨髓间充质细胞内ALP的表达[31]。 许多影响骨质疏松的因素对铁调素（Hepcidin）的生成都有显著的调节作用，骨代 谢变化过程中确实存在着相应的铁调素蛋白表达变化[32]，Hepcidin有可能是作为骨质疏 松形成的一个参与因素，对骨质疏松的形成和发展起着调节的作用。目前的研究表明至 少有两种明确的信号转导机制参与Hepcidin的合成调节：HJv参与的BMP／SMAD信号转 导以及IL-6／STAT 3信号转导机制[31]。 贾少杰等采用免疫组化和原位杂交的方法，从细胞、mRNA和蛋白质水平探讨雌 激素的OPG保护作用机制。发现雌性小鼠切除卵巢后会引起其OPG／RANKL／ApoE改 变；雌性去卵巢小鼠应用雌激素替代后能减少其OPG／RANKI／ApoE的表达。另外对 载脂蛋白E(ApoE)基因进行了研究[33]。 简小冲等[34]研究辛伐他汀对去卵巢(OVX)骨质疏松大鼠骨形成蛋白BMP一2及其信 号转导蛋白Smadl／5表达的调节，探讨BMP一2及其信号转导蛋白Smadl／5在骨质疏松 发病机制中的作用机制及辛伐他汀对其调节作用。结果显示BMP一2及信号转导蛋白 Smadl／5表达水平的下调，这可能是原发性骨质疏松发生的重要机制，辛伐他汀能上调 BMP一2的表达，长期用药能促进信号转导蛋白Smads1／5的表达。 郭松等[35]研究转化生长因子(TGF— ß)和信号调节激酶(ERK)在去卵巢大鼠骨组织 中的表达及意义，发现TGF一ß蛋白阳性表达主要在成骨细胞的胞膜上和胞浆内，ERK 主要在成骨细胞核内，说明TGF一ß和ERK可能在绝经后骨质疏松症中起重要调节作用。 7 脂肪、抗氧化 李明等[36]探讨去卵巢大鼠血清中活性氧及抗氧化体系的变化，发现抑制OH 能力、 SOD、GSH-Px水平降低，推论血清中活性氧及抗氧化成分羟自由基、SOD．MDA及 GSH-Px等可能参与了绝经后骨质疏松的病理进程。 李冬菊等[37]探讨不同月龄、去卵巢对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向脂肪细胞分化 能力的影响。研究结果表明，年老组和去卵巢骨质疏松大鼠(MSCs)向脂肪细胞分化能力 皆增强。 总之，骨质疏松的动物实验现今进入一个新的阶段，借助分子生物技术平台，可以 更深层次地研究骨质疏松的病理机制。随着新技术的发展和骨质疏松研究的不断深入， 尤其是细胞因子和基因技术的介入，相信骨质疏松动物实验研究将会越来越完善。 长春中医药大学2009届硕士学位论文 实验研究 15 实 验 研 究 正骨通痹丸抗骨质疏松的药理作用及机理研究 一、实验材料 1 实验动物 8～10周龄Wistar大鼠，体重 180～220g（糖皮质激素致大鼠骨质疏松模型），220～ 240（双侧去卵巢致大鼠骨质疏松模型），由沈阳药科大学动物实验中心提供，许可证号： SCXK (辽) 2003-008。 2 实验药物 正骨通痹丸(ZW)，由大连中医骨伤科研究所提供；地塞米松磷酸钠注射液(DXM), 郑州羚锐制药有限公司,批号 0705161；仙灵骨葆胶囊(XLGB)，贵州同济堂制药有限公 司,批号 070753；17-ß-雌二醇(E2)，SIGMA公司，批号 052K1510。 二、实验方法 1 糖皮质激素致大鼠骨质疏松模型 将 48 只 Wistar 大鼠按体重均衡随机分为 6 组:正常对照组、模型组、正骨通痹丸 1.35、2.7、5.4g·kg－１ 剂量组及仙灵骨葆胶囊组，每组 8 只。除正常对照组肌注生理盐 水外，其余各组均肌注地塞米松 2.5mg·kg－１每周两次，共 8周。8周后，正常对照组及 模型组灌胃连续给予蒸馏水 10ml·kg－１，正骨通痹丸各剂量组及仙灵骨葆胶囊组分别连 续给予正骨通痹丸 1.35、2.7、 5.4 g·kg－１及仙灵骨葆胶囊 0.4g·kg－１。给药 12周后，用 3.5%的水合氯醛溶液 10ml·kg－１腹腔注射麻醉，由腹主动脉取血并剥离后肢股骨，测骨 密度及骨含量（由中国医科大学协助测定）及最大弯曲力、抗弯强度、断裂绕度等生物 力学指标（由东北大学力学测量中心协助测定）。血样静置后离心,分离血清,冻存于-80℃ 冰箱待用。实验结束前两天，将实验大鼠放入代谢笼中，收取尿液。血钙、血磷及血碱 性磷酸酶的含量的测定由东北电力医院检验科完成。使用南京建成生物有限公司试剂盒 对尿羟脯氨酸含量和血清抗酒石酸酸性磷酸酶的活性进行测定。 2 双侧去卵巢（OVX）致大鼠骨质疏松模型 将 80只雌性Wistar大鼠按体重均衡随机分为 8组:正常对照组、假手术组、模型组、 正骨通痹丸 1.35、2.7、5.4g·kg－１ 剂量组、仙灵骨葆胶囊组及雌二醇组，每组 10只。 除空白对照组外，其余各组大鼠在 3.5%的水合氯醛溶液 10ml·kg－１腹腔注射麻醉下，背 长春中医药大学2009届硕士学位论文 实验研究 16 部肋下切开皮肤、肌肉，暴露腹腔，找出双侧卵巢，除假手术组外其余各组均切除双侧 卵巢，假手术对照组开腹腔后在靠近卵巢处切除一小块与卵巢大小相似的脂肪，缝合。 手术 15周后，正常对照组、假手术组及模型组连续灌胃给予蒸馏水 10ml·kg－１，正骨通 痹丸各剂量组、仙灵骨葆胶囊组及雌二醇组分别连续灌胃给予正骨通痹丸 1.35、2.7、5.4 g·kg－１、仙灵骨葆胶囊 0.4g·kg－１ 及雌二醇 60µg·kg－１。给药 11 周后，用 3.5%的水合 氯醛溶液 10ml·kg－１腹腔注射麻醉，由腹主动脉取血，分离子宫并称重，剥离后肢股骨， 测骨密度及骨含量（由中国医科大学附属盛京医院康复科协助测定）及最大弯曲力、抗 弯强度、断裂绕度等生物力学指标（由东北大学力学测量中心测定）。血样静置后离心, 分离出血清,冻存于-80℃冰箱待用。血钙、血磷及血碱性磷酸酶的含量由中国医科大学 附属盛京医院检验科完成。使用南京建成生物有限公司试剂盒对血清抗酒石酸酸性磷酸 酶的含量进行测定。采用 RapidBio Lab.的 ELISA试剂盒对白介素-6、肿瘤坏死因子-a 及骨钙素的测定。 3 统计学处理 各组实验数据用均数加减标准差表示。组间数据显著性差异用 SPSS统计软件进行 单因素方差分析 t-检验。 三、结果 1 糖皮质激素致大鼠骨质疏松模型 1.1 正骨通痹丸对大鼠股骨骨密度和骨矿含量的影响 模型组大鼠股骨的骨密度与正常对照组相比显著降低（P<0.001﹚，骨矿含量(BMC) 显著下降（P<0.005）,说明地塞米松致大鼠骨质疏松模型建立成功。正骨通痹丸 5.4g·kg －１组及仙灵骨葆胶囊胶囊组与模型组相比，股骨骨密度显著升高（P<0.05） (表 1)。 表 1 正骨通痹丸对地塞米松大鼠骨密度(BMD)和骨矿含量(BMC)的作用 (X ±SD) 组别 剂量(g·kg－１) BMD(g·cm－2) BMC(g) 对照 ---- 0.1278±0.0061 0.4464±0.0724 模型 ---- 0.1072±0.0044*** 0.3138±0.0247** 正骨通痹丸 5.4 0.1160±0.0029＃ 0.3533±0.0167 2.7 0.1128±0.0084 0.3496±0.0553 1.35 0.1109±0.0056 0.3356±0.0355 仙灵骨葆 0.4 0.1138±0.0051＃ 0.3543±0.0305＃ 注：**P<0.005,***P<0.001 vs 对照;＃P<0.05 vs 模型 长春中医药大学2009届硕士学位论文 实验研究 17 1.2 正骨通痹丸对大鼠股骨湿重、干重及灰重的影响 与正常对照组相比，模型组大鼠股骨的湿重、干重及灰重显著下降（P<0.001， P<0.05）。与模型组相比，正骨通痹丸 5.4g·kg－１剂量组大鼠股骨的湿重显著升高（P<0.05） (表 2)。 表 2 正骨通痹丸对地塞米松大鼠骨重量的影响( X ±SD) 组别 剂量 (g·kg－１) 湿重 (g) 干重 (g) 灰重 (g) 对照 ----- 2.109±0.2799 1.346±0.1560 0.8990±0.1324 模型 ----- 1.657±0.1253*** 1.125±0.1588* 0.7248±0.1237* 正骨通痹丸 5.4 1.865±0.1875# 1.193±0.1345 0.8254±0.1479 2.7 1.730±0.2265 1.129±0.1341 0.7896±0.09122 1.35 1.737±0.1124 1.071±0.1015 0.7945±0.1267 仙灵骨葆 0.4 1.721±0.1053 1.095±0.04588 0.8026±0.06574 注：***P<0.001, *P<0.05 vs. 对照 ；#P<0.05 vs. 模型 1.3 正骨通痹丸对大鼠股骨骨钙及骨磷的影响 与正常对照组相比，模型组大鼠股骨的骨钙及骨磷含量显著降低。与模型组相比， 正骨通痹丸 2.7g·kg－１组及仙灵骨葆胶囊组股骨骨钙含量显著上升（P﹤0.05），正骨通痹 丸剂量依赖性地对抗地塞米松所致的股骨骨磷含量的降低(表 3)。 表 3 正骨通痹丸对地塞米松大鼠骨钙和骨磷的影响( X ±SD) 组别 剂量(g·kg－１) 股骨 Ca (%) 股骨 P (%) 对照 ---- 8.7853±2.4845 2.8111±0.3703 模型 ---- 6.5908±1.1734* 2.1394±0.3097*** 正骨通痹丸 5.4 8.3434±2.0486 3.1796±1.0998# 2.7 8.2630±1.4668# 3.0334±0.6614# 1.35 7.6749±1.7539 2.7665±0.3007## 仙灵骨葆 0.4 8.4777±1.5942# 2.6925±0.4269# 注：*P<0.05, ***P<0.001 vs 对照; #P<0.05， ##P<0.005 vs 模