麦成熟胚愈伤组织形成、分化的影响

技术进行小麦遗传改良，增强小麦抗病虫和耐逆境能力，提高产量，改善品质，是小麦遗传育种的一个 新的方向。本研究以27份优良普通小麦(TriticumaestivumL.)主栽品种或高代育种品系，以及4份二倍体和四倍体小麦为试材，进行成熟胚愈伤组织诱导 及分化再生的培养，比较其诱导及分化再生能力，研究影响愈伤组织形成及分化再生的因素(基因型、诱愈方式、2,4-D、ABA及KT浓度等)，筛选小麦成 熟胚愈伤组织诱导及分化再生能力强的基因型，建立小麦成熟胚植株再生体系。对筛选出来的适合小麦成熟胚组织培养的基因型，利用建立的成熟胚植 株再生体系，采用农杆菌(GV3101/pBI121：：gus)介导对小麦成熟胚及愈伤组织进行遗传转化，并对影响遗传转化效率的因素(转化受体的基因型、负压 处理、侵染菌液的浓度、外植体预培养时间、侵染时间等)进行研究，确定选择剂的选择压力。同时，对以本实验室选育的小麦优良品系山农995604的胚 性愈伤组织为材料，采用农杆菌介导将抗虫基因豇豆胰蛋白酶抑制剂基因CpTI转入小麦培养细胞，经筛选获得的抗卡那霉素再生植株，进行PCR和实时 PCR以及PCR-Southern和Southernblot检测，并进行转化植株后代的CpTI基因遗传分析和抗虫鉴定。获得以下主要结果： 1.小麦的基因型、成熟胚 愈伤组织诱导方式、诱愈时的温度、光照、诱愈培养基2,4-D和ABA浓度及分化培养基KT浓度等，是影响小麦成熟胚愈伤组织形成和分化再生的重要因素 。应用剥胚法(embryo-isolatedmethod，EI)和整粒法(endosperm-supportedmethod，ES)诱导成熟胚愈伤组织，并分别进行分化再生培养，在31份小麦 品种(系)中筛选出了愈伤组织诱导率高、质量好、分化再生能力强、成苗率高的12个基因型，确定了每一基因型的最佳诱愈和分化再生途径，30～35d即 可获得大量再生植株。适合于剥胚诱愈的有TS021(分化培养基为MSF5)、HB188(MSF5)、SN2618(MSF5)、HB215(MSF5)、Yumai54(MSF5)、T9817(MSF5)、 T.dicoccum(MSF5)和SN03J102(MSF9)；适合于整粒法的有4072(MSF1)、TS021(MSF3)、Yannong19(MSF3)、HB341(MSF3)、Jinghua1(MSF5)。在此基础上建 立了较为优化和快捷的小麦成熟胚愈伤组织诱导及分化再生体系，为小麦遗传转化的成功奠定了基础。 2.接种茵液浓度及侵染时间、外植体预培 养时间、负压处理、转化受体的基因型等因素，对小麦成熟胚遗传转化有较大影响。不同基因型的转化受体，对相同农杆菌菌株有不同的敏感性；在进 行接种侵染时，同时实施适当的负压处理有助于提高转化效率；以整粒切割的成熟胚为受体的转化，效率明显高于以成熟胚愈伤组织为受体的遗传转化 ；确定了最佳接种菌液浓度及侵染时间和选择剂的选择压力；在短时间(30～35d)内即可获得转化苗，最高转化率可达12.5％。以上研究结果，证明了以 成熟胚为外植体源进行小麦遗传转化的可行性和有效性，并初步建立了较为优化的农杆菌介导的小麦成熟胚遗传转化体系。 3.采用农杆菌介导法 获得的3株独立的抗卡那霉素再生植株经过分子检测，为转CpTI基因小麦植株，CpTI基因以单拷贝形式插入到这些转化小麦基因组的不同位点。3株转基 因小麦正常可育，形成转基因株系。CpTI基因在转基因小麦T1代中的分离呈多样性，在转基因株系T-Ⅰ、T-Ⅲ中CpTI基因按照孟德尔3：1分离比进行遗 传；而在转基因株系T-Ⅱ中，CpTI基因的遗传不符合孟德尔规律。抗虫试验表明，3个转基因株系对储粮害虫麦蛾的抗性有很大提高。转基因株系T-Ⅰ、 T-Ⅱ、T-Ⅲ的T1代PCR阳性植株所结实的T2代籽粒及阴性对照非转基因植株籽粒，虫蛀率分别为19.77％、21.86％、32.87％和58.27％，每一株系与对照 相比都具有极显著性差异，麦蛾虫蛀率分别下降了66.07％、62.48％、43.59％。转基因小麦抗麦蛾能力的增强，极大程度上是由于CpTI基因导入到小麦 基因组中的缘故，而非来源于组织培养效应。外源目的基因CpTI基因及有关DNA片段的导入并没有增加转化小麦植株对蚜虫的抵御能力。本研究获得的转 抗虫基因小麦株系可进一步用于小麦抗虫新品系的选育，为小麦遗传改良提供了新的抗虫种质材料。伴随着转基因小麦的产生，形成了一些农艺性状发 生变化的体细胞无性系变异株系，为小麦育种提供了新的种质资源。 3.期刊论文 陶丽莉.殷桂香.叶兴国.TAO Li-li.YIN Gui-xiang.YE Xing-guo 小麦成熟胚组织培养及遗传转化研究 进展 -麦类作物学报2008,28(4) 小麦成熟胚转化体系的建立对促进小麦基因工程研究和功能基因组研究具有重要意义.小麦成熟胚具有取材方便、不受季节限制等优点,已成功应用 于小麦组织培养及遗传转化研究,可望取代幼胚成为小麦遗传转化的方便受体.本文就目前小麦成熟胚组织培养及遗传转化研究进行了综述,目的是为进一 步建立和完善小麦成熟胚再生体系和转化体系提供参考.目前国内外采用较多的小麦成熟胚培养方式主要有完整成熟胚培养、胚乳支撑成熟胚培养、成熟 胚刮碎培养和成熟胚切割培养等.对培养基中激素种类、浓度配比的优化也进行了较多研究,并取得了一定结果.利用基因枪轰击法和农杆菌介导法转化小 麦成熟胚均成功获得了转基因植株,证明小麦成熟胚及其愈伤组织作为受体进行遗传转化研究具有可行性. 4.学位论文 陈立国 农杆菌介导小麦成熟胚遗传转化体系建立和遗传转化研究 2007 小麦是重要的粮食作物，利用农杆菌介导遗传转化技术转化小麦是进行小麦遗传改良的重要途径。本研究以27份优良普通小麦fTriticumaestivum L.)品种．(系)为试材，进行成熟胚愈伤组织诱导及分化再生培养，研究了愈伤组织形成及分化再生的影响因素对小麦成熟胚愈伤组织诱导及分化再生能 力的作用；利用筛选出来的农艺性状优良、适合小麦成熟胚培养的小麦品系山农2618进行了成熟胚遗传转化试验，对农杆菌介导外源基因转化成熟胚愈 伤组织的条件进行了研究。获得以下主要结果： 1．通过对27个不同基因型小麦材料进行成熟胚愈伤组织诱导及分化再生试验，明确了小麦的基因 型、成熟胚愈伤诱愈培养基2,4．D和NAA浓度是影响小麦成熟胚愈伤组织形成和分化再生的重要因素，确定了最佳诱愈的2,4-D和NAA浓度分别为2.0 mg 1<'-1>和0.5 mg 1<'-1>。筛选出12个适合小麦成熟胚培养和植株再生的基因型材料，建立了小麦成熟胚愈伤组织诱导及分化再生体系，为小麦成熟胚遗 传转化研究奠定了基础。 2.以普通小麦品系山农2618为材料，对影响农杆菌介导小麦成熟胚愈伤组织遗传转化效率的因素(侵染菌液的浓度、侵染 时间、超声波处理、真空处理等)进行了试验，初步建立了农杆菌介导的小麦成熟胚遗传转化体系。结果表明：菌液浓度和侵染时间对愈伤组织的存活和 转化效果具有明显影响，在菌液浓度为OD600=0.8，侵染时间为60min时，抗性愈伤的获得率最高，达到4.21％；在农杆菌侵染过程中，运用超声波或真 空辅助处理可以提高转化效率，二者存在明显的互作效应，进行7.5min超声波处理后再进行7.5min真空处理可以使抗性愈伤由对照的3.09％提高到 8.16％。上述研究结果对于进一步开展以小麦成熟胚为外植体源的遗传转化研究具有参考意义。 3．利用建立的小麦成熟胚遗传转化体系将 BG<,2>基因转入小麦品系山农2618，获得了转基因植株。对转基因小麦进行分子检测证明BG<,2>基因已经整合到小麦染色体基因组中，转基因小麦与其 受体相比对白粉病的抗性明显提高。 5.期刊论文 毕瑞明.BI Rui-ming 负压处理对农杆菌介导小麦成熟胚转化效率的影响 -生物技术2008,18(1) 目的:提高小麦成熟胚遗传转化效率,为建立快速高效的小麦成熟胚遗传转化体系奠定基础.方法:以普通小麦HB341、SN2618、TS021和栽培二粒小麦 成熟种子为试材,采用整粒切胚诱愈的方法,通过农杆菌GV3101/pBI121::gus介导,研究负压处理对小麦成熟胚遗传转化的影响.结果:接种侵染过程中的负 压处理,对小麦成熟胚愈伤组织的诱导没有显著影响,但对小麦成熟胚的遗传转化却有显著性影响.负压处理10、20、30次,转化率分别较对照组提高了 9.37倍、10.90倍和10.03倍,最高转化率可达12.50%.同时负压处理能够提高小麦成熟胚转化效率,具有普遍意义.结论:该研究为快速高效小麦成熟胚转化 体系的建立提供了依据. 6.期刊论文 毕瑞明.王洪刚.Bi Ruiming.Wang Honggang 小麦成熟胚的组织培养 -中国农学通报2007,23(8) [研究目的]为了筛选出小麦(Triticum aestivum L.)成熟胚(MEs)培养和遗传转化受体材料的优良基因型,[方法]以27份优良普通小麦冬性主栽品种 或高代育种品系为试材,采用整粒切胚诱愈方法(endosperm-supported method),对小麦成熟胚进行组织培养研究.[结果]结果表明,在成熟胚培养过程中 光照、温度、培养基2,4-D浓度、基因型等因素对小麦成熟胚组织培养影响较大;同时小麦成熟胚组织培养存在着较强的基因型依赖性,不同基因型愈伤组 织诱导率、分化率、成苗率的差异具有统计学意义(P＜0.01).通过研究从27个小麦基因型中筛选出了3个适合于成熟胚整粒切胚诱愈的基因型,即山农 2618、泰山021、河北341,他们的成苗率分别达到了15.38%、25.27%、21.33%.[结论]小麦成熟胚组织培养优良基因型的筛选,为以后小麦的遗传转化和应 用基因工程技术进行遗传改良奠定了基础. 7.学位论文 沈向磊 小麦成熟胚脱分化的组织定位及细胞壁相关基因表达研究 2008 本研究以豫麦18为材料，从外部形态、细胞结构及基因表达等不同层面对小麦成熟胚脱分化进行了研究，以期揭示小麦成熟胚脱分化的组织定位和 分子机理。主要研究结果如下： 本文应用显微技术，观察了小麦成熟胚脱分化过程中细胞的形态变化，并对脱分化的起始部位进行初步定位。结 果表明，小麦成熟胚脱分化首先发生于胚根鞘细胞，这些细胞在2，4-D诱导条件下，培养6h启动脱分化，逐步回复变化为薄壁细胞，至24h便有愈伤组织 形成，培养72小时，小麦成熟胚已经脱分化形成体积较大的愈伤组织团，这些愈伤组织主要由胚根鞘细胞脱分化而来的薄壁细胞组成。其主要表现为 ，细胞间隙增大，体积逐渐变大，细胞中液泡明显，细胞核变大，被大液泡排挤到细胞边缘。经透射电镜观察表明，小麦成熟胚脱分化过程中细胞壁变 薄，细胞器种类增多，线粒体、内质网等细胞器数量增加，淀粉粒、脂体等物质密度减小至消失，随着原有物质的消失和新物质出现，细胞质重新组合 。 为研究小麦成熟胚脱分化分子机理，本研究利用.Affymetrix wheat GeneChipR 基因芯片技术在转录水平研究了细胞壁相关基因在小麦成熟胚 脱分化过程中的表达变化。以小麦成熟胚脱分化起始O点为对照，分别研究0、2、6、12、24和72h时这些基因的表达变化，将那些与0点比值大于2或小于 0.5，即表达变化两倍以上的基因视为有意义的基因，分析了这些发生有意义变化的细胞壁相关基因在小麦成熟胚脱分化中的表达情况。结果表明，在含 有61127个探针组，代表了55085个基因的小麦基因组表达谱上，发生有意义表达变化的基因共约有15000个。其中，有138个细胞壁相关基因在小麦成熟 胚细胞脱分化过程中至少在一个时间点中发生了有意变化，它们的表达产物按功能分为8类：分别是伸展蛋白、扩张蛋白、纤维素合成酶、纤维素酶、甘 露糖磷酸变位酶、半乳糖激酶、肉桂酰-CoA还原酶、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶。分析表明，伸展蛋白基因45个，扩张蛋白基因48个，它们大多表达 上调，推测这些基因对小麦成熟胚细胞脱分化过程中细胞壁的伸展起重要作用。其中，AY543542.1、CD490917、AY543544.1、BJ249762等扩张蛋白基因 在0-72h主要为上调，且在24h或72h时上调倍数为200以上℃A640232、CA604159、CA641446等伸展蛋白基因在24h或72h也达到最大值，上调倍数30以上。 细胞壁扩张蛋白和伸展蛋白基因在小麦成熟胚脱分化过程中的表达，与我们观察到的细胞壁变化是相对应的，也说明了细胞结构与功能的统一。与细胞 壁物质代谢相关的基因45个，包括纤维素合成酶基因13个，纤维素酶基因2个，甘露糖磷酸变位酶基因3个，半乳糖激酶基因8个，肉桂酰-CoA还原酶基因 16个，尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因3个。这些基因在小麦成熟胚培养的整个过程或某些时间点表现为上调表达，它们对小麦成熟胚细胞脱分化过程 中细胞壁物质的合成和分解起到重要作用。 8.期刊论文 丁莉萍.高莹.李圣纯.汪成.汪越胜.何光源.DING Li-Ping.GAO Ying.LI Sheng-Chun.WANG Cheng. WANG Yue-Sheng.HE Guang-Yuan 基因枪介导小麦成熟胚遗传转化的影响因素 -武汉植物学研究2007,25(3) 小麦成熟胚作为转化受体可克服小麦幼胚存在的受季节和幼胚发育阶段限制的缺点.以湖北省小麦品种‘鄂麦12'和模式品种‘Bobwhite'为材料,成 熟胚为转化受体,优化基因枪转化法的轰击压力、轰击距离、选择剂等因素,建立以小麦成熟胚为转化受体的高效转化系统.结果表明:小麦成熟胚作为转 化受体时,适宜轰击压力和轰击距离组合是900 psi、6 cm;成熟胚对选择剂G418的敏感性强于幼胚,轰击后需要延长恢复时间,选择剂G418的适合浓度为 20～40 mg/L.在以上优化条件下小麦成熟胚转化频率达0.3%～0.9%,已初步建立基因枪介导的小麦成熟胚遗传转化系统. 9.学位论文 岳润清 小麦成熟胚脱分化及其植株再生研究 2006 以豫麦18等八种不同基因型小麦成熟胚为外植体，研究了不同处理方式(胚乳支持和胚乳不支持)及不同2，4-D浓度(2mg/L和8mg/L)对小麦成熟胚愈 伤组织脱分化和分化的影响；为了研究小麦成熟胚脱分化和分化的生理特性，我们测定了与愈伤组织脱分化和分化有关的(质膜H+-ATPase及草酸盐氧化 酶)两种酶活性，并对其机理进行了分析。为了进一步对小麦成熟胚再生机理进行研究，通过NorthernBlot对PMH+-ATPase基因的表达水平进行了研究。 为了进一步研究PMH+-ATPase的重要作用，我们对小麦PMH+-ATPase基因进行了克隆，并通过生物信息学方法对PMH+-ATPase的结构进行了分析，包括对其 三维结果和功能的预测。旨在进一步研究小麦成熟胚脱分化和分化的效果，为小麦成熟胚高效再生体系机理的分析提供一定基础。结果表明： 1)胚乳不支持条件下，低浓度2，4-D下处理下愈伤组织的诱导率、出苗率分别为82.7％、19.1％;高浓度2，4-D下愈伤组织的诱导率、出苗率分别为 82.1％、11.2％；低浓度2，4-D处理有利于小麦成熟胚愈伤组织的脱分化和分化。胚乳支持处理方式的愈伤组织的诱导率较低(52.3％)，但出苗率很高 ，再生苗率达65.8％.说明胚乳支持的处理方式能高效诱导小麦成熟胚愈伤组织的植株再生。 2)不同处理方式的成熟胚愈伤组织诱导率与绿点率、 出苗率间呈一定的负相关，有的达到显著水平。说明出愈率高，但愈伤组织质量差，难以分化出再生苗，导致出苗率低。说明愈伤组织的质量是植株高 效再生的关键。 3)胚乳不支持方式下，低浓度2，4-D处理下愈伤组织的草酸盐氧化酶活性为2.501nmolH2O2/mg.min，高浓度2，4-D处理下愈伤组 织的草酸盐氧化酶活性为2.373nmolH2O2/mg.min，低浓度2，4-D处理有利于小麦成熟胚愈伤组织草酸盐氧化酶活性的增强；胚乳支持下的愈伤组织酶的 活性(2.830nmolH2O2/mg.min)明显高于胚乳不支持的，达到显著水平。因此我们可以认为：在小麦愈伤组织分化过程中，草酸盐氧化酶有利于胚性愈伤 组织形成。 4)在胚乳不支持方式下，低浓度2，4-D处理下愈伤组织H+-ATPase的活性高于高浓度2，4-D的处理；胚乳支持方式下，同浓度2，4-D处 理的愈伤组织酶的活性明显高于胚乳不支持的。且随着处理时间的延长，胚乳支持方式下H+-ATPase活性逐渐升高，72小时活性最高。结合胚乳支持下高 的出苗率，可以说明胚乳支持下生成的胚性愈伤组织比较多，再生能力强。因此我们认为：质膜H+-ATPase在小麦成熟胚愈伤组织植株的高效再生中起一 定的作用。 5)NorthernBlot研究表明：不同处理方式下小麦成熟胚愈伤组织质膜H+-ATPase基因mRNA表达水平存在差异，胚乳支持的处理方式增强 了质膜H+-ATPase基因在转录水平的表达；随着处理时间的延长，H+-ATPase基因mRNA的表达水平呈现增加，72小时表达量最多，随后又出现下降的趋势 。结合小麦愈伤组织质膜H+-ATPase活性，可以说明质膜H+-ATPase在小麦成熟胚愈伤组织脱分化和分化过程中起重要作用。 6)对克隆的PMH-- ATPase基因进行结构分析表明，基因全长5770bp，其含有15个外显子和14个内含子。对其推测的PMH+-ATPas生物信息学表明，该酶951个氨基酸组成，分 子量为104.6424KD。其一级结构预测表明，该酶亲水性区域有10个明显的跨膜区，大部分蛋白质伸展到细胞质内，且在膜内部分有许多β-折叠结构，只 有12.7％氨基酸残基在膜外。存在三个主要结构域：N-末端5-86区具有一个Cation_ATPase结构域，在98-319段是一个E1-E2-ATPase结构域，在323- 609处是一个hydrolase结构域，属于P型H+-ATPase。该酶有44个功能位点，说明H+-ATPase活性的调节复杂性。经同源性分析：该酶与玉米，番茄，棉花 ，蚕豆，拟南芥，马铃薯，水稻的H+-ATPase相似性分别达到90.2％，86.8％，84.4％，84.3％，83.1％，81.8％，71.1％，说明不同植物演化中 PMH+ATPase非常保守，暗示该酶在植物细胞生命活动中具有重要作用。 10.期刊论文 后猛.崔法.西廷业.王洪刚.KOU Meng.CUI Fa.XI Ting-ye.WANG Hong-gang 金属离子对小麦成熟胚愈 伤组织诱导及分化的影响 -华北农学报2008,23(z1) 为了建立小麦成熟胚的高频再生体系,以泰9817和泰山21为材料,研究了不同浓度金属离子(Cu2+和Ag+)对小麦成熟胚离体培养特性的影响.结果表明 ,在培养基中添加1 μmol/L CuSO4或10 μmol/L AgNO3有助于小麦成熟胚愈伤组织的诱导及分化,不同浓度CuSO4或AgNO3对小麦成熟胚愈伤组织出愈率的 影响不如对胚性愈伤率、分化率及出苗率的影响大;在最佳CuSO4浓度(1 μmol/L)下,泰9817和泰山21的胚性愈伤率、分化率及出苗率分别比对照(未加 CuSO4)提高了71.18%和87.37%、76.01%和88.92%、159.64%和323.79%;在最佳AgNO3浓度(10 μmol/L)下,泰9817和泰山21的胚性愈伤率、分化率及出苗率 分别比对照(未加AgNO3)提高了87.79%和99.35%、85.53%和93.88%、121.47%和275.21%.小麦成熟胚愈伤组织培养特性不同金属离子(Cu2+和Ag+)处理间差 异不显著. 引证文献(12条) 1.Ruiming BI.Honggang WANG Primary studies on tissue culture from mature embryos in diploid and tetraploid wheat[期刊论文]-中国高等学校学术文摘·农学 2008(3) 2.毕瑞明 农杆菌介导小麦成熟胚愈伤组织转化的主要因子优化[期刊论文]-生物技术 2008(02) 3.王廷璞.陈荃.崔爱明.刘瑞媛.马伟超 小麦愈伤组织诱导及其植株再生研究进展[期刊论文]-天水师范学院学报 2008(02) 4.王新国.任江萍 不同培养基及激素配比对小麦成熟胚离体培养的影响[期刊论文]-安徽农业科学 2008(06) 5.毕瑞明 负压处理对农杆菌介导小麦成熟胚转化效率的影响[期刊论文]-生物技术 2008(01) 6.陈四进.刘桂华.高飞.周敏.李春霞 小盐芥下胚轴再生体系的建立[期刊论文]-中国农学通报 2007(11) 7.毕瑞明.王洪刚 小麦成熟胚的组织培养[期刊论文]-中国农学通报 2007(08) 8.毕瑞明.王洪刚 二倍体、四倍体小麦成熟胚组织培养研究初报[期刊论文]-分子植物育种 2007(04) 9.周宜君.周生闯.刘玉.张根发 植物生长调节剂对植物愈伤组织的诱导与分化的影响[期刊论文]-中央民族大学学 报（自然科学版） 2007(01) 10.吕晓依.王竹林.奚亚军.任鹏.刘曙东 小麦遗传转化受体系统建立的研究[期刊论文]-西北植物学报 2007(05) 11.曹新有.李春莲.余玲.任慧莉.陈耀锋 小麦成熟胚愈伤组织诱导及分化研究[期刊论文]-西北植物学报 2006(11) 12.林德书.王艳丽.庄振宏.鲁国东.叶兴国.王宗华 小麦成熟胚再生体系及基因枪转化的初步研究[期刊论文]-福建 农林大学学报(自然科学版) 2005(02) 本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_scnydxxb200403001.aspx 下载时间：2010年3月27日