淀粉酶菌株的筛选和诱变育种

淀粉酶菌株的筛选和诱变育种[摘要]：本文章中我们利用实验菌株对于淀粉的特异性，用革兰氏碘液，利用平板法筛选出所需菌株和利用紫外线诱变育种，分别对要诱变的菌株进行不同时间的诱变，将在红光的照射下将结果稀释不同倍数，涂到平板上进行暗室培养，48小时后观察，用碘液测酶活力。[关键词]：淀粉酶；筛选；诱变育种前言:一般情况下，我们要获得目的菌株，一是从自然界中分离纯化，活力普遍较低，较省时省力，二是通过育种的方法，获得目的菌株，而通过人工选育的菌株，则更满足于工业化生产的需要，为我们提供了更好地选择。要获得所需的高产突变菌株，就要对菌株进行突变处理，突变分为自发突变和诱导突变。因自发突变的频率较低，所以采用诱导突变。所谓的诱变就是用物理或化学诱变剂处理均匀分散的细胞群，促使突变率大幅度提高。然后筛选出目的突变菌株，以供生产实践或科学实验用。诱变可由化学或物理因素引起，紫外线诱变是最简单、最常用的一种，因此我们选择采用这种方法。紫外线诱变处理的有效波长为200~300×10nm，最适为254nm(此为核酸的吸收高峰)。DNA和RNA的嘌呤和嘧啶吸收紫外光后，DNA分子形成嘧啶二聚体，即两个相邻的嘧啶共价连接，二聚体出现会减弱双键间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡.另外二聚体的形成，会妨碍双链的解开，因而影响DNA的复制和转录.总之紫外辐射可以引起碱基转换、颠换、移码突变或缺失，即是所谓的诱变。通过本篇文章，能够让我们进一步了解从自然界中分离淀粉酶菌株的具体的筛选过程与方法并且理解诱变育种的基本原理以及用诱变育种筛选高产目的菌种的基本方法。正文一、淀粉酶菌株的筛选菌种来源：校园土壤1.2培养基：淀粉培养基：蛋白胨10g，NaCl5g,可溶性淀粉2g,蒸馏水1000ml,琼脂16g左右，121℃高压灭菌锅灭菌20min,待冷却至50℃左右时，于超净工作台倒入摇瓶若干。器材：培养皿多个、1ml移液管1根、铲子1把、锥形瓶多个、高压灭菌锅、超净工作台、试管多支、摇床等。灭菌：将实验所用的培养基、培养皿、试管等进行高压灭菌。实验步骤：选定采土之后，铲去面土层2至3cm，去3至10cm深层土壤10g,装入灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，并进行，并且妥善保存。称取土壤10g左右，放入盛有90ml蒸馏水并且带有玻璃珠的锥形瓶中，振荡约20min左右，然后静置5min,然后使土样和蒸馏水充分混合。对其进行浓度梯度的稀释10-6左右。用一支1ml的移液管从中吸取土壤悬液加入含有淀粉培养基的无菌培养皿中，重复两次后，置37℃于培养箱中培养24小时左右。进行初步筛选，在培养出的培养皿中均匀喷洒革兰氏碘液，有明显的透明圈的菌落即为活性较高的淀粉酶菌株，该菌可以分解淀粉，可以产生淀粉酶。进行复筛选，通过点将法将可以产生淀粉酶的菌株接种到相同环境的无菌培养基中，重复操作进行培养。选择菌落周围透明圈和菌落直径之比值较大的菌落，进一步采用精确检测法鉴定，选出较优良的菌株2到3株，并且移植到斜面培养基培养。二、淀粉酶菌株的诱变育种方案.材料菌种大肠杆菌实验药品碘液、2%可溶性淀粉、标准糊精溶液、L乙酸、%生理盐水、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。实验仪器培养皿、锥形瓶、高压灭菌锅、磁力搅拌器、离心机、20w紫外线、超净工作台、培养皿、胶头滴管等实验仪器。方法培养基的配置淀粉培养基（可溶性淀粉20g,硝酸钾1g,磷酸氢二钾,氯化钠,硫酸镁,硫酸亚铁,琼脂20g,水1000毫升，调整pH值到～。）灭菌将实验所用的培养基、培养皿、试管等进行高压灭菌。悬液的制备取已培养20h的活化的枯草杆菌斜面一支，用10ml无菌生理盐水将菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的锥形瓶中强烈震荡10min，以打碎菌块，离心（3000r/min，15min）弃上清，将菌体用无菌生理盐水洗2次，最后制成菌悬液，用血球计数板在显微镜下调成浓度108个/ml。诱变（1）预热：正式照射前开启紫外灯预热10min。（2）搅拌：取制好的菌悬液4ml移入6cm的无菌培养皿中，放在无菌磁力搅拌器上，20w紫外灯下据紫外灯30cm处。（3）照射：打开皿盖，边搅拌边照射，时间为1min，2min，3min。注：所有操作均在红灯照射下进行。稀释涂平板在红灯下取未照射和照射的菌液各，进行不同浓度的稀释，取最后3个浓度的菌液（稀释为5、15、20、倍的菌液），涂到淀粉平板上，三个重复，每板加液，涂抹均匀，用黑纸包好37oC培养48h。2．3结果酶活力的测定取出平板，加入典液，观察抑菌圈的大小。诱变后抑菌圈变大，知酶活力增强，相反，如果诱变后抑菌圈变小，酶活力则下降。分析与讨论：1、接种操作时尽量避免外界细菌的掺入，使得最后培养结束的时候，培养基中最后获得了空气中掺入的杂菌，导致实验误差。2、在实验过程中，为了方便我们辨识与计数，因此我们应尽量采用稀释倍数较大的稀释液，稀释倍数过小，使得菌落过于集中，不易于我们分辨。3、在实验过程中由于操作，环境等因素导致实验数据部分丢失，计算不准，造成部分实验误差，影响最后实验结果，因此我们在实验中应尽量避免这些误差。4、紫外诱变后的菌株存在光复活现象，因此诱变及以后均应在红光下进行，而实验中由于环境问题而造成并不是完全黑暗和红光照射，注意诱变时间和操作也会不同程度的会造成误差。参考文献：[1]沈萍、陈向东主编、微生物实验学[M].第四版.高等教育出版社.[2]谷军主编、淀粉酶的生产与应用[J].生物技术.第三期：1-5.[3]袁勤生.应用酶学[M].上海:华东理工大学出版社,1994.[4]邬显章.酶的生产技术.吉林:吉林科技出版社,1988.360～365.[5]吴根福、杨志坚.发酵工程实验指导.北京：高等教育出版社，2006.[6]郭杰炎,蔡武城编著.微生物酶.北京:科学出版社,1986.75～77.