细胞因子及其受体-GAOBO

细胞因子及其受体高波2015-12-3gaobo@fudan.edu.cn 细胞因子(Cytokine,ck)是由多种细胞，特别是免疫细胞所产生、具有广泛生物学活性的小分子量蛋白（分子量约8～80kDa）。细胞因子概念细胞因子的分类按产生CK的细胞类型分类细胞因子的分类按产生CK的功能分类1.白细胞介素(interleukin,IL)2.集落刺激因子（colonystimulatingfactor,CSF).3.干扰素（interferon,IFN)4.肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor,TNF)5.趋化因子（chemokine)6.生长因子(growthfactor,GF)白细胞介素 白细胞介素，简称白介素，是指介导白细胞或其他细胞间相互作用的细胞因子。白细胞介素(interleukin,IL) 主要由单核／巨噬细胞、T淋巴细胞等所分泌； 介导并调节固有免疫、适应性免疫，在炎症反应中起重要作用。 目前已发现35种以上。重要的细胞因子介绍(IL-1,IL-2) 1972年Gery等发现人白细胞培养的上清中含有一种可溶性物质，这种物质可促进小鼠胸腺细胞对植物血凝素(PHA)的有丝分裂反应。起初命名为淋巴细胞激活因子(lymphocyte-activatingfactor,LAF)或内源性热原质(endogenouspyrogen)等，1979年国际统一命名为IL-1。白细胞介素(interleukin,IL)IL-1巨噬细胞IL-1诱导吞噬细胞活化引起炎症及发热白细胞介素(interleukin,IL)IL-1 1976年Morgan等，发现小鼠脾细胞培养上清中含有一种刺激胸腺细胞生长的因子，由于这种因子能促进和维持T细胞长期培养，称为T细胞生长因子（Tcellgrowthfactor,TCGF)，1979年统一命名为白细胞介素2（interleukin2,IL-2)。白细胞介素(interleukin,IL)IL-2白细胞介素(interleukin,IL)IL-2集落刺激因子 是一组在体内外均可选择性刺激造血祖细胞增殖、分化并在半固体培养基上形成细胞集落（colony）的细胞因子。集落刺激因子(Colonystimulatingfactor,CSF) 巨噬细胞-粒细胞集落刺激因子（GM-CSF） 巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF） 粒细胞集落刺激因子（G-CSF） 另外，红细胞生成素（EPO），干细胞生长因子（SCF）和血小板生成素（TPO）也视为CSF家族成员。集落刺激因子(Colonystimulatingfactor,CSF)干扰素 干扰素是一组具有干扰病毒感染和复制能力的细胞因子。主要包括I型(IFN,IFN等)和II型(IFN)干扰素(Interferon，IFN)I型干扰素：II型干扰素:CD8+T细胞、CD4+T细胞、NK细胞受病毒感染的细胞抗病毒作用免疫调节作用IFN-a的抗病毒作用病毒病毒复制诱导刺激胞核抑制病毒复制干扰素(Interferon，IFN)干扰素(Interferon，IFN)IFN-的生物学效应肿瘤坏死因子 此因子由于其在体内外均可直接杀伤肿瘤细胞而得名。肿瘤坏死因子(Tumornecrosisfactor，TNF) 肿瘤坏死因子是一类直接导致肿瘤发生出血坏死，并具有免疫调节活性的蛋白质。TNF-a157aa活化的T细胞分为:TNF-aTNF-b淋巴毒素(lymphotoxin-a,LT-a)TNF-b（LTa）171aa活化的巨噬细胞同源性28%相同的受体相同的生物学效应上调细胞因子产生水平（IL-2，IL-4，g-IFN，CSF），上调IL-2受体的达TNF-a诱导分化上调抗体产生细胞数量上调前列腺素产生水平，上调细胞因子产生水平（IL-1，IL-6，IL-8，GM-CSF）趋化并活化中性粒细胞体内刺激产生CSF上调造血功能肿瘤坏死因子(Tumornecrosisfactor，TNF)TNF-a的生物学效应生长因子 生长因子是一类可介导不同类型细胞生长和分化的细胞因子。根据其功能和作用的靶细胞不同，分别命名为：生长因子(Growthfactor，GF)1、转化生长因子ß（transforminggrowthfactor-ßTGF-ß）；2、神经生长因子(nervegrowthfactor,NGF);3、表皮生长因子(epithelialgrowthfactor,EGF);4、成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowthfactor,FGF);5、血小板生长因子（platelet-derivedgrowthfactor,PDGF）6、血管内皮细胞生长因子（vascularendothelialcellgrowthfactor,VEGF)趋化因子 趋化因子是一类对不同靶细胞具有趋化效应的细胞因子家族。该家族成员依据其分子氨基端半胱氨酸（Cys）的数目及其间隔，可分为不同的亚家族：趋化因子（Chemokine） α亚家族：Cys-X-Cys（X代表任意氨基酸残基），如IL-8趋化中性粒细胞； β亚家族：Cys-Cys，如单核细胞趋化蛋白，趋化单核细胞； γ亚家族：Cys，如淋巴细胞趋化蛋白，趋化淋巴细胞。 亚家族：Cys-X3-Cys，Fractalkine，可趋化单核细胞、NK细胞趋化因子的结构N端序列：与其受体结合C端a螺旋：传导信号趋化因子的结构自分泌autocrine内分泌endocrine旁分泌paracrine1、作用方式（actionmanners）：细胞因子作用的共同特点IL-42、多效性（Pleiotropy）：5.拮抗性（Antagonism）：3.重叠性（Redundancy）：4.协同性（synergy）：细胞因子的合成和分泌过程是一种自我调控的过程，正常条件下，细胞因子极少储存，适当刺激后迅速合成、迅速释放、迅速发挥作用、迅速降解。6、迅速（Rapidity）7、高效性（highpotency）极微量的细胞因子（pM,10-12M)就可发挥显著的生物学效应。细胞因子与其受体高亲和力结合，使细胞因子的生物学作用具有高效性。在体内pM水平即可显示明显的生物学效应。例如：1pg的干扰素能保护100万个细胞抵御1000万病毒颗粒的感染细胞因子以非特异性方式发挥作用，且不受MHC限制。8、非特异性（Non-specificity）细胞因子受体 细胞因子作用的发挥依赖于细胞表面的受体。细胞因子和相应受体结合可以传导细胞信号，使细胞活化、增殖。 细胞因子受体主要表达于细胞表面，但某些情况下，如强免疫原性物质刺激，许多种类的细胞因子受体可以从膜表面脱落，成为可溶性分子。可与膜型受体竞争，从而负向调节相应细胞因子的生物学作用。-S-S--S-S--S-S-CCCCC1C3C2C1C3C2C1C3C2C1C3C2G蛋白免疫球蛋白超家族受体I类细胞因子受体II类细胞因子受体TNF-R趋化因子受体IL-1M-CSFC-kitIL-2IL-3IL-4IL-5IL-6IL-7IL-9IL-11IL-12IL-13IL-15OSMGM-CSFG-CSFLIFCNTF生长激素催乳素IFN-aIFN-bIFN-gTNF-aTNF-bCD40神经生长因子（NGF）FASIL-8RANTESMIP-1PF4MCAFNAP-2 细胞因子受体根据其胞外结构及氨基酸序列的相似性分为5个家族。细胞因子受体细胞因子的主要生物学效应 介导天然免疫和炎症反应 介导和调节特异性免疫应答 决定免疫应答的类型 参与造血介导天然免疫和炎症反应 多种细胞因子参与天然免疫和炎症反应的启动及其效应。其中，IL-6、IL-1、IFN、TNF和趋化因子家族是启动抗菌性炎症反应的关键因子，被称为促炎因子。细胞因子的主要生物学效应介导天然免疫和炎症反应细胞因子的主要生物学效应介导天然免疫和炎症反应 IL-1、6活化淋巴细胞、NK细胞 TNF-a增加血管通透性 在炎症早期IL-6、IL-1、TNF还可促进肝脏产生急性期蛋白，增强机体抵御致病微生物的侵袭。肝脏TNF-a,IL-1,IL-6血清淀粉样蛋白C反应蛋白纤维蛋白原甘露聚糖结合凝集素细胞因子诱导急性期蛋白合成细胞因子的主要生物学效应介导天然免疫和炎症反应 干扰素可抑制病毒在体内复制并抗病毒感染； IL-14、IL-12等可分别促进NK细胞增殖及其胞毒作用； IFN-γ、TNF等可激活巨噬细胞，并促进其吞噬和杀伤作用。细胞因子的主要生物学效应介导天然免疫和炎症反应细胞因子在机体抗感染的天然免疫机制中发挥重要的作用。介导和调节特异性免疫应答 趋化因子可诱导不同免疫细胞的定向运动，并参与其激活等等。细胞因子的主要生物学效应介导和调节特异性免疫应答 在免疫应答的全过程，不同类型细胞因子在不同环节分别发挥重要作用。 IFN可诱导抗原递呈细胞表达MHC分子，促进抗原递呈； IL-2、IL-4、IL-5、IL-6等可促进T（B）细胞的增殖、分化；决定免疫应答的类型 近年来发现同一类免疫细胞可按其分泌的细胞因子而分为不同亚群，其意义在于机体免疫应答类型在相当程度上取决于免疫细胞产生的细胞因子谱。细胞因子的主要生物学效应决定免疫应答的类型 Th1细胞产生IL-2、IFN-γ、TNF-β等参与细胞介导的炎症反应；细胞因子的主要生物学效应决定免疫应答的类型 Th2细胞主要产生IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13等主要介导体液免疫应答和I型超敏反应。参与造血细胞因子的主要生物学效应参与造血细胞因子与临床细胞因子与疾病的发生 细菌内毒素性休克：TNF-α、IL-1等细胞因子过度表达 免疫缺陷病：细胞因子及其受体的缺陷，如IL-2或IL-2受体缺陷或突变可导致重症联合免疫缺陷病 自身免疫病：IFN-γ可诱导某些自身组织细胞表达MHC-II类抗原，从而使这些细胞将自身抗原递呈给自身反应性T细胞，导致自身免疫性疾病 超敏反应：IL-4、IL-5可正向调控IgE的合成，从而在I型超敏反应的发生密切相关 细胞因子补充和添加疗法:通过各种途径使患者体内细胞因子水平增加，充分发挥细胞因子的生物学作用，从而抗御和治疗疾病。细胞因子与临床细胞因子与治疗 细胞因子阻断和拮抗疗法：其基本原理是抑制细胞因子的产生和阻断细胞因子与其相应受体的结合及受体后信号传导过程，使细胞因子的病理性作用难以发挥。感染性休克等的治疗。例如抗TNF单克隆抗体可以减轻甚至阻断感染性休克的发生，IL-1受体拮抗剂对于炎症、自身免疫性疾病等具有较好的治疗效果。该疗法适用于自身免疫性病、移植排序反应.细胞因子与临床细胞因子与治疗可溶性细胞因子受体作为拮抗剂effectsNC53DNAProtein细胞因子受体的克隆53DNAPCR可溶性细胞因子受体细胞因子受体的突变Receptorblocker(asareceptorantagonist)已批准上市的细胞因子基因工程药物 体内效果远不如在体外理想体内应用毒性反应相当严重细胞因子的半衰期过短（以分钟计）细胞因子与临床细胞因子临床治疗中存在的问题*细胞因子的局部应用诱导机体持续产生内源性细胞因子细胞因子导向疗法改进细胞因子在体内的应用方案联合应用优于单独用细胞因子基因疗法细胞因子与临床细胞因子疗法，需加以改进*新细胞因子的基因克隆化从人类基因组发现新细胞因子后基因组时代的“捞鱼”(1).传统的细胞因子克隆化策略 活性筛选 发现免疫分子的活性线索 免疫分子表达细胞 提取mRNA 逆转录成为cDNA 克隆化至真核表达载体 转化宿主细胞 免疫分子活性筛选 鉴定例1：IL-3的发现（Cell1986，47：3，）猴T细胞系UCD-144MLACML细胞刺激增殖提取mRNA构建的cDNA表达文库含30000个克隆提取质粒DNA分成100份，每份200个克隆分别转染COS-7细胞测定上清刺激活性8份具有活性抗GM-CSF抗体抑制实验只有1份不被抑制进一步有限稀释法筛选获得猴IL-3cDNA杂交筛选人的基因文库获得人IL-3序列cDNAlibraries 根据N端序列筛选发现免疫分子的活性线索免疫分子表达细胞大批量提取活性蛋白N端氨基酸序列推断核苷酸序列合成寡核苷酸探针或引物RT-PCR或杂交筛选免疫分子cDNA文库鉴定例：IL-15（Science1994，264：965）猴肾上皮细胞系CV-1/EBNA培养上清刺激不被IL-2抗体所抑制纯化测定N端33个氨基酸序列合成引物推测两端DNA序列NC5’3’扩增92bpcDNA做为探针筛选原始文库获猴IL-15阳性克隆筛选人cDNA文库获得人IL-15（PCR）从人类基因组发现新细胞因子 由于体内含量较高的免疫分子大部分已被克隆化，传统的路线已经难以发现新免疫分子。目前的新免疫分子克隆化策略主要利用反向生物学原理，从人类基因组发现新免疫分子编码基因。 免疫细胞cDNA的大规模测序免疫细胞cDNA文库大规模随机测序基因和蛋白数据库同源性比较与已知免疫分子有同源性的克隆全长cDNA克隆化真核原核表达活性筛选鉴定例1：MPIF（MyeloidProgenitorInhibitoryFactor-1）（J.Exp.Med.1997,185:1163）：从动脉内皮细胞cDNA文库大规模随机测序，发现其中之一编码氨基酸与MIP-1有51%同源性，昆虫细胞表达蛋白具有趋化T细胞和单核巨噬细胞的活性，抑制骨髓细胞集落形成活性。 染色体中免疫分子聚集区的大规模测序17对染色体存在CC趋化因子Cluster，通过适当的YAC克隆测序和生物信息学分析，克隆了MIP-4，与MIP-1有49.5%的同源性，趋化T细胞（Genomics1999Mar15;56(3):296-302）细胞因子和受体相互关系的研究利用酵母双杂交系统研究蛋白与蛋白相互关系酵母ABC酵母双杂交系统的建立基于“真核生物调控转录起始”。酵母双杂交系统的建立与发展酵母双杂交系统的建立基于“真核生物调控转录起始”。酵母转录子Gal4分子由一条多肽链组成，含有881个氨基酸。它有两个结构域：1、DNA结合结构域（DNAbindingdomain,DB）由位于N-末端1~147个氨基酸构成，能识别位于Gal1基因的上游激活序列（UAS,upstreamactivatingsequence）,此外，在其N-端还具有一段核定位序列；2、转录激活结构域（activationdomain,AD）由位于C-末端的768~881位氨基酸构成。当Gal4的两个结构域位于不同肽链上，只要它们在空间上充分接近，则能够恢复Gal4作为转录因子的活性.酵母转录子Gal4分子激活转录DB激活转录不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。DB酵母细胞的Ga14蛋白的DBAD大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42融合结合到Gal4结合位点激活转录Fields等人的工作标志双杂交系统的正式建立他们以与调控SUC2基因有关的两个蛋白质Snf1和Snf2为模型，将前者与Ga14的DB结构域融合，另一个与Gal4的AD结构域的酸性区域结合。（形成融合蛋白）Snf1Snf2Gal4的DBGal4的AD诱饵(bait)猎物或靶蛋白(preyortargetprotein)如果Snf1和Snf2之间存在相互作用，那么分别位于这两个融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子，从而激活相应基因的转录与表达。这个被激活的、能显示“诱饵”和“猎物”相互作用的基因称为报道基因（reportergene）XYGal4的DBGal4的AD诱饵(bait)猎物(prey)报道基因表达报道基因的基因产物通过对报道基因表达产物的检测，反过来可判别作为“诱饵”和“猎物”的两个蛋白之间是否可存在相互作用。Gal4蛋白调控的GAL1序列-半乳糖苷酶的LacZField改造LacZ基因，将其整合到酵母菌染色体URA3位上URA3URA3酵母菌的GaL4基因和GaL80基因（Gal80是Gal4的负调控基因）被缺失报道基因表达融合蛋白的载体URA3转化酵母菌URA3表达-半乳糖苷酶已知Gal4的DB融合蛋白GENEDBXY猎物诱饵由X和Y相互作用使得AD和BD在空间上接近，激活了报告基因LacZ的转录。一般地，将DB-X的融合蛋白称作诱饵（bait），X往往是已知蛋白；AD-Y称作猎物（prey），Y称作猎物；整个实验过程称作“狩猎”（hunt或fish）。KGal4的DB融合蛋白表达融合蛋白的载体URA3转化酵母菌URA3同时转化了细胞因子（已知）和细胞因子的受体（未知）融合表达载体的酵母细胞才有-半乳糖苷酶的活性，单独转化其中任何一个载体都不能检测出-半乳糖苷酶的活性。表达-半乳糖苷酶ThecloneandexpressionofHumanIL-8DNAhttp://www.ncbi.nih.gov/IL-8以二聚体形式存在.IL-8分子的第1个片层有一个疏水性区域,2个IK-8分子单体即通过各自片层的疏水性作用形成二聚体NH2NH2HOOCCOOHGeneprimaryelements41..340**